芥藍產(chǎn)量性狀QTL定位

李桂花　陳漢才　張艷　黎庭耀　劉凱

摘 要 芥藍的豐產(chǎn)性狀是育種的重要目標性狀，由于控制芥藍的產(chǎn)量性狀均為數(shù)量性狀，常規(guī)育種進展緩慢，基因定位及分子標記輔助育種可提高選擇效率。本研究利用2個產(chǎn)量差異大的芥藍自交不親和系冬強♀（產(chǎn)量高）與Lb07M（產(chǎn)量低）為親本，構(gòu)建F2分離群體，F(xiàn)2自交獲得F2 ∶ 3家系，對產(chǎn)量性狀進行了QTL定位分析。對F2 ∶ 3家系中單株重、單薹重、株高、薹高、葉長、葉寬、薹粗進行了調(diào)查，利用已構(gòu)建首張芥藍變種內(nèi)的SSR和SRAP遺傳圖譜，結(jié)合田間性狀調(diào)查數(shù)據(jù)，用QTLNetwork2.0軟件通過混合線性復(fù)合區(qū)間作圖法（MCIM）對7個產(chǎn)量性狀進行了QTL分析。在10個連鎖群中共定位了8個QTL位點，其中控制單薹重、單株重、株高、葉寬的QTL各1個，分別解釋表型變異的18.4%，17.8%，19.1%，15.1%；控制主薹高和葉長的QTL各為2個，共解釋表型變異的23.8%、22.1%。芥藍產(chǎn)量性狀的QTL定位結(jié)果可為分子標記輔助選擇高產(chǎn)品種提供參考。

關(guān)鍵詞 芥藍；連鎖群； 表型變異；QTL定位

中圖分類號 S635.9 文獻標識碼 A

Abstract A segregating F2 population was generated from two Brassica oleracea var. alboglabra parents Dongqiang ♀（high yield）and Lb07M（low yield）. F2 ∶ 3 families were obtained by selfing each individual of the F2 population. EST-SSR，SSR and SRAP markers were used to construct the first intraspecific genetic linkage map for Brassica oleracea var. alboglabra. Plant weight， sprout weight， plant height， sprout height， leaf length， leaf width and sprout thickness in the F2 ∶ 3 families were investigated. Using the established SSR and SRAP genetic map of Brassica oleracea in combination with field data， QTL analysis of the 7 characteristics was performed by Mixed Composite Interval Mapping with software QTLNetwork 2.0. Eight QTL were detected in 10 linkage groups， including those for sprout weight， plant weight， plant height， leaf width， which explained 18.4%， 17.8%， 19.1% and 15.1% of the phenotypic variation， respectively； Two QTL were detected for sprout height， leaf length， which explained 23.8% and 22.1% of the phenotypic variation， while no QTL were detected for controlling sprout thickness. Our findings can be used to identify markers linking to the QTLs for marker-assisted selection in the practical breeding program.

Key words Chinese kale（Brassica oleracea var. alboglabra）； Linkage group； Phenotypic variation； QTL locations

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.07.006

芥藍（Brassica oleracea var. alboglabra）屬十字花科蕓薹屬一二年生草本植物，是甘藍的一個變種[1]，以肉質(zhì)菜薹或葉片為食用器官，肉質(zhì)脆嫩，風味清甜，營養(yǎng)豐富。芥藍是起源于中國華南地區(qū)的一種特色蔬菜[2]，主產(chǎn)區(qū)有廣東、廣西、福建和臺灣等?。▍^(qū)），沿海及北方大城市郊區(qū)也有少量栽培。主產(chǎn)區(qū)芥藍除市銷、北運外，還遠銷港澳及東南亞、歐美等國家和地區(qū)，深受廣大消費者喜愛[3]。構(gòu)成芥藍產(chǎn)量性狀的因素如單株重、單薹重、株高、薹高、葉長、葉寬等性狀均為數(shù)量性狀，數(shù)量性狀的選擇周期長，見效慢。迄今仍不清楚有幾個基因作用于芥藍的一個數(shù)量性狀及其所處的位置。分子標記遺傳圖譜的構(gòu)建及數(shù)量性狀QTL定位為解決上述問題提供了新的途徑和思路。蕓薹屬甘藍種最早的連鎖圖譜是Slocum等[4]以broccoli×cabbage F2群體為作圖群體，利用258個RFLP標記構(gòu)建的一張覆蓋甘藍基因組長度820 cM的連鎖圖譜。隨后不同實驗室利用甘藍種內(nèi)或變種間材料構(gòu)建了各自的遺傳圖譜[5-8]。在構(gòu)建遺傳圖譜的基礎(chǔ)上，前人對蕓薹屬的數(shù)量性狀研究較多的主要有抽薹開花[9]、商品菜的顏色[10]、抗性[11]等，對產(chǎn)量性狀研究較少，而芥藍在這些方面的研究幾乎空白。豐產(chǎn)性狀是芥藍育種的重要目標，采用分子遺傳圖譜對單薹重、單株重、株高、薹高、葉長、葉寬、薹粗等產(chǎn)量性狀進行QTL定位，為分子標記輔助選擇豐產(chǎn)芥藍品種提供了重要的技術(shù)依托。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究用于芥藍主要產(chǎn)量性狀調(diào)查及QTL定位群體為F2 ∶ 3家系。F2 ∶ 3家系是以廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所育成的自交不親和系冬強♀作為母本，Lb07M作為父本，雜交得到F1，F(xiàn)1自交得到F2，每個F2代植株自交獲得F2 ∶ 3家系。由于雙親均為自交不親和系，F(xiàn)2全部采用蕾期人工授粉，造成個別單株種子量不足。本研究中除去種子量少的3株（少于30粒）及F2群體中死苗的3株共171個家系。

上述F2 ∶ 3家系于2014年1月7日播種，2014年2月6日定植于廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所白云基地，為減少實驗中邊行優(yōu)勢帶來的誤差，每畦地種植2行，每個F2 ∶ 3家系設(shè)2個重復(fù)，每個重復(fù)種植15株，田間種植為隨機區(qū)組設(shè)計。

1.2 方法

主要產(chǎn)量性狀的調(diào)查從第一朵花完全開放開始收獲并進行調(diào)查，考察及記載標準按廣東省芥藍區(qū)域試驗標準及芥藍種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標準[12]，具體如下：

單株重：去根后單株重。

單薹重：從倒數(shù)第三葉至花薹的重量。

株高：植株基部與地面接觸處量至植株頂葉片最高處的自然高度。

薹高：從倒數(shù)第三葉至花薹的長度。

薹粗：薹最粗處的粗度。

最大葉長：自葉片基部量至葉片先端（不包括葉柄）的長度。

最大葉寬：葉片最寬處的寬度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)調(diào)查為F2 ∶ 3群體171家系，每個家系調(diào)查2個重復(fù)，每個重復(fù)15株，取15株平均值，分別得到2個重復(fù)的數(shù)據(jù)后，再使用2個重復(fù)的平均數(shù)，獲得171個家系各產(chǎn)量性狀2個重復(fù)平均值數(shù)據(jù)。將上述數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel工作表統(tǒng)計芥藍單株重、單薹重、株高、薹高、葉長、葉寬、薹粗等性狀進行表型數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，采用本研究室已構(gòu)建的芥藍 SSR、SRAP遺傳圖譜和QTL Network 2.0軟件，根據(jù)混合線性復(fù)合區(qū)間作圖法[13]進行 QTL作圖。利用Mapchart軟件[14]繪制QTL分布圖。QTL的命名采用“英文簡寫+QTL序號”的方法，例如單薹重（sprout weight，sw）sw.1表示檢測到的單薹重的第1個QTL。

2 結(jié)果與分析

2.1 芥藍產(chǎn)量性狀表型及差異

親本及F1和作圖群體F2 ∶ 3的表型見表1。從表1可知，雙親性狀差異極為明顯，其中P1的單薹重、單株重、薹粗、主薹高、株高等性狀均明顯高于親本P2。單薹重、單株重、薹粗、主薹高、株高的F1在兩親本之間。F2 ∶ 3分離群體除株高、主薹高、葉長、葉寬有低于低值親本外，其余也均在兩親本之間。F2 ∶ 3的7個產(chǎn)量性狀在群體中均發(fā)生明顯分離，表現(xiàn)為連續(xù)變化，單一峰值，并且偏度值均小于2。單株重、單薹重偏向于母本，所有調(diào)查的產(chǎn)量性狀基本符合正態(tài)分布（圖1）是數(shù)量性狀，由微效多基因控制，可以對其作進一步的QTL定位研究。

2.2 芥藍SSR和SRAP連鎖圖譜的構(gòu)建

利用芥藍自交系間雜交的F1經(jīng)自交后得到的F2為作圖群體，利用前期研究的SSR和SRAP分子標記方法構(gòu)建的首張芥藍變種內(nèi)分子遺傳圖譜。采用Joinmap 4.0[15]軟件對F2分離群體進行分子連鎖圖譜構(gòu)建，該遺傳圖譜包含了10個連鎖群，共有144個標記位點（其中包含72個SSR標記，72個SRAP標記），另外有45個標記未上任何連鎖群。連鎖群長度為18.8～182.0 cM，覆蓋基因組長度為1 173.8 cM，平均圖距為8.15 cM，連鎖群上的標記數(shù)為4～29個。

2.3 芥藍產(chǎn)量性狀的QTL定位

利用本研究室已構(gòu)建的芥藍遺傳圖譜，結(jié)合田間性狀調(diào)查數(shù)據(jù)，用QTL Network 2.0軟件通過MCIM對芥藍7個產(chǎn)量性狀進行了QTL分析，共檢測到8個QTL（表3，圖2），其中單株重1個QTL、單薹重1個QTL、株高1個QTL、薹高2個QTL、葉長2個QTL、葉寬1個QTL、薹粗未能檢測出QTL。

檢測出控制單薹重QTL1個，即sw.1，其中sw.1位于LG6上，介于分子標記08c0096～08c0953之間，與08c0096共分離，遺傳貢獻率為18.44%，該位點上的等位基因為增效基因，其加性效應(yīng)、顯性效應(yīng)均為正值，分別為6.83、0.87。

控制單株重QTL1個，即pw.1，其中pw.1位于LG6上，介于分子標記08c0096～08c0953之間，與08c0096共分離，與控制單薹重的sw.1在于同一位置，遺傳貢獻率為17.79%。該位點上的等位基因為增效基因，其加性效應(yīng)、顯性效應(yīng)均為正值，分別為7.19、0.999。

控制單株重QTL2個，即sh.1、sh.2，其中sh.1位于LG6上，sh.1介于分子標記08c0096～08c0953之間，與08c0953相對較近，相距2.4 cM。遺傳貢獻率為14.07%，該位點上的等位基因為增效基因，其加性效應(yīng)、顯性效應(yīng)均為正值，分別為1.53、0.77。sh.2位于LG7上，介于分子標記08c0687～08c0226之間，與08c0226相對較近，相距4.0 cM。遺傳貢獻率為7.51%，該位點上的等位基因為減效基因，其加性效應(yīng)、顯性效應(yīng)均為負值，分別為-1.25、-0.60。2個QTL共解釋表型變異的23.79%。

控制株高QTL1個，即ph.1，位于LG6上，ph.1介于分子標記08c0096～08c0953之間，與08c0096相對較近，相距2.4 cM。遺傳貢獻率為19.06%，該位點上的等位基因為增效基因，其加性效應(yīng)、顯性效應(yīng)均為正值，分別為1.95、0.92。株高與薹高檢測到的ph.1和 sh.1位于LG6的同一位置。

控制葉長QTL2個，即ll.1、ll.2，其中l(wèi)l.1位于LG6上，ll.1介于分子標記08c0096～08c0953之間，與08c0096共分離。遺傳貢獻率為11.16%，其加性效應(yīng)正值、顯性效應(yīng)為負值，分別為1.02、-0.05。ll.2位于LG1上，ll.2與08c0020-350共分離，遺傳貢獻率為10.59%，該位點上的等位基因加性效應(yīng)正值、顯性效應(yīng)均為負值，分別為0.85、-0.23。2個QTL共解釋表型變異的22.10%。

控制葉寬QTL1個，即lw.1，位于LG6上，lw.1介于分子標記08c0096～08c0953之間，與08c0096共分離。遺傳貢獻率為15.03%，該位點上的等位基因為增效基因，其加性效應(yīng)、顯性效應(yīng)均為正值，分別為0.897、0.117。葉長、葉寬、單株重、單薹重檢測到的ll.1、lw.1、pw.1、sw.1位于LG6的同一位置，且與08c0096共分離。

2.4 芥藍主要產(chǎn)量構(gòu)成因素相關(guān)性分析

作物各種產(chǎn)量性狀是相互作用的結(jié)果，各性狀間存在著不同程度的相關(guān)，對一個性狀的選擇必然會影響到另一性狀的選擇效果。因此，了解各主要產(chǎn)量性狀的相關(guān)性，有助于提高選擇效果和對品種資源的正確評價等。本試驗調(diào)查的6個與產(chǎn)量有關(guān)的性狀在F2 ∶ 3群體中表現(xiàn)出不同程度的極顯著正相關(guān)（表2），單株重與單薹重、株高、薹高、葉長、葉寬呈極顯著正相關(guān)，其中表型遺傳相關(guān)大小依次為單薹重﹥?nèi)~寬﹥?nèi)~長﹥薹高﹥株高；單薹重也與株高、薹高、葉長、葉寬呈極顯著正相關(guān)，表型遺傳相關(guān)大小依次為葉寬﹥?nèi)~長﹥薹高﹥株高；說明要提高芥藍的豐產(chǎn)性，同時改良這5個性狀是可行的，這些結(jié)果對芥藍豐產(chǎn)性的選育無疑具有積極的指導(dǎo)意義。

3 討論與結(jié)論

許多研究發(fā)現(xiàn)，相關(guān)性緊密的性狀，其QTL常位于基因組相同或相近的區(qū)域。Tuberosa等[16]認為，QTL分析為闡明性狀間的相關(guān)提供了有用的信息，并提出了性狀相關(guān)可能存在的4種原因：（1）控制不同性狀的兩個基因緊密連鎖，分布在染色體的相同或相鄰區(qū)域；（2）同一個單一功能的基因，對一系列的基因起調(diào)控作用；（3）同一個基因能控制兩個或多個不同的性狀；（4）兩個緊密連鎖的基因同時控制不同的性狀。推測數(shù)量性狀間表型的相關(guān)可能源于控制數(shù)量性狀的QTL位點的相關(guān)[17-18]。

本研究表明單薹重與單株重二者的相關(guān)系數(shù)達到0.991，表現(xiàn)為極顯著正相關(guān)，同時單株重與單薹重、薹高等均達顯著正相關(guān)，因此提高單株重、單薹重、薹高均能提高產(chǎn)量。QTL分析表明單薹重中1個QTL與單株重一致，分別位于LG6，且在同一位置。該結(jié)果可能表明芥藍產(chǎn)量性狀之間緊密相關(guān)，其QTL位點也具有分布相同連鎖群或相近位點的特點。

控制產(chǎn)量性狀的QTL在基因組中并非均勻分布，而是集中分布在LG6連鎖群上，在水稻的株高及其產(chǎn)量構(gòu)成因素的QTL檢測中也出現(xiàn)同樣的現(xiàn)象[19]。同時LG1連鎖群上有1個控制葉長的QTL，LG6連鎖群上有1個控制主薹高的QTL。葉長、葉寬、單株重、單薹重的QTL在LG6的同一位置，與08c0096共分離；株高與薹高的QTL也在LG6的同一位置，與08c0953相距2.4 cM，與08c0096相距3.0 cM。這些QTL的集中分布可能是由于這些性狀間存在相關(guān)性或這些相關(guān)性狀由同一類QTL控制。

芥藍的單薹重、單株重、薹粗、薹高、株高、葉長、葉寬等性狀態(tài)表現(xiàn)受基因和環(huán)境互作的影響大。有關(guān)研究表明[20]QTL與環(huán)境的互作效應(yīng)比QTL的主效應(yīng)更多地被檢測到，而QTL與環(huán)境之間的互作也為不同的學(xué)者在不同的作物中證實[21-22]，趙彥宏等[23]對水稻單穗粒重進行了QTL定位分析，共檢測到9個與單穗粒重相關(guān)的QTL，其中7個具有環(huán)境互作效應(yīng)。芥藍的單薹重、單株重、株高、薹高、葉長、葉寬等產(chǎn)量性狀表現(xiàn)受環(huán)境和環(huán)境互作的影響大，而本試驗只在單一環(huán)境下進行，無法檢測到相應(yīng)的互作QTL。

本研究沒有檢測到主效QTL（>30%），F(xiàn)2 ∶ 3家系于2014年1月份種植，由于該季節(jié)是廣州溫度最低的季節(jié)，因此芥藍很容易未熟抽薹，由于營養(yǎng)生長不充足，導(dǎo)致產(chǎn)量性狀偏低，本來計劃在不同季節(jié)種植以減小環(huán)境誤差，然而由于雙親均為自交不親和系，F(xiàn)2全部采用人工蕾期授粉，很多單株的種子量不多，只種植了一造，因此關(guān)于產(chǎn)量性狀的QTL需要進一步的實驗來進行驗證。

參考文獻

[1] 張平真. 關(guān)于芥藍起源的研究[J]. 中國蔬菜， 2009（14）： 62-65.

[2] 王冬梅， 陳 琛， 王慶彪， 等. 一個支持芥藍起源于中國的分子證據(jù)[J]. 中國蔬菜， 2011（16）： 15-19.

[3] 李桂花， 陳漢才， 張 艷， 等. 芥藍種質(zhì)資源遺傳多樣性的SRAP分析[J]. 熱帶作物學(xué)報， 2011， 32（12）： 2 214-2 220.

[4] Mather K. Biometrical Genetics[M]. London： Methuen， 1949： 221-223.

[5] Slocum M K， Figdore S S， Kennard W C L. Linkage arrangement of restriction fragment length polymorphism loci in Brassica oleracea[J]. Theor Appl Genet， 1990（80）： 57-64.

[6] Voorrips R E. MapChart： Software for the graphical presentation of linkage maps and QTLs[J]. The Journal of Heredity， 2002（93）： 77-78.

[7] 陳書霞， 王曉武， 方智遠， 等. RAPD標記構(gòu)建芥藍×甘藍分子標記連鎖圖[J]. 園藝學(xué)報， 2002， 29（3）： 229-232.

[8] 胡學(xué)軍， 鄒國林. 甘藍分子連鎖圖的構(gòu)建與品質(zhì)性狀的QTL定位[J]. 武漢植物學(xué)研究， 2004， 22（6）： 482-485.

[9] 王曉武， 婁 平， 何杭軍， 等. 利用芥藍×青花菜DH群體構(gòu)建AFLP連鎖圖譜[J]. 園藝學(xué)報， 2005， 32（1）： 30-34.

[10] Bohuon E， Ramsay L， Craft J. The association of flowering time quantitative trait loci with duplicated regions and candidate loci in Brassica oleracea[J]. Genetics， 1998（150）： 393-401.

[11] Li， Yuefei， Liu Zhiyong， Wang Yushu， et al. Identification of quantitative trait loci for yellow inner leaves in Chinese cabbage（Brassica rapa L. ssp. pekinensis）based on SSR and SRAP markers[J]. Scientia Horticulturae， 2012（133）： 10-17.

[12] Camargo L， Williams P， Osborn T. Mapping of quantitative trait loci controlling Resistance of Brassica oleracea to Xamthomonas campestris pv. Campestris in the field and greenhouse[J]. Phytopathology， 1995， 85（10）： 1 296-1 300.

[13] 李錫香， 方智遠. 芥藍種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標準[M]. 北京： 中國農(nóng)業(yè)出版社， 2008.

[14] Yang J， Hu C C， Ye X Z. QTL Network 2.0 Institute of Bioinformatics， Zhejiang University， Hangzhou， China（http： //ibi.zhujun.edu.cn/software/QTLnetwork）， 2005.

[15] Voorrips R E. MapChart： Software for the graphical presentation of linkage maps and QTLs[J]. The Journal of Heredity， 2002（93）： 77-78.

[16] Van Ooijen. JoinMap 4.0 Software for the calculation of genetic linkage maps in experimental populations[M]. Kyazma B V， Wageningen， Netherlands， 2006.

[17] Kosambi D D. The estimation of map distances from recombination values[J]. Ann Eugen， 1944（12）： 172-175.

[18] Tuberosa R， Salvi S， Sanguineti M C， et al. Mapping a QTLs regulating morpho-physiological traits and yield： case studies， shortcomings and perspectives in drought-stressed maize[J]. Annals of Botany， 2002（89）： 941-963.

[19] Rao G U， Ben Chaim A， Borovsky Y， et al. Mapping of yield-related QTLs in pepper in an interspecific cross of Capsicum annuum and C. frutescens[J]. Theor Appl Genet， 2003， 106（8）： 1 457-1 466.

[20] Fazio G， Staub J E. Genetic mapping and QTL analysis of horticultural traits in cucumber（Cucumis sativus L.）using recombinant inbred lines[J]. Theor Appl Genet， 2003（107）： 864-874.

[21] 林鴻宣， 莊杰云， 錢惠榮. 水稻株高及期構(gòu)成因素數(shù)量性狀基因座位的分子標記定位[J]. 作物學(xué)報， 1996， 22（3）： 257-263.

[22] 朱 軍. 數(shù)量性狀遺傳分析的新方法及其在育種中的應(yīng)用[J]. 浙江大學(xué)學(xué)報（農(nóng)業(yè)科學(xué)生命版）， 2000， 26（1）： 1-6.

[23] Robertson D S A. A possible technique for isolating genetic DNA for quantitative trait in plants[J]. Theor Bio， 1985（117）： 1-10.

[24] 刑永忠， 徐才國， 華金平. 水稻株高和抽穗期基因定位和分離[J]. 植物學(xué)報， 2001， 43（7）： 721-726.

[25] 趙彥宏， 朱 軍， 楊 劍. 基于水稻QTL定位分析預(yù)測單穗粒重最優(yōu)基因型[J]. 作物學(xué)報， 2007， 33（11）： 1 856-1 861.