王宏，韋秋獎

（1.云南中科靈長類生物醫(yī)學重點實驗室，昆明 650550；2.昆明亞靈生物科技有限公司，昆明 650550；3.昆明理工大學靈長類轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究院，昆明 650500)

研究報告

食蟹猴SPF種群建立過程中病毒抗體的動態(tài)監(jiān)測

王宏1，3，韋秋獎1，2

（1.云南中科靈長類生物醫(yī)學重點實驗室，昆明 650550；2.昆明亞靈生物科技有限公司，昆明 650550；3.昆明理工大學靈長類轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究院，昆明 650500)

目的調(diào)查從老撾引種的食蟹猴BV、SRV、SIV和STLV-1四項病毒抗體陽性、可疑的比例，并對SPF種群建立過程中四項病毒的動態(tài)變化進行了監(jiān)測，進而比較普通種群和SPF種群幼猴病毒抗體的陽性率。方法采用專用試劑盒對四項病毒進行連續(xù)監(jiān)測并進行比較分析。結(jié)果引種的1998只食蟹猴，BV抗體陽性比例高達52.35%，可疑比例為8.31%，抗體陰性的比例僅為39.34%；SRV和STLV-1抗體陽性率分別為7.45%和8.56%；未檢測出SIV抗體陽性或可疑的食蟹猴。經(jīng)過篩選后組建的SPF種群，2010年監(jiān)測的BV、SRV和STLV-1三項病毒抗體陽性率分別為5.24%、1.01%和0.4%，經(jīng)過連續(xù)5年的不斷篩選和淘汰，截至2014年年底三種病毒抗體陽性率分別下降至0.82%、0.27%和0.27%，未監(jiān)測出SIV抗體陽性或可疑的食蟹猴。普通群繁殖幼猴B病毒抗體陽性的比例為9.71%，可疑率為1.85%；而SPF繁殖種群B病毒抗體陽性率僅為0.22%。結(jié)論連續(xù)監(jiān)測病毒抗體并不斷淘汰抗體陽性和可疑的動物對組建SPF食蟹猴種群具有重要的生產(chǎn)意義。

食蟹猴；SPF種群；BV抗體；SRV抗體；STLV-1抗體；SIV抗體；抗體監(jiān)測

非人靈長類動物是人類的近親，與人的遺傳相似性極高，具有許多與人類類似的生物學和行為學特征，在組織結(jié)構(gòu)、生殖生理學、解剖學上與人類高度相似[1，2］。近年來，隨著生命科學的快速發(fā)展，對非人靈長類動物的需求一直在持續(xù)增加，擴大非人靈長類動物種群數(shù)量，獲得高質(zhì)量、標準化的非人靈長類實驗動物已成為我國科學研究進一步發(fā)展的迫切需求。目前，國際上對 SPF（specific pathogen free)級獼猴的定義主要是指動物體內(nèi)不含猴B病毒（cercopithecine herpesvirus type I，BV)，猴免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus，SIV)，猴T細胞趨向性病毒 I型（simian T lymphotropic virus type I，STLV-1)，猴逆轉(zhuǎn)D型病毒（simian retrovirus，SRV)和猴痘病毒（simian pox virus，SPV)等幾種特定病毒的獼猴。由于非人靈長類動物可能會自然攜帶或感染多種病毒，因此在建立SPF種群的過程中對病毒抗體的監(jiān)測就顯得極其重要，并直接影響建群的成功率。本研究對昆明某猴場的食蟹猴進行了長期、大規(guī)模的病毒監(jiān)測，在此基礎(chǔ)上不斷地篩選和剔除病毒抗體陽性和可疑的動物，從而穩(wěn)定SPF種群的建立，進一步促進我國SPF級非人靈長類實驗動物事業(yè)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及樣本收集

供試食蟹猴于2009年均從老撾引種至昆明亞靈生物科技有限公司【SCXK（滇)2010-0001】。其中雄性食蟹猴998只，雌性食蟹猴1000只，年齡均在3～5歲之間。2009年SPF食蟹猴初始種群建立時，對BV、SRV、SIV和STLV-1 4種病毒進行連續(xù)4次的病毒抗體檢測，每次間隔時間2個月。從2010年、2011年、2012年、2013年和2014年，每年兩次對動物檢測BV、SRV、SIV和STLV-1 4種病毒，間隔時間為每6個月一次【SYXK（滇)2010-0001】。食蟹猴飼養(yǎng)的設(shè)施及管理規(guī)范已通過國際實驗動物評估和認可委員會（AAALAC International)的完全認證。

1.2 被檢血清

靜脈采集全血2 mL，靜置30 min后離心（3000 r/min×15 min，室溫)，分離血清靜置于4℃待檢，若長期保存，需置于-40℃冰箱冷凍保存。

1.3 檢測試劑盒

猴5項病毒斑點免疫檢測試劑盒均從VRL Laboratories（USA)購買，實驗操作步驟按照試劑盒說明進行。

1.4 結(jié)果判定

根據(jù)試劑盒說明判斷病毒抗體陽性、可疑和陰性，可疑結(jié)果經(jīng)過1個月后重新采樣復檢予以確認。

2 結(jié)果

2.1 引進初始種群時病毒抗體檢測結(jié)果

對2009年從老撾引種的食蟹猴，經(jīng)連續(xù)進行4次病毒抗體檢測后，結(jié)果顯示，在1998只動物中，BV抗體陽性食蟹猴總比例高達52.35%，其中僅B病毒抗體陽性的食蟹猴比例為48.95%，同時檢測出BV和SRV抗體陽性的比例為1.30%，BV和STLV-1抗體同時表現(xiàn)陽性的比例為1.50%，同時檢測出BV、SRV和STLV-1 3種病毒抗體均為陽性的食蟹猴比例為 0.60%；BV抗體可疑的比例為8.31%，而在引進的1998只食蟹猴中，BV抗體檢測為陰性的比例僅為39.34%。在檢測的血清樣本中，SRV和 STLV-1抗體陽性率分別為7.45%和8.56%。通過血清樣本檢測，未檢測出SIV抗體陽性或可疑的動物，具體檢測結(jié)果見表1和圖1。

2.2 BV抗體動態(tài)監(jiān)測結(jié)果

結(jié)果顯示，BV抗體陽性食蟹猴數(shù)量每年呈逐漸下降的趨勢，2010年BV抗體陽性率和可疑率分別為5.24%和1.61%，截至2014年年底，BV抗體陽性率僅為0.82%，BV抗體可疑動物比例僅為0.55%，具體檢測結(jié)果見表2。

2.3 SRV抗體動態(tài)監(jiān)測結(jié)果

結(jié)果顯示，SRV抗體陽性動物數(shù)量從2010～2014年每年呈逐漸下降的趨勢，2010年SRV抗體陽性的食蟹猴為5只，陽性率為1.01%，SRV抗體可疑的食蟹猴為3只，可疑率為0.60%，截至2014年年底，SRV抗體陽性的食蟹猴僅為1只，SRV抗體可疑食蟹猴也僅有1只，具體檢測結(jié)果見表3。

2.4 STLV-1抗體動態(tài)監(jiān)測結(jié)果

結(jié)果顯示，STLV-1抗體陽性動物數(shù)量從2010～2014年的變化趨勢不明顯，2010年STLV-1抗體陽性的食蟹猴有2只，而2014年STLV-1抗體陽性的食蟹猴仍然有1只。具體檢測結(jié)果見表4。

表1 引進初始種群時病毒抗體檢測結(jié)果Tab.1 Results of virus antibody test of the introduced initialmonkey population

圖1 引進初始種群時病毒抗體陽性與可疑率Fig.1 Positive and suspicion rate of virus antibody of the introduced initialmonkey population

表2 BV抗體動態(tài)監(jiān)測結(jié)果Tab.2 Results of dynamic monitoring of BV antibody

表3 SRV抗體動態(tài)監(jiān)測結(jié)果Tab.3 Results of dynamic monitoring of SRV antibody

表4 STLV-1抗體動態(tài)監(jiān)測結(jié)果Tab.4 Results of dynamicmonitoring of STLV-1 antibody

2.5 SIV抗體動態(tài)監(jiān)測結(jié)果

從2009年引種至2014年年底，每年均按程序?qū)κ承泛镞M行SIV抗體監(jiān)測，結(jié)果顯示，均未檢測出SIV抗體陽性或可疑的食蟹猴。

2.6 SPF種群與普通種群自繁幼猴病毒抗體比較

從2009年初步建立SPF種群后，于2012年開始配種繁殖，根據(jù)2012年、2013年和2014年的繁殖情況分析，普通種群共繁殖865只幼猴，SPF種群共繁殖462只幼猴，幼猴斷奶時間為5～8個月，幼猴斷奶時采集血樣并對病毒抗體進行檢測。病毒抗體檢測結(jié)果表明，普通種群繁殖的幼猴中，BV抗體陽性的幼年食蟹猴共84只，陽性率為9.71%，BV抗體可疑動物16只，可疑率為1.85%；而檢測SPF繁殖種群的462只幼猴發(fā)現(xiàn)只有1只幼猴檢測BV抗體表現(xiàn)陽性，陽性率僅為0.22%，未發(fā)現(xiàn)BV抗體可疑的動物。同時對SPF種群與普通種群自繁幼猴病毒檢測中均未發(fā)現(xiàn)SRV、SIV、STLV-1抗體陽性或可疑的動物，結(jié)果見表5。

表5 SPF種群與普通種群幼猴病毒抗體比較Tab.5 Comparison of virus antibody in the babymonkeys of the common and SPF populations

3 討論

本研究涉及食蟹猴數(shù)量較多，時間跨度大，年齡段較為集中，從最初組建SPF種群的檢測結(jié)果來看，BV抗體陰性的食蟹猴比例僅為39.34%，抗體可疑的比例為 8.31%，而 BV抗體陽性率高達52.35%，略高于趙國明等[3］調(diào)查顯示來自廣西各野生動物保護區(qū)食蟹猴B病毒相關(guān)抗體陽性率49.8%，但低于韋毅等[4］報道的野外捕獲混養(yǎng)食蟹猴B病毒83.4%的陽性率，數(shù)據(jù)表明BV在食蟹猴養(yǎng)殖中普遍存在且病毒抗體陽性率高。

對2009年引種的食蟹猴進行連續(xù)4次檢測統(tǒng)計，SRV和STLV-1抗體陽性率分別為7.45%和8.56%，SRV和STLV-1抗體陽性率分別高于楊凈思等[5］報道的恒河猴SRV和STLV-1的抗體陽性率（分別為5.36%和5.95%)，也高于饒軍華等[6］報道食蟹猴的STLV-1抗體5.4%的陽性率，但低于周亞敏等[7］報道食蟹猴STLV-1抗體14.9%的陽性率及SRV抗體18.1%的陽性率，經(jīng)過篩選后組建的SPF種群，在2010年檢測的BV、SRV和STLV-1抗體陽性率分別為5.24%、1.01%和0.4%，經(jīng)過連續(xù)5年的不斷篩選和淘汰，BV、SRV和STLV-1抗體陽性率在2014年年底分別下降至0.82%、0.27%和0.27%，說明連續(xù)監(jiān)測病毒抗體并不斷淘汰抗體陽性和可疑的動物對組建SPF食蟹猴種群具有重要意義。

通過對SPF種群與普通種群自繁幼猴病毒抗體比較分析發(fā)現(xiàn)，普通種群繁殖的幼猴中，BV抗體陽性的幼年食蟹猴共84只，陽性率為9.71%，可疑率為1.85%，其中原因可能與幼猴從出生到離乳期間，生存的環(huán)境中都是BV抗體陽性或可疑猴，增加了感染機率；而檢測SPF繁殖種群的462只幼猴發(fā)現(xiàn)只有1只幼猴檢測BV抗體表現(xiàn)陽性，陽性率僅為0.22%，未發(fā)現(xiàn)BV抗體可疑的動物，說明了在SPF食蟹猴種群的建立過程中，定期對動物病毒進行監(jiān)測，隔離陽性和可疑的動物，對提高食蟹猴的質(zhì)量具有重要意義，同時也表明了SPF種群建立對生產(chǎn)SPF幼猴具有顯著的意義。

李常挺等[8］報道過野生獼猴SIV抗體全部呈陰性，本文通過對食蟹猴SIV抗體的連續(xù)監(jiān)測，也均未發(fā)現(xiàn)SIV抗體陽性或可疑的食蟹猴，提示從老撾引種的食蟹猴不攜帶SIV。

通過對老撾引種的食蟹猴病毒抗體的監(jiān)測結(jié)果提示，我國在引進食蟹猴時，應該注意:（1)重視加強對食蟹猴BV、SRV、STLV-1抗體的監(jiān)測；（2)通過數(shù)據(jù)顯示，應盡量引進年幼的動物，這與劉歡等[9］的研究結(jié)果一致。

現(xiàn)有的研究結(jié)果普遍認為靈長類動物病毒的主要傳播途徑包括打斗、撕咬、性交等，母猴垂直傳播給仔猴幾率極低[10，11］，同時韋秋獎[12］對137份 B病毒陰性群自繁1歲以上的幼猴血清進行檢測，沒有發(fā)現(xiàn)B病毒抗體呈陽性。因此在靈長類動物日常飼養(yǎng)過程中，除了加大對陽性和可疑動物監(jiān)測和淘汰力度外，必須加強防御措施，包括飼養(yǎng)環(huán)境的標準化、不斷完善檢疫制度以及人員的管理等。首先，引進靈長類動物時，必須隔離檢疫，檢測合格后方可進入飼養(yǎng)區(qū)；其次，按飼養(yǎng)目的的不同，采取分群飼養(yǎng)管理，加強對食物和飼養(yǎng)環(huán)境的消毒，發(fā)現(xiàn)陽性和可疑動物嚴格隔離處理。第三，建立完善的檢疫制度，定期對整個猴群進行病毒抗體的檢測，嚴格淘汰陽性和可疑動物，逐漸建立SPF種群。

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Djnam ic monitoring of virus antibodj during the establishment of SPF cjnomolgusmonkej population

WANG Hong1，3，WEIQiu-jiang1，2
（1.Yunnan Key Laboratory of Primate Biomedical Research，Kunming 650550，China；2.Kunming Biomed International，Kunming 650550；3.Institute of Primate Translational Medicine，Kunming University of Science and Technology，Kunming 650500)

ObjectiveTo investigate the positive and suspicious rates of BV，SRV，SIV and STLV-1 antibody of the cynomolgusmonkeys introduced from Laos，dynamicmonitoring of virus antibody during the establishmentof SPF cynomolgusmonkey population，and then comparing the positive rate of virus antibody in the babymonkeys between the common with SPF populations.MethodsContinuousmonitoring four kinds of virus in themonkeys was carried out using special reagent kits and analyzed the data.ResultsIn the introduced cynomolgusmonkeys（n=1998)，the positive rate of BV antibody was 52.35%，suspicious rate of BV antibody was 8.31%，and negative rate of BV antibody was only 39.34%，the positive rates of SRV and STLV-1 antibody were 7.45%and 8.56%，respectively，and positive or suspicious SIV antibody in the cynomolgusmonkeyswas not detected.After screening and establishment of the SPF population，the positive rates of BV，SRV and STLV-1 antibody were 5.24%，1.01%and 0.4%，respectively，in the year 2010.Then after five years of screening and elimination，by the end of 2014，the positive rates of BV，SRV and STLV-1 antibodies were 0.82%，0.27%and 0.27%，respectively，and positive or suspicious SIV antibody in the cynomolgusmonkeyswas notdetected.The BV antibody positive rate of the babymonkeyswas 9.71%and the suspicious rate was 1.85%in the commonpopulation，but only 0.22%of the baby monkeys in the SPF population.ConclusionsContinuousmonitoring virus antibodies and eliminating positive and suspicious animals have important significance in the establishmentofa SPF cynomolgus monkey population.

Cynomolgusmonkey；SPF population；BV antibody；SRV antibody；STLV-1 antibody；SIV antibody；Antibodymonitoring

Q95-33

A

1005-4847（2015)06-0573-05

10.3969/j.issn.1005-4847.2015.06.005

2015-07-23

云南省技術(shù)創(chuàng)新人才項目（編號:2014HB090)；昆明市科技計劃項目（編號:2014-04-A-S-02-3074)；云南省技術(shù)創(chuàng)新項目（編號:2015XA33)。

王宏（1975-)，男，碩士，副研究員，研究方向:實驗動物學與人類疾病動物模型研究。Email:wangh@kbimed.com