天花粉蛋白基因?qū)氪蠖沟难芯?/h1>
2015-05-28 07:40:38任清政孫婷婷張勻華
鄒 莉，任清政，孫婷婷，文 藝，張勻華
(1．東北林業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040;2．西藏出入境檢驗(yàn)檢疫局，西藏 拉薩 850000;3．黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，黑龍江 哈爾濱 150086)
大豆［Glycinemax(L．)Merrill］是重要的糧食、油料和飼料作物，是植物蛋白的主要來源，在國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)上占有十分重要的地位。但是大豆生育期病蟲害嚴(yán)重，直接威脅著大豆生產(chǎn)［1］。利用基因工程手段，將具有抗病和抗蟲特性的基因轉(zhuǎn)入大豆，使大豆免遭病蟲危害，在防治大豆病蟲害中表現(xiàn)出很好的發(fā)展前景。目前，已通過基因工程手段獲得抗蟲 ，抗病 ，抗除草劑 ，以及品質(zhì)得到改良的轉(zhuǎn)基因大豆。但是，相對(duì)于其它作物如水稻［18-19］、煙草等，大豆屬于較難進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的物種［20-21］。近年來，大豆遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)較為常用的是農(nóng)桿菌介導(dǎo)的子葉節(jié)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。李文霞等［22］對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆子葉節(jié)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)進(jìn)行了優(yōu)化。張福麗等［23］在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化中，通過添加L-半胱氨酸，提高了大豆的轉(zhuǎn)化效率。陳李淼等［24］在子葉節(jié)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中，研究了農(nóng)桿菌濃度與侵染時(shí)間的最佳組合配比，乙酰丁香酮的濃度等，為優(yōu)化大豆子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)提供一定的技術(shù)支持。
天花粉蛋白(Trichosanthin，TCS)是中草藥天花粉的有效成分，它對(duì)病毒、真菌和昆蟲有直接或間接的抑制和殺滅作用［25］。周長(zhǎng)梅［26］采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法首次將TCS基因?qū)肽颈局参锲咸阎?，并獲得了PCR陽(yáng)性植株。劉靜等［27］將TCS基因轉(zhuǎn)化泡桐，并證明了轉(zhuǎn)TCS基因泡桐對(duì)叢枝病具有一定的抗性。孫婷婷等［28］利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將TCS基因成功轉(zhuǎn)入歐美楊108。到目前為止，將天花粉蛋白基因轉(zhuǎn)入大豆中的研究鮮有報(bào)道，本試驗(yàn)通過構(gòu)建具有TCS啟動(dòng)子及結(jié)構(gòu)基因的植物表達(dá)載體，并在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化大豆，最終獲得轉(zhuǎn)基因植株，以期提高其抗病蟲性，為今后進(jìn)行作物抗性分子育種提供優(yōu)良的候選基因。
1 材料與方法
1．1 材料
1．1．1 菌種和質(zhì)粒 大腸桿菌(E．coli)DH5α，根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404，質(zhì)粒pT1-3、pCambia1381Xa均由北京大學(xué)提供。
1．1．2 植物材料 大豆種子合豐35，由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。
1．1．3 試劑與酶 限制性內(nèi)切酶、回收試劑盒購(gòu)自Promega公司，T4 DNA連接酶購(gòu)自華美公司，地高辛探針標(biāo)記試劑盒購(gòu)自Roche公司。其它生化試劑購(gòu)自北京鼎國(guó)公司。
1．1．4 培養(yǎng)基 基本培養(yǎng)基為MSB(MS無(wú)機(jī)成分+B5有機(jī)成分)培養(yǎng)基;誘導(dǎo)培養(yǎng)基:MSB+1．5 mg/L 6-BA+0．2 mg/L IBA;篩選培養(yǎng)基:MSB+1．5 mg/L 6-BA+0．2 mg/L IBA+500 mg/L Cefo+4 mg/L Hyg;生根培養(yǎng)基:1/2MSB+1．5 mg/L IBA;抑菌培養(yǎng)基:MSB+1．5 mg/L 6-BA+0．2 mg/LIBA+500 mg/L Cefo;伸長(zhǎng)培養(yǎng)基:MSB+0．75 mg/L 6-BA+0．2 mg/L IBA+500 mg/L Cefo+4 mg/L Hyg。
1．1．5 引物 根據(jù)TCS的結(jié)構(gòu)基因設(shè)計(jì)引物，由“PRIMER5”引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)，由上海生工公司合成。所設(shè)計(jì)的引物如下:上游序列(5′-3′):GGGAAGCTTTGCCATATTGTTTCGATTC;下游序列(5′-3′):GGGCATATGGATGTTAGCTTCCGGTTA。
1．2 植物表達(dá)載體pC-tPro-TCS-GUS的構(gòu)建
用限制性內(nèi)切酶Sma I和Bgl II酶切質(zhì)粒pCambia1381Xa，電泳后回收酶切產(chǎn)物，得到載體;用限制性內(nèi)切酶Sac I酶切質(zhì)粒pT1-3后補(bǔ)平，再用限制性內(nèi)切酶Bgl II酶切，得到TCS啟動(dòng)子及結(jié)構(gòu)基因，用T4 DNA連接酶連接到pCambia1381Xa的Sma I和Bgl II位點(diǎn)之間，16℃連接16 h以上，轉(zhuǎn)化E．coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞。提取質(zhì)粒并進(jìn)行Kpn I和Bgl II酶切鑒定，將篩選到的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序正確的陽(yáng)性菌株命名為pC-tPro-TCS-GUS。
1．3 克隆TCS基因在大腸桿菌中的表達(dá)
將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E．coli DH5α，挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基(含50 mg/L卡那霉素)中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。次日按1%的比例轉(zhuǎn)接后，37℃振蕩培養(yǎng)4 h，至OD600值達(dá)到0．5～0．6后，加入IPTG至終濃度為0．1 mmol/L，37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)5 h，離心收集菌體，并進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。
1．4 大豆的遺傳轉(zhuǎn)化和T1代植株的獲得
將構(gòu)建好的植物表達(dá)載體用液氨凍融法導(dǎo)入農(nóng)桿菌中。以合豐35為材料，參考Olhoft等［29］的方法切取并侵染大豆的子葉節(jié)。將大豆子葉節(jié)在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)1 d，用OD600=0．5的菌液侵染30 min，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含有AS 100μmol/L)上共培養(yǎng)3 d，用MSB液體培養(yǎng)基沖洗以除去外植體表面殘留的菌體，將子葉節(jié)接種到含有頭孢霉素的抑菌培養(yǎng)基上培養(yǎng)6 d，待不定芽長(zhǎng)到0．3～1．0 cm時(shí)，轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選和繼代，待抗性苗長(zhǎng)約3～5 mm時(shí)，移入生根培養(yǎng)基中生根，共獲得T0代轉(zhuǎn)基因大豆19株。將PCR-Southern陽(yáng)性的大豆植株種植于裝有蛭石和土壤混合物的塑料桶中，收獲T0代轉(zhuǎn)基因大豆種子。2011年5月將T0代種子播種于試驗(yàn)田中，設(shè)未轉(zhuǎn)基因大豆為對(duì)照，9月底收獲T1代種子，曬干陰涼處貯存。
1．5 轉(zhuǎn) TCS基因大豆 T0和 T1代分子檢測(cè)
采用CTAB法提取T0代和T1代大豆葉片總DNA，利用TCS結(jié)構(gòu)基因的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性，4 min;循環(huán)參數(shù):94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 2 min，35個(gè)循環(huán);72℃延伸，10 min。
從PCR為陽(yáng)性的植株中選取轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行PCR-Southern雜交分析。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行0．7%瓊脂糖凝膠電泳分離。采用高鹽印跡法將凝膠上的DNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，地高辛標(biāo)記檢測(cè)試劑盒進(jìn)行PCR-Souhern雜交。
2 結(jié)果與分析
2．1 植物表達(dá)載體pC-tPro-TCS-GUS的鑒定
將構(gòu)建的植物表達(dá)載體pC-tPro-TCS-GUS轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，對(duì)Kam平板上長(zhǎng)出的菌落用PCR進(jìn)行陽(yáng)性克隆的篩選。提取重組質(zhì)粒DNA，用KpnⅠ/BglⅡ雙酶消化重組質(zhì)粒pC-tPro-TCS-GUS，有一外源片段大小與TCS啟動(dòng)子及結(jié)構(gòu)基因大小相等，約2 000 bp(圖1)，證明TCS啟動(dòng)子及結(jié)構(gòu)基因正確地插入到表達(dá)載體pCambia1381Xa的SmaⅠ和BglⅡ位點(diǎn)之間，將篩選的陽(yáng)性克隆測(cè)序，結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致。重組植物表達(dá)質(zhì)粒pC-tPro-TCS-GUS構(gòu)建成功(圖2)。
圖1 KpnⅠ/BglⅡ雙酶切質(zhì)粒pC-tPro-TCS-GUS電泳圖譜Fig．1 Gel electrophoresis of pC-tPro-TCS-GUS plasmid cut by KpnⅠ /BglⅡ
圖2 植物表達(dá)載體pC-tPro-TCS-GUSFig．2 The plant expression vector pC-tPro-TCS-GUS
圖3 目的基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜Fig．3 PCR analysis of pC-tPro-TCS-GUS
圖4 天花粉蛋白在大腸桿菌中表達(dá)的SDS-PAGE檢測(cè)Fig．4 SDS-PAGE analysis of TCS expression in E．coli DH5α
2．2 農(nóng)桿菌工程菌的獲得
將植物表達(dá)載體pC-tPro-TCS-GUS轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出約760 bp大小的目的條帶(圖3)，與TCS結(jié)構(gòu)基因大小相符。
2．3 克隆TCS基因在大腸桿菌中的表達(dá)
將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E．coli DH5α，經(jīng)0．1mmol/L的IPTG 誘導(dǎo)培養(yǎng)5 h，4℃，6 000 g，離心收集菌體，進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。結(jié)果在相對(duì)分子質(zhì)量約30 KD處有1條明顯的條帶(圖4)，與預(yù)期的TCS融合蛋白大小一致。結(jié)果表明:重組表達(dá)質(zhì)粒pC-tPro-TCS-GUS的TCS基因在大腸桿菌中能夠正常表達(dá)。
2．4 大豆轉(zhuǎn)化抗性T0代植株的獲得
大豆子葉節(jié)經(jīng)農(nóng)桿菌侵染和共培養(yǎng)后，在含有4 mg/L Hyg的抗性誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)培養(yǎng)出現(xiàn)抗性不定芽。待抗性不定芽在抗性篩選伸長(zhǎng)培養(yǎng)基上長(zhǎng)成2～3 cm高的抗性再生苗，將抗性再生苗在不含Hyg的生根培養(yǎng)基上生根，獲得再生植株(圖5)。本研究轉(zhuǎn)化1 840個(gè)外植體，共獲得19株抗性再生T0代植株，轉(zhuǎn)化頻率為1．033%。
圖5 合豐35子葉節(jié)經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化后獲得抗性T0代植株轉(zhuǎn)基因植株Fig．5 Production of Hygromycin-resistant T0 plants by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Hefeng 35 Cotyledonary node
2．5 T1代植株的獲得
將收獲的23粒T0代轉(zhuǎn)基因大豆種子播種于試驗(yàn)田中，共出苗18株T1代植株，轉(zhuǎn)基因植株在大田中生長(zhǎng)狀況良好，豆粒飽滿(圖6)。9月底收獲T1代種子，曬干陰涼處貯存，用于后代抗病蟲性檢測(cè)。
圖 6播種40 d后T1代植株生長(zhǎng)狀況良好Fig．6 T1 plants grown well after sowing 40 d
2．6 轉(zhuǎn)TCS基因大豆 T0和T1代分子檢測(cè)
采用CTAB法分別提取T0和T1代抗性植株和未轉(zhuǎn)化植株(陰性對(duì)照)葉片的總DNA，以含目的基因的質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行PCR擴(kuò)增。由圖7和圖8電泳結(jié)果可以看出，T0和T1代抗性植株DNA擴(kuò)增出與質(zhì)粒DNA產(chǎn)物相同的特異性條帶，分子量約為760 bp，而陰性對(duì)照株則沒有擴(kuò)增出相應(yīng)的特異條帶。初步證實(shí)，目的基因pC-tPro-TCS-GUS已轉(zhuǎn)入到大豆基因組中。
圖7 T0代轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR檢測(cè)Fig．7 PCR detection of T0 transgenic plants
圖8 T1代轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR檢測(cè)Fig．8 PCR detection of T1 transgenic plants
將PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的T0代和T1代抗性植株進(jìn)行PCR-Southern雜交，結(jié)果見圖9和圖10，表明PCR陽(yáng)性株DNA擴(kuò)增片段與質(zhì)粒DNA擴(kuò)增特異片段有雜交信號(hào)、且處于同一位置，而陰性對(duì)照植株則沒有雜交信號(hào)，說明被檢測(cè)陽(yáng)性株擴(kuò)增出的PCR條帶確實(shí)為特異性的目標(biāo)帶，證明TCS基因已整合到T0代和T1代大豆植株基因組中。
圖9 T0代轉(zhuǎn)基因植株的PCR-Southern雜交分析Fig．9 PCR-Southern detection of T0 transgenic plants
圖10 T1代轉(zhuǎn)基因植株的PCR-Southern雜交分析Fig．10 PCR-Southern detection of T1 transgenic plants
3 結(jié)論與討論
天花粉蛋白作為中藥，在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用已經(jīng)引起廣泛重視，近年來研究發(fā)現(xiàn)，該蛋白能抑制艾滋病病毒(HIV)在感染的免疫活性細(xì)胞內(nèi)復(fù)制繁衍，降低免疫活性細(xì)胞中的艾滋病病毒感染的活性細(xì)胞數(shù)［25］。本研究所構(gòu)建的植物表達(dá)載體pC-tPro-TCS-GUS帶有TCS啟動(dòng)子及結(jié)構(gòu)基因，并且把TCS啟動(dòng)子及結(jié)構(gòu)基因與GUS報(bào)告基因的開放閱讀框架連接在一起，融和閱讀框架的表達(dá)產(chǎn)物是一個(gè)雜和蛋白，它是否會(huì)影響天花粉蛋白的空間結(jié)構(gòu)，改變天花粉蛋白的特性，有待于進(jìn)一步的研究。
在轉(zhuǎn)化植株鑒定時(shí)，對(duì)抗性植株進(jìn)行PCR檢測(cè)，可初步斷定外源基因是否整合到大豆的基因組中，并且此種方法簡(jiǎn)便、快速，可短時(shí)間內(nèi)對(duì)大量抗性植株進(jìn)行檢測(cè)。PCR檢測(cè)可篩選出大量的非轉(zhuǎn)化植株，對(duì)已得到的轉(zhuǎn)化植株需進(jìn)一步用Southern雜交證明其植物體的染色體內(nèi)是否已整合進(jìn)目的基因。
通過對(duì)TCS基因轉(zhuǎn)移及其在植物中表達(dá)的深入研究，可為獲得轉(zhuǎn)TCS基因的重要糧食作物和轉(zhuǎn)基因樹木提供理論依據(jù);探討TCS基因?qū)χ参锊《?、病原真菌和害蟲的抑制作用，為利用TCS基因進(jìn)行植物病蟲害防治提供參考依據(jù)。
本研究成功構(gòu)建了植物表達(dá)載體pC-tPro-TCS-GUS，并以大豆子葉節(jié)為受體材料，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了轉(zhuǎn)TCS基因T0代和T1代抗性植株，經(jīng)PCR、PCR-Southern檢測(cè)，目的基因已成功導(dǎo)入大豆基因組中，為大豆抗病蟲育種提供了基礎(chǔ)材料。但目前獲得的只是初步的結(jié)果，為了獲得有應(yīng)用前景的抗病蟲轉(zhuǎn)基因大豆材料，還需盡可能擴(kuò)大后代群體的規(guī)模，從中篩選出TCS基因穩(wěn)定遺傳、抗病蟲效果良好的可用于生產(chǎn)實(shí)踐的轉(zhuǎn)基因大豆新品種。
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鄒 莉，任清政，孫婷婷，文 藝，張勻華
(1．東北林業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040;2．西藏出入境檢驗(yàn)檢疫局，西藏 拉薩 850000;3．黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，黑龍江 哈爾濱 150086)
大豆［Glycinemax(L．)Merrill］是重要的糧食、油料和飼料作物，是植物蛋白的主要來源，在國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)上占有十分重要的地位。但是大豆生育期病蟲害嚴(yán)重，直接威脅著大豆生產(chǎn)［1］。利用基因工程手段，將具有抗病和抗蟲特性的基因轉(zhuǎn)入大豆，使大豆免遭病蟲危害，在防治大豆病蟲害中表現(xiàn)出很好的發(fā)展前景。目前，已通過基因工程手段獲得抗蟲 ，抗病 ，抗除草劑 ，以及品質(zhì)得到改良的轉(zhuǎn)基因大豆。但是，相對(duì)于其它作物如水稻［18-19］、煙草等，大豆屬于較難進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的物種［20-21］。近年來，大豆遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)較為常用的是農(nóng)桿菌介導(dǎo)的子葉節(jié)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。李文霞等［22］對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆子葉節(jié)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)進(jìn)行了優(yōu)化。張福麗等［23］在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化中，通過添加L-半胱氨酸，提高了大豆的轉(zhuǎn)化效率。陳李淼等［24］在子葉節(jié)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中，研究了農(nóng)桿菌濃度與侵染時(shí)間的最佳組合配比，乙酰丁香酮的濃度等，為優(yōu)化大豆子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)提供一定的技術(shù)支持。
天花粉蛋白(Trichosanthin，TCS)是中草藥天花粉的有效成分，它對(duì)病毒、真菌和昆蟲有直接或間接的抑制和殺滅作用［25］。周長(zhǎng)梅［26］采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法首次將TCS基因?qū)肽颈局参锲咸阎?，并獲得了PCR陽(yáng)性植株。劉靜等［27］將TCS基因轉(zhuǎn)化泡桐，并證明了轉(zhuǎn)TCS基因泡桐對(duì)叢枝病具有一定的抗性。孫婷婷等［28］利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將TCS基因成功轉(zhuǎn)入歐美楊108。到目前為止，將天花粉蛋白基因轉(zhuǎn)入大豆中的研究鮮有報(bào)道，本試驗(yàn)通過構(gòu)建具有TCS啟動(dòng)子及結(jié)構(gòu)基因的植物表達(dá)載體，并在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化大豆，最終獲得轉(zhuǎn)基因植株，以期提高其抗病蟲性，為今后進(jìn)行作物抗性分子育種提供優(yōu)良的候選基因。
1 材料與方法
1．1 材料
1．1．1 菌種和質(zhì)粒 大腸桿菌(E．coli)DH5α，根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404，質(zhì)粒pT1-3、pCambia1381Xa均由北京大學(xué)提供。
1．1．2 植物材料 大豆種子合豐35，由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。
1．1．3 試劑與酶 限制性內(nèi)切酶、回收試劑盒購(gòu)自Promega公司，T4 DNA連接酶購(gòu)自華美公司，地高辛探針標(biāo)記試劑盒購(gòu)自Roche公司。其它生化試劑購(gòu)自北京鼎國(guó)公司。
1．1．4 培養(yǎng)基 基本培養(yǎng)基為MSB(MS無(wú)機(jī)成分+B5有機(jī)成分)培養(yǎng)基;誘導(dǎo)培養(yǎng)基:MSB+1．5 mg/L 6-BA+0．2 mg/L IBA;篩選培養(yǎng)基:MSB+1．5 mg/L 6-BA+0．2 mg/L IBA+500 mg/L Cefo+4 mg/L Hyg;生根培養(yǎng)基:1/2MSB+1．5 mg/L IBA;抑菌培養(yǎng)基:MSB+1．5 mg/L 6-BA+0．2 mg/LIBA+500 mg/L Cefo;伸長(zhǎng)培養(yǎng)基:MSB+0．75 mg/L 6-BA+0．2 mg/L IBA+500 mg/L Cefo+4 mg/L Hyg。
1．1．5 引物 根據(jù)TCS的結(jié)構(gòu)基因設(shè)計(jì)引物，由“PRIMER5”引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)，由上海生工公司合成。所設(shè)計(jì)的引物如下:上游序列(5′-3′):GGGAAGCTTTGCCATATTGTTTCGATTC;下游序列(5′-3′):GGGCATATGGATGTTAGCTTCCGGTTA。
1．2 植物表達(dá)載體pC-tPro-TCS-GUS的構(gòu)建
用限制性內(nèi)切酶Sma I和Bgl II酶切質(zhì)粒pCambia1381Xa，電泳后回收酶切產(chǎn)物，得到載體;用限制性內(nèi)切酶Sac I酶切質(zhì)粒pT1-3后補(bǔ)平，再用限制性內(nèi)切酶Bgl II酶切，得到TCS啟動(dòng)子及結(jié)構(gòu)基因，用T4 DNA連接酶連接到pCambia1381Xa的Sma I和Bgl II位點(diǎn)之間，16℃連接16 h以上，轉(zhuǎn)化E．coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞。提取質(zhì)粒并進(jìn)行Kpn I和Bgl II酶切鑒定，將篩選到的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序正確的陽(yáng)性菌株命名為pC-tPro-TCS-GUS。
1．3 克隆TCS基因在大腸桿菌中的表達(dá)
將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E．coli DH5α，挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基(含50 mg/L卡那霉素)中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。次日按1%的比例轉(zhuǎn)接后，37℃振蕩培養(yǎng)4 h，至OD600值達(dá)到0．5～0．6后，加入IPTG至終濃度為0．1 mmol/L，37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)5 h，離心收集菌體，并進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。
1．4 大豆的遺傳轉(zhuǎn)化和T1代植株的獲得
將構(gòu)建好的植物表達(dá)載體用液氨凍融法導(dǎo)入農(nóng)桿菌中。以合豐35為材料，參考Olhoft等［29］的方法切取并侵染大豆的子葉節(jié)。將大豆子葉節(jié)在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)1 d，用OD600=0．5的菌液侵染30 min，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含有AS 100μmol/L)上共培養(yǎng)3 d，用MSB液體培養(yǎng)基沖洗以除去外植體表面殘留的菌體，將子葉節(jié)接種到含有頭孢霉素的抑菌培養(yǎng)基上培養(yǎng)6 d，待不定芽長(zhǎng)到0．3～1．0 cm時(shí)，轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選和繼代，待抗性苗長(zhǎng)約3～5 mm時(shí)，移入生根培養(yǎng)基中生根，共獲得T0代轉(zhuǎn)基因大豆19株。將PCR-Southern陽(yáng)性的大豆植株種植于裝有蛭石和土壤混合物的塑料桶中，收獲T0代轉(zhuǎn)基因大豆種子。2011年5月將T0代種子播種于試驗(yàn)田中，設(shè)未轉(zhuǎn)基因大豆為對(duì)照，9月底收獲T1代種子，曬干陰涼處貯存。
1．5 轉(zhuǎn) TCS基因大豆 T0和 T1代分子檢測(cè)
采用CTAB法提取T0代和T1代大豆葉片總DNA，利用TCS結(jié)構(gòu)基因的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性，4 min;循環(huán)參數(shù):94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 2 min，35個(gè)循環(huán);72℃延伸，10 min。
從PCR為陽(yáng)性的植株中選取轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行PCR-Southern雜交分析。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行0．7%瓊脂糖凝膠電泳分離。采用高鹽印跡法將凝膠上的DNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，地高辛標(biāo)記檢測(cè)試劑盒進(jìn)行PCR-Souhern雜交。
2 結(jié)果與分析
2．1 植物表達(dá)載體pC-tPro-TCS-GUS的鑒定
將構(gòu)建的植物表達(dá)載體pC-tPro-TCS-GUS轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，對(duì)Kam平板上長(zhǎng)出的菌落用PCR進(jìn)行陽(yáng)性克隆的篩選。提取重組質(zhì)粒DNA，用KpnⅠ/BglⅡ雙酶消化重組質(zhì)粒pC-tPro-TCS-GUS，有一外源片段大小與TCS啟動(dòng)子及結(jié)構(gòu)基因大小相等，約2 000 bp(圖1)，證明TCS啟動(dòng)子及結(jié)構(gòu)基因正確地插入到表達(dá)載體pCambia1381Xa的SmaⅠ和BglⅡ位點(diǎn)之間，將篩選的陽(yáng)性克隆測(cè)序，結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致。重組植物表達(dá)質(zhì)粒pC-tPro-TCS-GUS構(gòu)建成功(圖2)。
圖1 KpnⅠ/BglⅡ雙酶切質(zhì)粒pC-tPro-TCS-GUS電泳圖譜Fig．1 Gel electrophoresis of pC-tPro-TCS-GUS plasmid cut by KpnⅠ /BglⅡ
圖2 植物表達(dá)載體pC-tPro-TCS-GUSFig．2 The plant expression vector pC-tPro-TCS-GUS
圖3 目的基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜Fig．3 PCR analysis of pC-tPro-TCS-GUS
圖4 天花粉蛋白在大腸桿菌中表達(dá)的SDS-PAGE檢測(cè)Fig．4 SDS-PAGE analysis of TCS expression in E．coli DH5α
2．2 農(nóng)桿菌工程菌的獲得
將植物表達(dá)載體pC-tPro-TCS-GUS轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出約760 bp大小的目的條帶(圖3)，與TCS結(jié)構(gòu)基因大小相符。
2．3 克隆TCS基因在大腸桿菌中的表達(dá)
將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E．coli DH5α，經(jīng)0．1mmol/L的IPTG 誘導(dǎo)培養(yǎng)5 h，4℃，6 000 g，離心收集菌體，進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。結(jié)果在相對(duì)分子質(zhì)量約30 KD處有1條明顯的條帶(圖4)，與預(yù)期的TCS融合蛋白大小一致。結(jié)果表明:重組表達(dá)質(zhì)粒pC-tPro-TCS-GUS的TCS基因在大腸桿菌中能夠正常表達(dá)。
2．4 大豆轉(zhuǎn)化抗性T0代植株的獲得
大豆子葉節(jié)經(jīng)農(nóng)桿菌侵染和共培養(yǎng)后，在含有4 mg/L Hyg的抗性誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)培養(yǎng)出現(xiàn)抗性不定芽。待抗性不定芽在抗性篩選伸長(zhǎng)培養(yǎng)基上長(zhǎng)成2～3 cm高的抗性再生苗，將抗性再生苗在不含Hyg的生根培養(yǎng)基上生根，獲得再生植株(圖5)。本研究轉(zhuǎn)化1 840個(gè)外植體，共獲得19株抗性再生T0代植株，轉(zhuǎn)化頻率為1．033%。
圖5 合豐35子葉節(jié)經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化后獲得抗性T0代植株轉(zhuǎn)基因植株Fig．5 Production of Hygromycin-resistant T0 plants by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Hefeng 35 Cotyledonary node
2．5 T1代植株的獲得
將收獲的23粒T0代轉(zhuǎn)基因大豆種子播種于試驗(yàn)田中，共出苗18株T1代植株，轉(zhuǎn)基因植株在大田中生長(zhǎng)狀況良好，豆粒飽滿(圖6)。9月底收獲T1代種子，曬干陰涼處貯存，用于后代抗病蟲性檢測(cè)。
圖 6播種40 d后T1代植株生長(zhǎng)狀況良好Fig．6 T1 plants grown well after sowing 40 d
2．6 轉(zhuǎn)TCS基因大豆 T0和T1代分子檢測(cè)
采用CTAB法分別提取T0和T1代抗性植株和未轉(zhuǎn)化植株(陰性對(duì)照)葉片的總DNA，以含目的基因的質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行PCR擴(kuò)增。由圖7和圖8電泳結(jié)果可以看出，T0和T1代抗性植株DNA擴(kuò)增出與質(zhì)粒DNA產(chǎn)物相同的特異性條帶，分子量約為760 bp，而陰性對(duì)照株則沒有擴(kuò)增出相應(yīng)的特異條帶。初步證實(shí)，目的基因pC-tPro-TCS-GUS已轉(zhuǎn)入到大豆基因組中。
圖7 T0代轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR檢測(cè)Fig．7 PCR detection of T0 transgenic plants
圖8 T1代轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR檢測(cè)Fig．8 PCR detection of T1 transgenic plants
將PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的T0代和T1代抗性植株進(jìn)行PCR-Southern雜交，結(jié)果見圖9和圖10，表明PCR陽(yáng)性株DNA擴(kuò)增片段與質(zhì)粒DNA擴(kuò)增特異片段有雜交信號(hào)、且處于同一位置，而陰性對(duì)照植株則沒有雜交信號(hào)，說明被檢測(cè)陽(yáng)性株擴(kuò)增出的PCR條帶確實(shí)為特異性的目標(biāo)帶，證明TCS基因已整合到T0代和T1代大豆植株基因組中。
圖9 T0代轉(zhuǎn)基因植株的PCR-Southern雜交分析Fig．9 PCR-Southern detection of T0 transgenic plants
圖10 T1代轉(zhuǎn)基因植株的PCR-Southern雜交分析Fig．10 PCR-Southern detection of T1 transgenic plants
3 結(jié)論與討論
天花粉蛋白作為中藥，在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用已經(jīng)引起廣泛重視，近年來研究發(fā)現(xiàn)，該蛋白能抑制艾滋病病毒(HIV)在感染的免疫活性細(xì)胞內(nèi)復(fù)制繁衍，降低免疫活性細(xì)胞中的艾滋病病毒感染的活性細(xì)胞數(shù)［25］。本研究所構(gòu)建的植物表達(dá)載體pC-tPro-TCS-GUS帶有TCS啟動(dòng)子及結(jié)構(gòu)基因，并且把TCS啟動(dòng)子及結(jié)構(gòu)基因與GUS報(bào)告基因的開放閱讀框架連接在一起，融和閱讀框架的表達(dá)產(chǎn)物是一個(gè)雜和蛋白，它是否會(huì)影響天花粉蛋白的空間結(jié)構(gòu)，改變天花粉蛋白的特性，有待于進(jìn)一步的研究。
在轉(zhuǎn)化植株鑒定時(shí)，對(duì)抗性植株進(jìn)行PCR檢測(cè)，可初步斷定外源基因是否整合到大豆的基因組中，并且此種方法簡(jiǎn)便、快速，可短時(shí)間內(nèi)對(duì)大量抗性植株進(jìn)行檢測(cè)。PCR檢測(cè)可篩選出大量的非轉(zhuǎn)化植株，對(duì)已得到的轉(zhuǎn)化植株需進(jìn)一步用Southern雜交證明其植物體的染色體內(nèi)是否已整合進(jìn)目的基因。
通過對(duì)TCS基因轉(zhuǎn)移及其在植物中表達(dá)的深入研究，可為獲得轉(zhuǎn)TCS基因的重要糧食作物和轉(zhuǎn)基因樹木提供理論依據(jù);探討TCS基因?qū)χ参锊《?、病原真菌和害蟲的抑制作用，為利用TCS基因進(jìn)行植物病蟲害防治提供參考依據(jù)。
本研究成功構(gòu)建了植物表達(dá)載體pC-tPro-TCS-GUS，并以大豆子葉節(jié)為受體材料，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了轉(zhuǎn)TCS基因T0代和T1代抗性植株，經(jīng)PCR、PCR-Southern檢測(cè)，目的基因已成功導(dǎo)入大豆基因組中，為大豆抗病蟲育種提供了基礎(chǔ)材料。但目前獲得的只是初步的結(jié)果，為了獲得有應(yīng)用前景的抗病蟲轉(zhuǎn)基因大豆材料，還需盡可能擴(kuò)大后代群體的規(guī)模，從中篩選出TCS基因穩(wěn)定遺傳、抗病蟲效果良好的可用于生產(chǎn)實(shí)踐的轉(zhuǎn)基因大豆新品種。
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