郭秀秀

【摘 要】 目的：止咳枇杷顆粒的微生物限度檢查的方法驗(yàn)證。方法：按《中國(guó)藥典》2010年版附錄微生物限度檢查法規(guī)定的方法進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果：大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉、白色念珠菌、金黃色葡萄球菌以常規(guī)法驗(yàn)證回收率均大于70%。結(jié)論：止咳枇杷顆粒的細(xì)菌、霉菌和酵母菌的計(jì)數(shù)方法可采用常規(guī)法，控制菌可采用常規(guī)法檢驗(yàn)。

【關(guān)鍵詞】 止咳枇杷顆粒；微生物限度檢驗(yàn)法；方法驗(yàn)證

【中圖分類號(hào)】R921.2 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號(hào)】1007-8517（2015）13-0008-02

止咳枇杷顆粒是一種常用中成藥，具有清肺、止咳、化痰的作用，用于咳嗽多痰。處方由枇杷葉、白前、桔梗、桑白皮、百部、薄荷腦六味中藥組成，其中桔梗、百部、薄荷腦均具有一定的抑菌作用[1]?！吨袊?guó)藥典》2010版附錄Ⅻ-ⅠC微生物限度檢驗(yàn)方法中規(guī)定，建立藥品的微生物限度檢驗(yàn)方法必須進(jìn)行方法驗(yàn)證，確證供試液制備、測(cè)定方法及檢測(cè)系統(tǒng)適用于該藥品的檢驗(yàn)，保證微生物限度檢驗(yàn)方法的科學(xué)性和檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。本文參照2010年版《中國(guó)藥典》[2]、《中國(guó)藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范》[3]進(jìn)行試驗(yàn)，對(duì)止咳枇杷顆粒的微生物限度檢驗(yàn)方法進(jìn)行方法驗(yàn)證，結(jié)果表明細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)可采用常規(guī)法、控制菌檢查可采用常規(guī)法。

1 試驗(yàn)環(huán)境與材料

1.1 試驗(yàn)環(huán)境 根據(jù)2010年版《中國(guó)藥典》規(guī)定，試驗(yàn)在環(huán)境潔凈度10000級(jí)、局部潔凈度100級(jí)的單向流空氣的無菌室進(jìn)行，陽性菌操作在符合國(guó)家Ⅱ級(jí)生物安全標(biāo)準(zhǔn)的生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 BHC-1300ⅡA2型生物安全柜（蘇州蘇凈儀器自控設(shè)備有限公司）；GHP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海金慧科電子有限公司）；MJX-160B-Z型微電腦霉菌培養(yǎng)箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；DYX-DHS型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；YXQ-LS-75SⅡ型立式壓力蒸汽滅菌器（上海市博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；TZQ-Ⅱ型勻質(zhì)器型號(hào)（天津市津德實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)開發(fā)中心）。

1.3 供試品 止咳枇杷顆粒（批號(hào)：20140429、20140501、20140502，安徽省雪楓藥業(yè)有限公司）。

1.4 驗(yàn)證菌種 大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B） 44 102]、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B） 63 501]、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B） 26 003]、白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F） 98 001]均由中國(guó)醫(yī)學(xué)菌種保藏中心提供，黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F） 98 003]由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，試驗(yàn)用菌株的傳代次數(shù)為3代。

1.5 培養(yǎng)基 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：121130）、玫瑰紅鈉瓊培養(yǎng)基（批號(hào)：110811）、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（批號(hào)：110406）、改良馬丁培養(yǎng)基（批號(hào)：130227）、曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)氧基（EMB，批號(hào)：1110102）、膽鹽乳糖培養(yǎng)基（批號(hào)：1111162）、4-甲基傘形酮葡糖苷酸（MUG，批號(hào)：1110102）均由北京三藥科技開發(fā)公司提供。

根據(jù)2010年版《中國(guó)藥典》附錄Ⅻ-ⅠC的規(guī)定，計(jì)數(shù)培養(yǎng)基符合計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查的要求；控制菌檢查用培養(yǎng)基符合促生長(zhǎng)、指示和抑制能力的要求。

1.6 稀釋劑 0.9%無菌氯化鈉溶液（蚌埠豐原涂山試劑有限公司）；pH7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（杭州微生物試劑有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 [JP3]菌懸液的制備 枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌在營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中33℃培養(yǎng)24h，各取1ml培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍遞增稀釋至10-5、10-7、10-7，備用；白色念珠菌在改良馬丁液體培養(yǎng)基中經(jīng)25℃培養(yǎng)24h，取培養(yǎng)物1ml用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍遞增稀釋至10-5，備用；黑曲霉在改良馬丁斜面培養(yǎng)基中經(jīng)25℃培養(yǎng)1周，用5ml含0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液洗下黑曲霉孢子，吸取經(jīng)無菌棉花過濾的孢子菌懸液1ml，用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍遞增稀釋至10-6，備用。[JP]

2.2 菌懸液中含菌量檢驗(yàn) 取“2.1”中枯草芽孢桿菌10-5級(jí)稀釋液1ml放入已滅菌的平皿中，用45℃無菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基20ml注皿且平行測(cè)定兩皿，33℃培養(yǎng)48h計(jì)數(shù)；取10-7級(jí)金黃色葡萄球菌、10-7級(jí)大腸埃希菌分別注皿培養(yǎng)，方法及培養(yǎng)條件同枯草芽孢桿菌。取“2.1”中白色念珠菌10-5級(jí)稀釋液1ml放入已滅菌的平皿中，用45℃玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基20ml注皿，平行測(cè)定兩皿，25℃培養(yǎng)5d逐日觀察計(jì)數(shù)；取10-6級(jí)黑曲霉孢子菌懸液1ml注皿培養(yǎng)，方法及培養(yǎng)條件同白色念珠菌。

根據(jù)2010年版《中國(guó)藥典》規(guī)定，細(xì)菌、霉菌和酵母菌方法驗(yàn)證所用菌懸液含菌量應(yīng)為50～100 cfu/ml；控制菌方法驗(yàn)證所用菌懸液含菌量為10～100 cfu/ml。結(jié)果見表1，符合要求。

2.3 供試液制備 取本品最小包裝兩袋（10g/袋），按微生物限度檢查法規(guī)定稱取10g，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，勻漿儀2000轉(zhuǎn)/min，3min混勻，即為1∶10的供試品溶液。

2.4 細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證

2.4.1 常規(guī)法 按照2010年版《中國(guó)藥典》規(guī)定需進(jìn)行3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)，且每次每種菌種需平行2皿。

2.4.2 試驗(yàn)組 取1∶10供試液1ml，枯草芽孢桿菌10-5級(jí)菌懸液1ml，注入無菌平皿，立即傾注45℃無菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基20ml，待凝固后置33℃陽性細(xì)菌培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24～72h，逐日觀察結(jié)果并記錄。金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌同枯草芽孢桿菌。取1∶10供試液1ml，白色念珠菌10-5級(jí)菌懸液1ml，注入無菌平皿，立即傾注45℃無菌玫瑰紅鈉培養(yǎng)基20ml，待凝固后置25℃陽性霉菌培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)5d，逐日觀察結(jié)果并記錄。黑曲霉同白色念珠菌。

2.4.3 菌液組 取枯草芽孢桿菌10-5級(jí)、金黃色葡萄球菌10-7級(jí)、大腸埃希菌10-7級(jí)菌懸液各1ml，分別注入平皿，立即傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后置33℃細(xì)菌陽性培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～72h，逐日觀察結(jié)果并記錄。取白色念珠菌10-5級(jí)和黑曲霉10-6級(jí)菌懸液各1ml，分別注入平皿，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后置25℃霉菌陽性培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5d，逐日觀察結(jié)果并記錄。

2.4.4 供試品對(duì)照組 取1∶10供試液1ml，注入平皿，立即傾注45℃無菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或45℃無菌玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基置陰性細(xì)菌培養(yǎng)箱中33℃培養(yǎng)24～72h，玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基置陰性霉菌培養(yǎng)箱中25℃培養(yǎng)5d，逐日觀察結(jié)果并記錄。

2.4.5 稀釋劑對(duì)照組 取0.9%無菌氯化鈉溶液1ml，枯草芽孢桿菌10-5級(jí)1ml，注入平皿，立即傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后置33℃細(xì)菌陽性培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～72h，逐日觀察結(jié)果并記錄；金黃色葡萄球菌10-7級(jí)、大腸埃希菌10-7級(jí)方法同枯草芽孢桿菌。取0.9%無菌氯化鈉溶液1ml，白色念珠菌10-5級(jí)1ml，分別注入平皿，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后置25℃陽性霉菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5d，逐日觀察結(jié)果并記錄。黑曲霉10-6級(jí)菌懸液方同白色念珠菌。

2.4.6 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 從表2可知，3次平行試驗(yàn)枯草芽孢桿菌、大腸埃細(xì)菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌和黑曲霉的試驗(yàn)組和稀釋劑對(duì)照組的回收率均大于70%，根據(jù)《中國(guó)藥典》2010版規(guī)定，可以采用常規(guī)法測(cè)定供試品中細(xì)菌、霉菌和酵母菌數(shù)。

2.5 控制菌（大腸埃希菌）檢查方法驗(yàn)證

2.5.1 常規(guī)法 按照2010年版《中國(guó)藥典》規(guī)定需進(jìn)行3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)，且每次每種菌種需平行2皿

2.5.2 試驗(yàn)組 取已滅菌的裝有100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基的三角瓶一瓶，用無菌移液槍加入1∶10供試液10ml，10-7級(jí)大腸埃希菌菌懸液10ml，置35℃陽性培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，按大腸埃希菌的檢查法檢查。

2.5.3 陰性對(duì)照組 取已滅菌的裝有100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基的三角瓶一瓶，用無菌移液槍加入0.9%無菌氯化鈉溶液10ml，置35℃陰性培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，按大腸埃細(xì)菌的檢查法檢查。

2.5.4 陽性對(duì)照組 取已滅菌的裝有100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基的三角瓶一瓶，用無菌移液槍加入10-7級(jí)大腸埃希菌菌懸液10ml，置35℃陽性培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，按大腸埃希菌的檢查法檢查。

2.5.5 供試品組 取已滅菌的裝有100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基的三角瓶一瓶，用無菌移液槍加入1∶10供試液10ml，置35℃陽性培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，按大腸埃希菌的檢查法檢查。

2.5.6 陰性菌對(duì)照組 陰性對(duì)照菌采用10-7級(jí)金黃色葡萄球菌，方法同試驗(yàn)組。

2.5.7 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 由表3可知，大腸埃希菌陽性組、試驗(yàn)組生長(zhǎng)良好，說明止咳枇杷顆粒對(duì)大腸埃希菌無抑菌作用或抑菌作用較弱，可以采用常規(guī)法檢查。

3 結(jié)果與討論

3.1 上述驗(yàn)證結(jié)果 止咳枇杷顆粒采用常規(guī)法測(cè)定細(xì)菌、霉菌及酵母菌的試驗(yàn)組和稀釋劑對(duì)照組回收率均大于70%，說明可以采用常規(guī)法對(duì)細(xì)菌、霉菌、酵母菌及控制菌中大腸埃希菌進(jìn)行檢驗(yàn)且采用0.9%無菌氯化鈉溶液作為稀釋劑對(duì)試驗(yàn)不產(chǎn)生影響。

3.2 方法驗(yàn)證中陽性菌會(huì)造成環(huán)境污染 必須嚴(yán)格按照2010年版《中國(guó)藥典》附錄中方法驗(yàn)證的規(guī)定，在無菌室的生物安全柜內(nèi)操作，做好防護(hù)措施。同時(shí)供試品組及陰性對(duì)照組應(yīng)在符合規(guī)定的潔凈室內(nèi)操作。

3.3 方法驗(yàn)證需進(jìn)行三次獨(dú)立的平行實(shí)驗(yàn) 為使結(jié)果獲得良好的重現(xiàn)性，所加的培養(yǎng)基體積應(yīng)盡量一致，培養(yǎng)基與所加試液應(yīng)充分混合均勻。

3.4 菌落計(jì)數(shù) 菌落計(jì)數(shù)是方法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)過程中極為重要的一步，因此計(jì)數(shù)時(shí)應(yīng)仔觀察，必要時(shí)可借助放大鏡等工具，排除藥渣和小氣泡的干擾，減少操作誤差。

參考文獻(xiàn)

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[3] 中國(guó)藥品生物制品檢定所，中國(guó)藥品檢驗(yàn)總所.中國(guó)藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社.2010：351-369.

（收稿日期：2015.04.02）