張睿，崔雨婷，陳正禮*，羅啟慧，祝春梅，孫鳳嬌，陳夢(mèng)鹿

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物疾病模型研究室，四川 雅安 625014;2.成都大學(xué)新藥評(píng)價(jià)研究所，成都 610051;3.四川普萊美生物科技集團(tuán)有限公司，四川 雅安 625014)

乳腺腫瘤是全球女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈明顯上升趨勢(shì)［1］。其防治越來(lái)越受到重視，乳腺腫瘤動(dòng)物模型的制作對(duì)進(jìn)一步研究乳腺腫瘤的病因、發(fā)病機(jī)理，從而對(duì)其進(jìn)行有效預(yù)防、提高治療效果將起到非常關(guān)鍵的作用［2］。目前乳腺癌動(dòng)物模型主要有自發(fā)性、誘發(fā)性、移植性這三類(lèi)，相比較而言自發(fā)性乳腺腫瘤發(fā)生的條件比較自然，與人類(lèi)患病過(guò)程更為相似，有利于觀(guān)察腫瘤發(fā)生發(fā)展的影響因素。近年來(lái)的許多研究顯示腫瘤的發(fā)生與細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)，凋亡是腫瘤的一種普遍自發(fā)現(xiàn)象［3］。線(xiàn)粒體凋亡通路為最經(jīng)典的一條凋亡通路［4］，目前多數(shù)研究?jī)H涉及2～3個(gè)線(xiàn)粒體凋亡通路相關(guān)因子在乳腺腫瘤中的表達(dá)，凋亡通路的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫組織化學(xué)和實(shí)時(shí)熒光定量法，檢測(cè)線(xiàn)粒體凋亡通路五個(gè)關(guān)鍵因子 AIF、Cyt C、APAF－1、caspase－3、XIAP在正常乳腺組織和良性腫瘤、惡性腫瘤中蛋白和mRNA的表達(dá)情況，以多個(gè)因子綜合表達(dá)情況來(lái)評(píng)價(jià)乳腺腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后將會(huì)更有意義，同時(shí)可以為靶向治療、新藥研發(fā)等方面提供指導(dǎo)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)3～4周齡SD大鼠(♀∶♂=1∶1)共140只，來(lái)源于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司【SCXK(滬)2007－0005】。實(shí)驗(yàn)操作在雅安普萊美生物科技有限公司【SYXK(川)2014－186】。環(huán)境參數(shù):溫度:20～25℃，相對(duì)濕度:40% ～70%，換氣次數(shù):10～15次/小時(shí)，照明時(shí)間:每日12 h/12 h交替照明。經(jīng)檢疫馴化剔除可能影響實(shí)驗(yàn)的大鼠，實(shí)際130只，實(shí)驗(yàn)期間按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用原則給予人道的關(guān)懷。

1.1.2 主要試劑和儀器

石蠟組織切片機(jī);電子天平;日本奧林巴斯光學(xué)生物顯微鏡;數(shù)顯恒溫?cái)嚢柩h(huán)水箱;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱;超凈工作臺(tái);高速冷凍離心機(jī);Mini－SUB凝膠電泳裝置;實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀;GelDoc 2000凝膠成像分析系統(tǒng)，多聚甲醛固定液，二甲苯、乙醇;蘇木素;中性樹(shù)膠;光學(xué)顯微鏡，恒溫箱，磷酸鹽緩沖液(PBS)、檸檬酸鈉緩沖液、多聚賴(lài)氨酸、鏈霉親和素－生物素復(fù)合物(SABC)試劑盒，Total RNA extractor(Trizol)試劑盒，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RT reagent kit with gDNA eraser)，熒光定量PCR試劑盒(SYBR Premix Ex Taq)等。

1.2 方法

1.2.1 大鼠自發(fā)性乳腺腫瘤篩查

實(shí)驗(yàn)周期為60周。大鼠飼養(yǎng)在SPF屏障環(huán)境。13周開(kāi)始，每周全身觸診，記錄肉眼可見(jiàn)或能觸摸搭配的腫瘤出現(xiàn)時(shí)間、部位、大小、硬度、發(fā)展情況。觀(guān)察期間死亡的大鼠均及時(shí)登記，60周后麻醉后處死，剖檢前禁食過(guò)夜，自由飲水，其后腹腔注射2%戊巴比妥進(jìn)行麻醉(麻醉劑量為40～60 mg/kg)。解剖，摘除瘤體，觀(guān)察腫塊質(zhì)地外觀(guān)，拍照記錄，取少量保存于液氮用于RT－PCR檢測(cè)，其余用4%甲醛固定。

1.2.2 組織病理學(xué)

常規(guī)石蠟包埋、切片5 μm，蘇木精伊紅(HE)染色后于光鏡下檢查。所有乳腺腫瘤均經(jīng)3位病理學(xué)專(zhuān)家進(jìn)行病理學(xué)診斷，按照2012年由多個(gè)國(guó)家毒性病理學(xué)會(huì)聯(lián)合發(fā)布的大鼠乳腺腫瘤分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類(lèi)［5］。

1.2.3 免疫組織化學(xué)

多聚賴(lài)氨酸處理載玻片防止脫片，切片厚度5 μm，經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水后用體積分?jǐn)?shù)為3%的H2O2封閉20 min，微波法修復(fù)抗原，體積分?jǐn)?shù)為5%的BSA封閉液37℃封閉40 min，滴加一抗，4℃過(guò)夜，滴加二抗，37℃孵育40 min，滴加鏈親和素－過(guò)氧化物酶SABC溶液，37℃孵育20 min。以上每次孵育完成后(5%BSA后除外)均以0.01 mol/L PBS(pH 7.4)漂洗3次，每次5 min。孵育后入DAB藍(lán)色顯色液顯色，時(shí)間不超過(guò)30 min，期間在鏡下觀(guān)察，掌握顯色時(shí)間，蒸餾水終止顯色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.2.4 RNA提取

乳腺腫瘤組織經(jīng)液氮研磨后，參照說(shuō)明書(shū)使用RNA提取試劑盒(total RNA extractor，Sangon)提取總RNA，貯存于－80℃直至使用。1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

提取的RNA使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Prime script RT kit，TaKaRa)反轉(zhuǎn)錄成cDNA并儲(chǔ)存于－20℃。根據(jù)定量PCR采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Bio－Rad CFX96)序列檢測(cè)系統(tǒng)來(lái)進(jìn)行。在含有熒光染料(SYBR green II)、Mix、cDNA以及上下游引物的25 μL總反應(yīng)體系中，進(jìn)行如下擴(kuò)增:95℃預(yù)變性3 min;95℃變性10 s;退火溫度見(jiàn)表1均為30 s;72℃延伸10 s，變性，退火，延伸共40個(gè)循環(huán)，最后72℃下延伸10 min。引物序列及相關(guān)參數(shù)見(jiàn)表1。PCR產(chǎn)物特異性通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，基因表達(dá)量通過(guò)測(cè)定熒光信號(hào)來(lái)確定。

表1 時(shí)熒光定量PCR的引物序列Tab.1 Sequences of the real－time fluorescence quantitative PCR primers

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析

免疫組化每個(gè)組織每個(gè)因子選取3張切片，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，在光鏡200倍視野下測(cè)量陽(yáng)性細(xì)胞積分光密度值，取其平均值作為每個(gè)組織因子的最終數(shù)據(jù)。RT－PCR結(jié)果用法計(jì)算相對(duì)含量，并用來(lái)表示。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(X±SD)表示，采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行方差分析(ANOVA)和相關(guān)性雙變量統(tǒng)計(jì)分析免疫組化和RT－PCR的值，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 自發(fā)性乳腺腫瘤發(fā)生情況

130只SD大鼠中有14只檢出自發(fā)性乳腺腫瘤，雄性未發(fā)生，腫瘤發(fā)生率為10.77%，其中乳腺纖維瘤7只，7只發(fā)生乳腺癌(3例乳腺腺癌，2例乳腺乳頭狀癌，2例浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌)。乳腺腫瘤多發(fā)生于胸部，腹股溝及尿道口的乳腺處。腫塊形態(tài)多呈分頁(yè)狀，也有球形，直徑1～7 cm不等。HE染色顯示乳腺纖維瘤有明顯的增生的間質(zhì)結(jié)締組織成分，富含粘多糖，圍繞著小管，少量透明樣變(圖1A)。乳腺腺癌腫瘤細(xì)胞主要以管狀模式排列，小管內(nèi)壁增厚1到2倍，細(xì)胞核染色深淺不一，細(xì)胞核明顯大小不均(圖1B)。乳腺乳頭狀癌以多層的惡性上皮細(xì)胞群為特點(diǎn)，高核質(zhì)比，有絲分裂數(shù)量增加，纖維結(jié)締組織和肌上皮細(xì)胞支持乳頭狀突起(圖1C)。浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌腫瘤細(xì)胞在管腔內(nèi)壁生長(zhǎng)并其向管周?chē)幕|(zhì)侵襲，細(xì)胞多形性增加，核質(zhì)比增高，細(xì)胞核大小不均明顯(圖1D)。

2.2 免疫組化結(jié)果

乳腺組織經(jīng)SABC藍(lán)色顯色法顯示各因子陽(yáng)性物質(zhì)呈藍(lán)紫色(圖2)所示。各組形態(tài)學(xué)圖像分析軟件分析后結(jié)果如表2所示，正常乳腺組織(I組)與良性乳腺腫瘤組織(II組)相比，AIF、APAF－1、caspase－3 蛋白表達(dá)明顯減弱(P ＜0.01)，Cyt c、XIAP蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)(P＜0.01);II組與惡性乳腺腫瘤組織(III組)相比，AIF、Cyt c、caspase－3 蛋白表達(dá)明顯減弱(P ＜0.01)，APAF－1、XIAP 蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)(P＜0.01);I組與 III組比較，AIF、Cyt c、APAF－1、caspase－3 蛋 白 表 達(dá) 均 明 顯 減 弱 (P ＜0.01)，只有XIAP蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)(P＜0.01)。

注:A.乳腺纖維腺瘤;B.乳腺腺癌;C.乳腺乳頭狀癌;D.乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌。圖1 SD大鼠自發(fā)性乳腺腫瘤HE染色Note.A.Fibroadenoma;B.Adenocarcinoma;C.Papillary carcinoma;D.Infiltrating ductal carcinoma.Fig.1 Histological appearance of spontaneous mammary neoplasms in the SD rats.HE staining.

表2 AIF、Cyt c、APAF－1、Caspase－3、XIAP在SD大鼠乳腺各組中的表達(dá)()Tab.2 Expression of AIF，CYT C，APAF－1，caspase－3，and XIAP in the normal，benign and malignant tumor groups

表2 AIF、Cyt c、APAF－1、Caspase－3、XIAP在SD大鼠乳腺各組中的表達(dá)()Tab.2 Expression of AIF，CYT C，APAF－1，caspase－3，and XIAP in the normal，benign and malignant tumor groups

注:*表示與正常組相比差異有顯著性(P＜0.05)。Note:*Difference is significant(P＜0.05)in comparison with the normal group.

組別Grous AIF Cyt C Apaf－1 Caspase－3 XIAP正常組(n=5)Normal group 12.74±0.83 2.34±0.33 9.87±1.91 6.60±0.04 3.75±0.68良性腫瘤(n=7)Benign tumor group 4.18±0.65* 6.63±0.79* 2.71±0.98* 4.43±0.10* 8.52±1.47*惡性腫瘤(n=7)Malignancy group 3.06±0.72* 1.64±0.19* 5.16±0.91* 3.03±0.11* 15.21±1.4*

2.3 mRNA相對(duì)表達(dá)結(jié)果

熒光定量PCR檢測(cè)各因子在I、II、III組中相對(duì)表達(dá)量如圖 3 所示，與 I組相比，AIF、APAF－1、CASPASE－3在II、III組中的表達(dá)均呈逐漸降低趨勢(shì)，差異有顯著性(P＜0.01);XIAP在II組中相對(duì)表達(dá)量為(1.28±0.14)，表達(dá)明顯升高(P＜0.05)，在III組中相對(duì)量為(2.21±0.39)，表達(dá)極顯著升高(P＜0.01)。相對(duì)于I組，CYT C在II組表達(dá)增加29%，但在III組中減少了54%，差異有顯著性(P ＜0.01)。

免疫組化結(jié)果通過(guò)RT－PCR得到證實(shí)(表3)，對(duì)目的基因的mRNA的表達(dá)量與蛋白的表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)APAF－1的mRNA表達(dá)與蛋白表達(dá)顯著相關(guān)(P＜0.05)，其余因子mRNA相對(duì)表達(dá)與蛋白表達(dá)呈相關(guān)一致性，極顯著相關(guān)(P＜0.01)。

注:Ⅰ:正常組織;Ⅱ:良性腫瘤;Ⅲ:惡性腫瘤。圖2 目的基因在不同組中SABC免疫組化染色Note:Ⅰ:Normal group;Ⅱ:Benign tumor group;Ⅲ:Malignant tumor group.A:AIF;B:Cyt C;C:APAF－1;D:Caspase－3;E:XIAPFig.2 Target genes in different groups.Immunohistochemical SABC staining

表3 目的基因mRNA表達(dá)量與蛋白表達(dá)量相關(guān)性Tab.3 Relationship between the target genes mRNA and protein levels

注:*表示與正常組相比差異表達(dá)有顯著性(P＜0.05)。圖 3 I、II、III組中 AIF、Cyt c、APAF－1、CASPASE－3、XIAP的相對(duì)定量Note.*Difference is significant(P ＜ 0.05)in comparison with the normal group.Fig.3 The relative quantity of AIF，Cyt c，APAF－1，caspase－3 and XIAP in the 3 groups

3 討論

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自發(fā)性腫瘤在國(guó)外研究相對(duì)成熟，國(guó)內(nèi)對(duì)SPF級(jí)的SD大鼠自發(fā)性乳腺腫瘤的報(bào)道也比較少。趙磊等［6］的研究中顯示10～16月齡的200只SD大鼠(♀∶♂=3∶1)的自發(fā)性乳腺腫瘤的發(fā)病率為10.5%，馬超亞等［7］的研究中則顯示24月齡的400只雌性SD大鼠自發(fā)性腫瘤的發(fā)生率可達(dá)到46.5%。本實(shí)驗(yàn)選取的為130只SD大鼠(♀∶♂=1∶1)，解剖時(shí)為63周齡，腫瘤發(fā)病率為10.77%，另有文獻(xiàn)中的報(bào)道，隨著大鼠周齡的增加，雌性大鼠內(nèi)分泌功能逐漸紊亂，雌激素水平增高，導(dǎo)致乳腺腫瘤的發(fā)生［5］。本研究看出乳腺腫瘤普遍雌性發(fā)病率較高，雄性發(fā)病率極少，與人類(lèi)乳腺腫瘤發(fā)病特點(diǎn)相似，隨著年齡的增長(zhǎng)，乳腺腫瘤發(fā)病率不斷升高，提示年齡及雌激素確實(shí)對(duì)乳腺腫瘤的發(fā)生起到促進(jìn)作用。

凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis－inducing factor，AIF)是近來(lái)被發(fā)現(xiàn)的一種位于線(xiàn)粒體內(nèi)的黃素蛋白，它定位于線(xiàn)粒體雙層膜間區(qū)［8］。AIF可通過(guò)線(xiàn)粒體外膜轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞核，引起染色質(zhì)凝縮和DNA的大規(guī)模斷片化［8－10］從而引起細(xì)胞凋亡。相關(guān)研究顯示，AIF在不同的腫瘤組織中表達(dá)不盡相同，丁靜麗等［11］發(fā)現(xiàn)AIF在肝癌組織中的表達(dá)相對(duì)于正常肝組織顯著降低，而Urbano等［12］在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn) AIF在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)遠(yuǎn)高于正常組織。而本文中AIF在乳腺腫瘤中的表達(dá)明顯弱于正常乳腺組織(P＜0.01)，并且隨著腫瘤分化程度降低而降低，提示乳腺腫瘤發(fā)生后，凋亡受到抑制，AIF作為促凋亡因子，其表達(dá)逐步受到抑制，提示腫瘤逐漸惡化。AIF不僅一種DNA內(nèi)切酶，還是一種氧化還原酶，從前人及本文中可以看出，它在不同組織及不同腫瘤中表達(dá)變化存在差異，仍需進(jìn)一步研究其具體機(jī)制。

細(xì)胞色素C的釋放是線(xiàn)粒體凋亡途徑中的主要步驟［13－15］。當(dāng)細(xì)胞受到凋亡信號(hào)刺激時(shí)，細(xì)胞色素C可以從線(xiàn)粒體釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，啟動(dòng)胱解酶活化［16］。陳振棟等［17］研究顯示 Cyt c在乳腺癌組織中表達(dá)顯著高于正常組織。而在本實(shí)驗(yàn)中，在良性腫瘤組織中，與正常組相比細(xì)胞色素C的表達(dá)顯著增加了(P＜0.01)，而在惡性腫瘤組織中，其比正常組的表達(dá)顯著降低(P＜0.01)。這可能是由于在乳腺腫瘤剛發(fā)生時(shí)，細(xì)胞異常增殖分化的同時(shí)，機(jī)體的抗腫瘤免疫系統(tǒng)也在增強(qiáng)，抑癌基因的表達(dá)產(chǎn)物可增加細(xì)胞色素C的含量，促進(jìn)其釋放入胞漿激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，以增加細(xì)胞凋亡;而到惡性腫瘤時(shí)可能由于細(xì)胞異型性大，細(xì)胞器發(fā)育不良，線(xiàn)粒體儲(chǔ)存和釋放細(xì)胞色素C功能障礙，凋亡受到抑制，腫瘤惡化。

細(xì)胞色素C釋放后第一步即與凋亡蛋白酶激活因子(APAF－1)結(jié)合。APAF－1與細(xì)胞色素C結(jié)合的復(fù)合物與ATP/dATP的結(jié)合激發(fā)其多聚化進(jìn)而形成凋亡體(apoptosome)［18］，活化 caspase 家族，誘導(dǎo)凋亡發(fā)生。王海燕等［19］研究顯示 APAF－1在鼻內(nèi)翻乳頭狀瘤中表達(dá)顯著低于正常組織。但目前，乳腺腫瘤中未見(jiàn)APAF－1的相關(guān)研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)通過(guò)RT－PCR檢測(cè)APAF－1基因的mRNA在乳腺腫瘤中的表達(dá)明顯低于正常乳腺組織，惡性腫瘤中表達(dá)進(jìn)一步下調(diào)，但在免疫組化中蛋白表達(dá)在腫瘤組織明顯低于正常乳腺組織，但在惡性腫瘤組織中表達(dá)要明顯高于良性腫瘤組織;即在良性腫瘤組織中mRNA的表達(dá)升高了，但蛋白的表達(dá)降低，這可能是由于蛋白的表達(dá)滯后于mRNA，也可能是是腫瘤細(xì)胞中 APAF－1作為促凋亡蛋白受到抑制，而mRNA對(duì)抑制產(chǎn)生了反饋所以有所上調(diào)。

半胱天冬酶－3(caspase－3)屬于半胱氨酸基天冬氨酸基－特異性蛋白酶，是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的一類(lèi)蛋白水解酶。而凋亡蛋白抑制劑(IAP)可以抑制線(xiàn)粒體活化，它能直接結(jié)合、抑制效應(yīng) caspase－3的作用，IAP是唯一內(nèi)源性caspase抑制物，而XIAP(X chromosome－linked inhibitor of apoptosis)是IAP 家族蛋白中對(duì)胱氨酸天冬蛋白酶最有效的抑制劑［21，22］。劉聰?shù)龋?3］研究發(fā)現(xiàn)caspase－3在乳腺纖維瘤中的表達(dá)顯著高于乳腺癌。Yang等［24］研究表明，XIAP在乳腺癌細(xì)胞系呈高表達(dá)，而在正常乳腺上皮細(xì)胞系低表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)免疫組化和熒光定量的檢測(cè)結(jié)果一致顯示在正常乳腺組織，良性腫瘤，惡性腫瘤中，Caspase－3的表達(dá)逐步降低，而XIAP的表達(dá)逐步升高，與前人研究一致，提示二者有拮抗關(guān)系，XIAP高表達(dá)和caspase－3低表達(dá)可能為乳腺癌預(yù)后不良的指標(biāo)。

乳腺腫瘤嚴(yán)重影響患者的身心健康及正常生活，乳房切除術(shù)和化療成為乳腺治療的主要方法。雖然在乳腺治療方面已經(jīng)取得了很大的進(jìn)步，仍舊有約70%的病人由于腫瘤細(xì)胞的迅速增殖和骨轉(zhuǎn)移而無(wú)法手術(shù)［25］。因此迫切需要尋找對(duì)抗乳腺腫瘤的新方法。腫瘤以細(xì)胞快速無(wú)限增殖為特點(diǎn)，即打破了細(xì)胞死亡和細(xì)胞增值的平衡，細(xì)胞凋亡受到一定抑制。從本文結(jié)果可看出 AIF、Cyt C、APAF－1、caspase－3、XIAP作為線(xiàn)粒體凋亡通路相關(guān)因子在正常組、良性腫瘤、惡性腫瘤組間表達(dá)有明顯差異(P＜0.01)，提示線(xiàn)粒體凋亡通路參與乳腺腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，因此可綜合多因子的表達(dá)情況來(lái)預(yù)測(cè)乳腺腫瘤的發(fā)生及判斷乳腺腫瘤的發(fā)展。同時(shí)根據(jù)各因子的表達(dá)趨勢(shì)，可以考慮使用運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)上調(diào)AIF、CYT C、APAF－1、caspase－3，下調(diào) XIAP，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，達(dá)到輔助治療的效果，以此為契機(jī)，為腫瘤新藥研發(fā)、靶向治療提供依據(jù)與指導(dǎo)。

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