于秀菊，高淑媛，程笳琪，趙兵令，赫曉燕，董常生

(山西農業(yè)大學動物科技學院，山西 太谷 030801)

肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)是一種多肽類生長因子，由α重鏈和β輕鏈組成。其受體是由原癌基因編碼的具有酪氨酸集激酶活性的蛋白 c－met［1］。大量研究表明，HGF/c－met在哺乳動物間充質－上皮互作的多種組織中起調控細胞增殖、遷移、分化和存活的作用［2，3］。毛囊具有周期性的生長特性，根據(jù)其毛囊各組分在形態(tài)上的變化，將其分為毛發(fā)生長期、退化期和休止期［4，5］。真皮乳頭(由間充質衍生)的成纖維細胞與表皮角質細胞之間的相互作用在毛囊周期性生長過程中發(fā)揮重要的作用［6］。

體外實驗證明HGF/c－met對毛囊生長具有促進的作用。Shimaoka等［7］在體外培養(yǎng)的人毛囊中添加一定濃度的HGF后，發(fā)現(xiàn)毛囊的長度增長，DNA合成能力增強，證明HGF能夠刺激毛囊的生長;過表達HGF的轉基因小鼠呈現(xiàn)毛囊發(fā)育提前，退化期顯著推遲，皮膚組織中的毛囊數(shù)量顯著增加的現(xiàn)象［8］。但是，內源性的 HGF/c－met信號是否參與毛囊的周期性變化還不清楚。本實驗運用免疫組織化學技術，對HGF及其受體c－met在ICR小鼠毛囊的生長期、退化期和休止期進行組織定位，證明HGF/c－met在毛發(fā)生長過程發(fā)揮著重要的作用，為HGF/c－met的應用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級ICR小鼠雌、雄各10只，體重18～22 g，2月齡。均購于北京華阜康生物科技股份有限公司【SCXK(京)2009－0004】。交配受孕后將雌鼠單獨飼養(yǎng)直至生產，選定同一天出生的三窩ICR小鼠，在出生后的第15天和17天，第19天和20天、第25天和26天，每窩各取一只小鼠，處死后取其背部皮膚，固定于Bouin氏液中，24 h后更換為70%酒精，通過梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟后包埋，切成5 μm厚的切片，用于免疫組織化學研究。

1.2 免疫組織化學

石蠟切片二甲苯脫蠟，梯度酒精復水至蒸餾水后，3%H2O2去除內源性的過氧化物酶，PBS洗切片5 min×3次;滴加5%非免疫山羊血清，封閉30 min;甩掉封閉液后滴加1∶100兔抗HGF多克隆抗體(1∶100兔抗 c－met多克隆抗體)，室溫放置 30 min，4℃過夜后，37℃孵育30 min，PBS 洗切片 5 min×3次;然后按照下面的程序進行，HGF:滴加生物素化山羊抗兔IgG，37℃，20 min;用PBS緩沖溶液沖洗3 min ×3次;顯色:BCIP/NBT(1∶20比例稀釋)混勻后加至切片，室溫顯色20 min;蒸餾水洗滌后核固紅輕度復染。水洗，干燥后水溶性封片劑封片。c－met:滴加 1∶100 HRP－山羊抗兔 IgG，37℃ 孵育 30 min，PBS洗切片5 min ×3次;滴加DAB顯色劑顯色3～5 min，PBS沖洗5 min ×3次;蘇木精輕度復染，梯度酒精脫水后二甲苯透明，中性樹膠封片。非免疫山羊血清代替一抗作為陰性對照。

1.3 圖像分析

應用 Image－Pro Plus 6.0 軟件對HGF 和 c－Met蛋白在各期小鼠皮膚組織中的免疫組織化學染色結果進行光密度的測定，每個時期的小鼠皮膚組織取3張切片，每張切片取5個視野，得到陽性細胞的光密度值。所得數(shù)據(jù)用SPSS 16.0(美國SPSS公司)，應用方差分析進行統(tǒng)計學分析。經(jīng)過測定所有數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，分析結果用平均值 ±標準誤(Mean±SE)來表示。

2 結果

2.1 HGF在ICR小鼠毛囊生長周期中的定位和表達量分析

HGF的免疫陽性產物主要分布在真皮乳頭和皮脂腺，表達量隨時期的不同而不同。在毛囊的生長期，毛纖維生長旺盛，毛乳頭的直徑顯著大于根鞘部，HGF呈強陽性的表達，紫色陽性物在真皮乳頭著色較深(圖1A);到達退化期，毛囊萎縮成杵形的圓狀結構，沒有可見的HGF的陽性表達物(圖1B);在休止期－生長期過渡中，可見新毛向上推移，接近杵形毛，杵形毛最終會脫落，新毛會占據(jù)舊毛穴，HGF的陽性表達有所增強，在真皮乳頭和皮脂腺均呈現(xiàn)陽性表達(圖1C)。對照組中均未見陽性反應(圖1D－1F)。生長期的平均吸光度是(0.17±0.0164)，休止期－生長期測定的平均吸光度值是(0.1168±0.0067)。

2.2 c-met在ICR小鼠毛囊生長周期中的定位和表達量分析

c－met的免疫陽性產物主要分布在根鞘部和表皮。在毛囊的生長期，毛纖維c－met呈強陽性的表達，棕黃色陽性物在毛基質和根鞘部著色較深(圖2A);在退化期，僅有微弱的c－met的陽性信號(圖2B);在休止期－生長期過度中，c－met的陽性表達有所增強，在根鞘部和表皮中均呈現(xiàn)陽性表達(圖2C)。對照組中均未見陽性反應(圖2D－2F)。3個時期的平均吸光度值分別是(0.31±0.0107)、(0.05±0.0041)和(0.23±0.0065)。

3 討論

注:1.根鞘;2.皮脂腺;3.真皮乳頭;4.表皮;A－C.實驗組;D－F.對照組;A，D.毛囊生長初期;B，E.毛囊生長中期;C，F(xiàn).毛囊生長末期。圖1 毛囊生長周期不同時期HGF的免疫組織化學染色Note.1.Root sheath;2.Sebaceous glands;3.Dermal papilla;4.Epidermis;A－C.Experiment groups;D－F.Control groups;A，D.Anagen;B，E.Catagen;C，F(xiàn).Telogen.Fig.1 The expressions of HGF protein in different phases of the hair follicle cycle in ICR mice

毛囊是毛發(fā)生長依賴的微小器官，其周期性變化與間充質－上皮的相互作用有密切的關系，與角質化細胞的分化，增殖和凋亡相關［9］。大量研究證明，毛囊的生長受到 Shh(Sonic Hedgehog)、β連環(huán)蛋白(β－catenin)、淋巴增強因子(lymphoid enhancer factor－1，lef－1)、骨形成蛋白(bone morphogenetic protein，bmp)家族成員等很多因子的調控［4，10，11］。同時，黑色素細胞活性與數(shù)量也隨著毛囊的生長呈現(xiàn)周期性的變化［12］。本實驗證明HGF主要定位于小鼠毛囊的毛乳頭，毛乳頭是皮膚間充質衍生形成的特殊結構，由成纖維細胞組成。Yamaguchi等［13］實驗證明HGF是一種由成纖維細胞分泌的生長因子，通過與黑色素細胞上的受體作用調控黑色素的產生。而c－met主要表達在小鼠毛囊的毛基質、根鞘部和表皮中。毛囊的黑色素細胞主要位于毛基質和根鞘部，其中毛基質的黑色素細胞對毛色起到?jīng)Q定性的作用，相對于毛基質來說，根鞘部僅含有很少量的黑色素細胞［14］。HGF/c－met在 ICR 毛囊生長的不同時期呈現(xiàn)不同的表達量。在生長期，毛囊生長旺盛，HGF和c－met表達量達到最高值;到退化期時，整個毛囊萎縮成杵形的圓狀結構，HGF完全沒有陽性信號，c－met表達信號非常微弱，在休止期向下一個生長期轉化過程中，HGF和c－met信號均呈現(xiàn)上升趨勢。實驗表明，HGF/c－met與ICR小鼠毛囊的周期性生長過程中起調控作用。

體外實驗證明HGF/c－met能夠增加毛囊的數(shù)量、促進毛囊的生長和延遲退化期的到達時間［7，8］。本實驗證明內源性的HGF/c－met信號調控毛囊的周期性變化。Balkovetz等證實HGF刺激β－catenin的的合成，從而引起表皮中的細胞核內β－catenin的積累。前期的實驗證明β－catenin是毛囊生長必需的分子之一，維持和促進毛囊的生長［4］。由此推測HGF與c－met的相互作用以間充質和上皮的互作為組織基礎，HGF可能通過調節(jié)β－catenin來發(fā)揮調控毛囊的生長。具體的分子作用機制是我們下一步研究的靶點。

注:1.根鞘;2.毛基質;3.真皮乳頭;4.表皮;A～C.實驗組;D～F.對照組;A，D.毛囊生長初期;B，E.毛囊生長中期;C，F(xiàn).毛囊生長末期。圖2 毛囊生長周期不同時期c－met的免疫組織化學染色(×20)Note.1.Root sheath;2.Hair matrix;3.Dermal papilla;4.Epidermis;A－C.Experiment groups;D－F.Control groups;A，D.Anagen;B，E.Catagen;C，F(xiàn).Telogen.Fig.2 Expression of c－met protein in different phases of the hair follicle cycle in ICR mice

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