王立宏 武興斌 王利

摘要：目的 探討藁本內(nèi)酯抗人肺癌A549細(xì)胞增殖的作用機(jī)制。方法 CCK-8法檢測(cè)藁本內(nèi)酯對(duì)A549細(xì)胞活力的影響，TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，Hoechst 33258熒光染色法觀察A549細(xì)胞的形態(tài)變化，ELISA檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）含量，Western blot檢測(cè)核因子-κB（NF-κB）、Bcl-2、Bax及磷酸化JNK蛋白表達(dá)。結(jié)果 15、30、60、120、180 μmol/L藁本內(nèi)酯作用12、24、48 h能抑制A549細(xì)胞活力（P<0.05，P<0.01， P<0.001），并呈劑量及時(shí)間依賴(lài)（P<0.05，P<0.01）；30、60、120 μmol/L藁本內(nèi)酯作用12、24、48 h，細(xì)胞凋亡率呈時(shí)間和劑量依賴(lài)（P<0.05，P<0.01）；經(jīng)藁本內(nèi)酯處理48 h后，A549細(xì)胞核可見(jiàn)明顯凋亡形態(tài)，包括核皺縮、碎裂、亮藍(lán)色熒光，染色質(zhì)分割產(chǎn)生凋亡小體；30、60、120 μmol/L藁本內(nèi)酯細(xì)胞核內(nèi)NF-κB蛋白p65亞基表達(dá)升高、細(xì)胞內(nèi)JNK蛋白磷酸化水平升高、抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)降低及促凋亡蛋白Bax表達(dá)升高（P<0.05，P<0.01，P<0.001）。結(jié)論 藁本內(nèi)酯通過(guò)抑制VEGF的表達(dá)而抑制腫瘤新生血管的形成，通過(guò)調(diào)控NF-κB蛋白表達(dá)及JNK蛋白磷酸化水平，降低Bcl-2/Bax比值，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

關(guān)鍵詞：藁本內(nèi)酯；A549細(xì)胞；凋亡；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；核因子-κB

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.07.016

中圖分類(lèi)號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2015）07-0055-05

Antiproliferative Effect of Ligustilide on Human Lung Adenocarcinoma A549 Cells WANG Li-hong1，2， WU Xing-bin1， WANG Li1 （1.Pharmacy Department， Second Hospital Affiliated to Lanzhou University， Lanzhou 730030， China；2.Wuwei Peoples Hospital， Wuwei 733000， China）

Abstract：Objective To investigate the effects of ligustilide on the proliferation of human lung adenocarcinoma A549 cells and its mechanism. Methods CCK-8 method was used to detect the effects of ligustilide on activity of A549 cells. Apoptosis rate was measured by TUNEL. Nuclear morphological changes of A549 cells were observed by fluorescence microscope after staining by Hoechst 33258. ELISA was used to detect the VEGF levels after incubation with ligustilide. Western blot was used to detect the expression of NF-κB， Bcl-2， Bax and the protein expression of phosphorylation of JNK. Results A549 cell activity was significantly inhibited after incubated with 15， 30， 60， 120， 180 μmol/L ligustilide for 12， 24， 48 h （P<0.05， P<0.01， P<0.001） in a dose and time-dependent manner （P<0.05， P<0.01）；Apoptosis rate increased by 30， 60， 120 μmol/L ligustilide for 12， 24， 48 h in a dose and time-dependent manner；A549 cells treated with ligustilide for 48 h appeared the apoptosis forms， including nuclear shrinkage， beating， strong blue fluorescence staining， and the chromatin divided producing apoptotic body；30， 60， 120 μmol/L ligustilide increased the expression of p65 subunit of NF-κB protein in the nuclei and the phosphorylation levels of JNK protein， reduce the expression of suppression apoptosis protein Bcl-2， and raised the expression of pro-apoptotic protein Bax （P<0.05， P<0.01， P<0.001）. Conclusion By inhibiting the expression of VEGF， ligustilide can inhibit the formation of tumor angiogenesis. By regulating the expression of NF-κB and the phosphorylation levels of JNK protein and reducing the ratio of Bcl-2/Bax， ligustilide can promote tumor cell apoptosis.

Key words：ligustilide；A549 cells；apoptosis；VEGF；NF-κB

基金項(xiàng)目：甘肅省自然科學(xué)研究基金計(jì)劃（096RJZA143）

通訊作者：王利，E-mail：lzuwangli@163.com

藁本內(nèi)酯是當(dāng)歸、川芎等中藥中主要活性成分之一，對(duì)心腦血管、循環(huán)系統(tǒng)及免疫功能均有較強(qiáng)的藥理作用[1-2]。研究表明，藁本內(nèi)酯具有抗腫瘤活性，能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移及腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)[3-5]。本研究以肺腺癌A549細(xì)胞為模型，觀察藁本內(nèi)酯誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的影響，并探討其作用機(jī)制，以期為臨床藁本內(nèi)酯治療肺癌提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物與細(xì)胞

藁本內(nèi)酯，天津士蘭科技有限公司，純度>98%；A549細(xì)胞購(gòu)自ATCC。

1.2 主要試劑與儀器

CCK-8試劑盒，上海博谷生物科技有限公司；蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、TUNEL試劑盒及人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）ELISA試劑盒，Roche公司；Hoechst 33258試劑盒，上海依科賽生物制品有限公司；細(xì)胞核和胞質(zhì)蛋白提取試劑盒，生工生物工程上海（股份）有限公司；DMSO及胎牛血清（FBS），Gibco公司；兔抗人核因子-κB（NF-κB）、磷酸化-JNK（P-JNK）、Bcl-2及Bax抗體，Santa Cruz公司。熒光顯微鏡IX51（日本Olympus公司），ELx800酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司），Z-323高速低溫離心機(jī)（德國(guó)HERMLE公司），F(xiàn)CM流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

A549細(xì)胞在含10%胎牛血清和青霉素100 μg/L、鏈霉素100 μg/L的DMEM培養(yǎng)基中，37 ℃、5%CO2孵育。細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，2～3 d傳代1次。細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)開(kāi)始實(shí)驗(yàn)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%時(shí)，serum- starved 10 h后用于實(shí)驗(yàn)。

1.4 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，37 ℃預(yù)熱，PBS洗3次， 0.25%胰酶消化，制成細(xì)胞懸液，以100 μL/孔（6000 cells）接種在在96孔板中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%時(shí)，serum-starved 10 h。給予含藁本內(nèi)酯15、30、60、120、180 μmol/L的無(wú)血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48 h，溶劑對(duì)照給予稀釋倍數(shù)與最大藥物濃度相同的DMSO（下同）。除去含藥/溶劑培養(yǎng)基，并用新鮮培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞2次，加入新的培養(yǎng)基，每孔加入10 μL CCK-8溶液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h后用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度（OD值）。

1.5 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以2 mL/孔（3×105 cells）接種在6孔板中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%時(shí)，serum-starved 10 h。實(shí)驗(yàn)組給予藁本內(nèi)酯30、60、120 μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48 h。1500 r/min離心5 min，收集細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，置水平搖床上緩慢搖動(dòng)30～60 min，重懸細(xì)胞，然后根據(jù)TUNEL試劑盒說(shuō)明書(shū)采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 Hoechst 33258熒光染色法檢測(cè)細(xì)胞核形態(tài)

細(xì)胞接種同“1.3”項(xiàng)。6孔板中置大小合適滅菌的載玻片。serum-starved 10 h后，實(shí)驗(yàn)組分別給予30、60、120 μmol/L藁本內(nèi)酯，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。棄去培養(yǎng)液，用4%多聚甲醛在4 ℃條件下固定15 min，棄固定液養(yǎng)液，Hoechst 33258染色液室溫條件下染色15 min。鏡檢。

1.7 ELISA檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子含量

細(xì)胞接種同“1.3”項(xiàng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以2 mL/孔（3×105 cells）接種在6孔板中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%時(shí)，serum- starved 10 h。實(shí)驗(yàn)組給予含藁本內(nèi)酯30、60、120 μmol/L的無(wú)血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。取培養(yǎng)液，1000 r/min離心5 min，除去細(xì)胞碎片及顆粒物，收集上清。根據(jù)VEGF試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.8 Western blot檢測(cè)核因子-κB、磷酸化JNK、Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)

按“1.3”項(xiàng)步驟收集細(xì)胞培養(yǎng)液，冰浴的PBS洗1遍，用細(xì)胞刮子刮下細(xì)胞，1000 r/min離心5 min，收集細(xì)胞沉淀，分別提取總蛋白和細(xì)胞核蛋白。在細(xì)胞沉淀中加入適量裂解液（含蛋白酶或磷酸酶抑制劑），冰浴裂解30 min，每隔10 min高速渦旋15 s。4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清，BCA法測(cè)定樣品中總蛋白濃度；用細(xì)胞核蛋白抽提試劑盒，根據(jù)說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞核蛋白。上樣量為40 μg。一抗（兔抗人NF-κB（p65）、P-JNK、Bcl-2、Bax均按1∶1000稀釋?zhuān)? ℃過(guò)夜，二抗（1∶10 000稀釋?zhuān)?7 ℃孵育2 h， ECL法顯色。采用軟件Image pro plus 6.0分析條帶的積分光密度。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以—x±s表示，結(jié)果中“2.1”“2.2”項(xiàng)采用雙因素分析，其余數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素分析及LSD-t組間檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 藁本內(nèi)酯對(duì)A549細(xì)胞活力的影響

與溶劑對(duì)照組比較，予藁本內(nèi)酯孵育12、24、48 h后，細(xì)胞活力均明顯下降（P<0.05，P<0.01，P<0.001），說(shuō)明藁本內(nèi)酯能夠抑制A549細(xì)胞的增殖，其IC50分別為121.98、89.99、62.70 μmol/L。藁本內(nèi)酯對(duì)A549細(xì)胞的抑制作用呈時(shí)間和濃度依賴(lài)性（P<0.05，P<0.01），兩者之間無(wú)交互作用（P>0.05）。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 藁本內(nèi)酯對(duì)A549細(xì)胞凋亡率的影響

根據(jù)不同作用時(shí)間藁本內(nèi)酯的IC50值，將濃度為30、60、120 μmol/L的藥物作用于A549細(xì)胞12、24、48 h，檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。與溶劑對(duì)照組比較，藁本內(nèi)酯能增加細(xì)胞凋亡率（P<0.05，P<0.01，P<0.001）。結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 各組不同時(shí)點(diǎn)A549細(xì)胞活力比較（—x±s，OD值）

組別 濃度（μmol/L） n 12 h 24 h 48 h

溶劑對(duì)照組 4 1.29±0.09 2.16±0.09 2.45±0.10

藁本內(nèi)酯組 15 4 1.11±0.07 1.88±0.08* 1.99±0.08*

30 4 0.96±0.08** 1.59±0.04** 1.68±0.04**

60 4 0.81±0.06*** 1.28±0.05** 1.26±0.05**

120 4 0.60±0.04*** 0.96±0.04*** 0.93±0.06***

180 4 0.54±0.01*** 0.71±0.03*** 0.54±0.07***

注：與溶劑對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001（下同）

表2 各組不同時(shí)點(diǎn)A549細(xì)胞凋亡率比較（—x±s，%）

組別 濃度（μmol/L） n 12 h 24 h 48 h

溶劑對(duì)照組 4 5.69±0.98 8.42±1.03 12.36±1.04

藁本內(nèi)酯組 30 4 10.40±1.02* 25.60±1.47** 35.47±2.38**

60 4 22.45±1.60* 35.79±2.43** 47.69±2.33****

120 4 45.64±2.08*** 51.16±2.81** 60.36±3.08****

2.3 藁本內(nèi)酯對(duì)A549細(xì)胞核形態(tài)的影響

溶劑對(duì)照組細(xì)胞核邊緣完整，呈均勻弱藍(lán)色熒光；藥物作用48 h后，細(xì)胞核內(nèi)可見(jiàn)濃染的顆粒塊狀強(qiáng)藍(lán)色熒光。早期凋亡的細(xì)胞核呈波紋狀或折縫樣，部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài)，晚期細(xì)胞核裂解為碎塊，染色質(zhì)分割產(chǎn)生凋亡小體。結(jié)果見(jiàn)圖1。

注：A.溶劑對(duì)照組；B.藁本內(nèi)酯30 μmol/L組；

C.藁本內(nèi)酯60 μmol/L組；D.藁本內(nèi)酯120 μmol/L組（下同）

圖1 藁本內(nèi)酯作用48 h各組A549細(xì)胞核形態(tài)

（Hoechst 33258染色，×200）

2.4 藁本內(nèi)酯對(duì)A549細(xì)胞培養(yǎng)上清液中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子含量的影響

與溶劑對(duì)照組比較，給予30、60、120 μmol/L藁本內(nèi)酯作用48 h后，VEGF含量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 藁本內(nèi)酯作用48 h VEGF含量比較（—x±s，pg/mL）

組別 濃度（μmol/L） n VEGF

溶劑對(duì)照組 4 50.45±0.18

藁本內(nèi)酯組 30 4 40.61±0.24*

60 4 37.71±0.40**

120 4 35.78±0.16**

2.5 藁本內(nèi)酯對(duì)核因子-κB、磷酸化JNK、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響

30、60、120 μmol/L藁本內(nèi)酯作用48 h后，細(xì)胞核中NF-κB p65亞基蛋白表達(dá)顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01，P<0.001），結(jié)果表明給予藥物后NF-κB被激活移位至細(xì)胞核，發(fā)揮促凋亡作用。同時(shí)細(xì)胞中P-JNK蛋白水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01），抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.001），促凋亡蛋白Bax表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01，P<0.001），Bcl-2/Bax比值降低。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 各組A549細(xì)胞NF-κB（p65）、P-JNK、Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，藁本內(nèi)酯能抑制A549細(xì)胞活力，其作用48 h的IC50是89.99 μmol/L。在Hoechst染色研究中發(fā)現(xiàn)藁本內(nèi)酯作用48 h能夠使A549細(xì)胞核濃密致染強(qiáng)藍(lán)色熒光，使細(xì)胞核皺縮、分解，形成凋亡小體，并隨著藥物濃度的增加凋亡率升高，120 μmol/L藁本內(nèi)酯凋亡率可達(dá)（60.36±3.08）%。

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了藁本內(nèi)酯誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的機(jī)制。腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移依賴(lài)新生血管的形成，VEGF是目前已知最有效的促血管生長(zhǎng)因子，對(duì)腫瘤新生血管形成及腫瘤生長(zhǎng)、浸潤(rùn)、遷移起重要作用。VEGF促進(jìn)腫瘤新生血管形成與腫瘤發(fā)病機(jī)制有確定性的關(guān)系。因此，針對(duì)VEGF/VEGF受體這一途徑為靶點(diǎn)尋找抑制劑，阻斷VEGF信號(hào)傳導(dǎo)，能夠達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的目的。研究表明，一種VEGF受體抑制劑SU6668能夠增加胰腺癌腫瘤細(xì)胞的凋亡，降低腫瘤微血管的密度[6]，川芎的主要活性成分可以下調(diào)VEGF的表達(dá)[7]，當(dāng)歸揮發(fā)油中的活性成分之一丁烯酯酸內(nèi)醋具有抑制新生血管形成的作用[8]，提示通過(guò)抑制腫瘤血管的生成來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，起到抗腫瘤作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，藁本內(nèi)酯可以降低A549細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VEGF的含量，提示這可能是藁本內(nèi)酯誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞內(nèi)的程序死亡，哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡途徑分為線粒體途徑（或內(nèi)在途徑）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡及死亡受體途徑（或外在途徑）。在死亡受體途徑中，首先配體誘導(dǎo)細(xì)胞表面的死亡受體，如腫瘤壞死因子受體家族三聚體化，在細(xì)胞膜上形成凋亡誘導(dǎo)復(fù)合物激活下游的Caspase8分子，進(jìn)而引起隨后的Caspases級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引發(fā)細(xì)胞凋亡。NF-κB是核因子蛋白家族重要的一員，在細(xì)胞靜息狀態(tài)下以無(wú)活性三聚體p50/p65/IκB結(jié)合的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，外來(lái)因素如炎癥因子、生長(zhǎng)因子或趨化因子刺激時(shí)p50/p65被釋放出來(lái)并發(fā)生核移位，進(jìn)而調(diào)控凋亡相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)；或在細(xì)胞外信號(hào)刺激下激活NF-κB誘導(dǎo)激酶，活化NF-κB，使其進(jìn)入細(xì)胞核，促進(jìn)NF-κB依賴(lài)的基因轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[9]。NF-κB參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡等過(guò)程是由腫瘤壞死因子受體家族通過(guò)死亡受體途徑介導(dǎo)。在本研究中發(fā)現(xiàn)，30～120 μmol/L藁本內(nèi)酯預(yù)作用48 h后，A549細(xì)胞核中NF-κB p65亞基蛋白表達(dá)顯著增加，推測(cè)藁本內(nèi)酯能夠活化NF-κB，使其移位至細(xì)胞核內(nèi)，發(fā)揮促凋亡作用。藁本內(nèi)酯通過(guò)何種途徑激活NF-κB還有待進(jìn)一步的深入研究。

腫瘤壞死因子受體相關(guān)蛋白2還可以直接或間接激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）通路，通過(guò)三級(jí)酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng)，即Ras/Raf/MEK/ERK途徑激活JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[10]，而后作用于線粒體，促使細(xì)胞色素C釋放，即通過(guò)線粒體凋亡途徑，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。凋亡調(diào)節(jié)基因Bcl-2家族中Bcl-2生理功能是通過(guò)阻止線粒體細(xì)胞色素C的釋放而發(fā)揮抗凋亡作用，而B(niǎo)ax基因是屬于Bcl-2家族促細(xì)胞凋亡基因。Bcl-2/Bax鑲嵌在線粒體膜上，調(diào)控線粒體功能。JNK可以通過(guò)直接磷酸化激活Bim/Bmf，再通過(guò)Bax/Bak來(lái)發(fā)揮作用[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，藁本內(nèi)酯促使細(xì)胞中JNK蛋白磷酸化水平升高，抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)降低，促凋亡蛋白Bax表達(dá)升高。提示藁本內(nèi)酯誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能是通過(guò)JNK蛋白磷酸化后進(jìn)入細(xì)胞核激活下游凋亡靶基因及蛋白轉(zhuǎn)錄表達(dá)，即轉(zhuǎn)錄依賴(lài)的方式；或是通過(guò)JNK活化后直接調(diào)控凋亡相關(guān)基因Bcl-2/Bax的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

綜上，藁本內(nèi)酯通過(guò)抑制VEGF的表達(dá)抑制腫瘤新生血管的形成，通過(guò)調(diào)控死亡受體途徑中的NF-κB蛋白的表達(dá)及線粒體途徑中P-JNK蛋白水平，降低Bcl-2/Bax比值誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用。藁本內(nèi)酯作為一個(gè)潛在的抗腫瘤藥物，其作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

參考文獻(xiàn)：

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（收稿日期：2014-12-02；編輯：華強(qiáng)）