陶愛(ài)群

摘要：為建立‘中秋酥脆棗的組培快繁體系，對(duì)外植體消毒時(shí)間長(zhǎng)短和種類選擇、不定芽誘導(dǎo)、不定芽增殖、不定根誘導(dǎo)進(jìn)行研究。結(jié)果表明：最佳外植體是水培枝棗頭；該外植體用升汞處理5 min后，接種于MS（改良）+6-BA2.5 mg/L+NAA0.15 mg/L，不定芽誘導(dǎo)率達(dá)94%；最適增殖培養(yǎng)基為MS（改良）+6-BA 1.5 mg/L+NAA0.5 mg/L，平均不定芽達(dá)6.5；1/2MS（改良）+NAA0.15mg/L為最適生根培養(yǎng)基，不定芽平均生根3.6個(gè)。

關(guān)鍵詞：‘中秋酥脆棗；組織培養(yǎng)；誘導(dǎo)；增殖

中圖分類號(hào)：S665.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 論文編號(hào)：2014-0494

0 引言

‘中秋酥脆棗是祁東糖棗的一個(gè)芽變品種，適應(yīng)南方高溫高濕氣候，抗性強(qiáng)適應(yīng)性廣，早果豐產(chǎn)性好，品質(zhì)優(yōu)良，成熟期恰逢中秋、國(guó)慶，填補(bǔ)了鮮棗的市場(chǎng)空白，經(jīng)濟(jì)價(jià)值極高?！星锼执鄺椧言诤稀⒔?、廣西、云南、重慶等多個(gè)南方省市推廣種植，但其育苗采用嫁接方式，所需的繁殖材料多，且從砧木苗的培育至嫁接苗出圃，至少需要3年以上，耗時(shí)長(zhǎng)，管理較為困難，使‘中秋酥脆棗在南方的廣泛推廣種植受到了影響。早在1994年王玉國(guó)等就對(duì)‘駿棗組織與快繁技術(shù)進(jìn)行了研究。迄今為止已有‘駿棗、‘呂西棗、‘桐柏大棗等多個(gè)棗樹(shù)品種成功再生出完整植株，‘金絲小棗、‘蘋(píng)果棗、‘臺(tái)灣印度棗、‘毛葉棗等品種建立了組培快繁體系。棗類組培外植體選用了休眠枝、水培芽、帶腋芽莖段、葉片、一年生枝、二次枝、棗頭芽，培養(yǎng)基主要為MS、WP、改良MS、H、White、改良WPM等，啟動(dòng)培養(yǎng)選用不同濃度的IBA、IAA、NAA、BA、KTt等，繼植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑影響棗的代增殖過(guò)程，亦有研究發(fā)現(xiàn)NG在‘臨澤小棗繼代過(guò)程中可代替植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑起作用。生根則多采用不同濃度IBA、NAA。雖對(duì)棗樹(shù)組培快繁有較多的研究，但所有的研究對(duì)象均為北方棗品種，對(duì)南方廣泛栽種的‘中秋酥脆棗組培技術(shù)研究目前沒(méi)有報(bào)導(dǎo)。為了能在短期內(nèi)大量生產(chǎn)‘中秋酥脆棗苗，解決苗木生產(chǎn)受季節(jié)、場(chǎng)地限制的問(wèn)題，筆者擬建立‘中秋酥脆棗組織培養(yǎng)技術(shù)體系，為探索其苗木生產(chǎn)的新途徑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)

研究田間試驗(yàn)于2010年在祁東縣新豐果業(yè)公司進(jìn)行，室內(nèi)試驗(yàn)在2011年5月至2013年10月在湖南環(huán)境生物學(xué)院組培基地進(jìn)行。

1.2 外植體篩選與消毒

1.2.1 1年生枝條水培枝 試材采自祁東新豐果業(yè)公司采穗圃。于2010年12月選取生長(zhǎng)健壯的1年生枝條放置于氣調(diào)庫(kù)中貯藏或埋于濕砂中至翌年4月棗芽萌發(fā)前取出，放入純凈水置于人工氣候室中培養(yǎng)，每3天換水1次。采下長(zhǎng)1 cm的棗頭、棗股，用洗衣粉水浸泡0.5 h，無(wú)菌水沖洗后轉(zhuǎn)入超凈工作臺(tái)，用70%的酒精浸泡30 s，分別用0.1%升汞溶液浸泡1、2、3、4、5 min后無(wú)菌水沖洗4～5遍，接種于不含生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、蔗糖含量為3%的培養(yǎng)基上，每種材料不同消毒時(shí)間均接種40個(gè)，20天后統(tǒng)計(jì)材料的污染率。

1.2.2 野外1年生枝條2011年5月在祁東新豐果業(yè)公司采穗圃選取生長(zhǎng)健壯的當(dāng)年生棗頭、棗股、二次枝，用流水沖洗后1 h后，再用無(wú)菌水浸泡0.5 h。后帶入超凈工作臺(tái)上，用70%的酒精浸泡30 s，分別用0.1%升汞溶液2、4、6、8、10 min后無(wú)菌水沖洗4-5遍，接種于不含生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、蔗糖含量為3%的培養(yǎng)基上，接種數(shù)量同水培枝，20天后統(tǒng)計(jì)污染率。

1.2.3 最優(yōu)外植體的篩選 將1年生水培枝新萌發(fā)的棗頭、棗股，1年生棗頭、棗股及二次枝按最優(yōu)消毒方式處理后，每種外植體選50個(gè)接種在改良MS+NAA1.00mg/L的培養(yǎng)基上，30天后統(tǒng)計(jì)褐化率和啟動(dòng)率。

1.3 不定芽誘導(dǎo)

1年生水培枝上選取生長(zhǎng)健壯的棗頭（長(zhǎng)約1 cm）作為外植體，Y1～Y5培養(yǎng)基以改良MSN培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素濃度如表1，每種培養(yǎng)基接種10瓶，每瓶5個(gè)，30天后統(tǒng)計(jì)啟動(dòng)率，60天后統(tǒng)計(jì)不定芽產(chǎn)生率。

1.4 增殖培養(yǎng)

初代培養(yǎng)出的不定芽，接種于6-BA和NAA濃度（見(jiàn)表1 Z1～Z5）的培養(yǎng)基進(jìn)行增殖培養(yǎng)。每種培養(yǎng)基接種10瓶，每瓶5個(gè)，30天后統(tǒng)計(jì)不定芽的再生頻率和生長(zhǎng)狀況。

1.5 不定梢生根

選取長(zhǎng)2～3 cm，有一定粗度的不定梢接種于表2S1-S6培養(yǎng)基上，10天后轉(zhuǎn)入不含生長(zhǎng)素的1/2MS和1/4MS基本培養(yǎng)上，每種處理接種25瓶，每瓶2個(gè)，40天統(tǒng)計(jì)不定梢的生根率、生根數(shù)和平均根長(zhǎng)。

1.6 其他

本研究中，培養(yǎng)條件均為光照與黑暗16 h/8 h，光強(qiáng)為2000 1x，培養(yǎng)基中均添加7.5 g瓊脂和30 g蔗糖，pH6.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體消毒與篩選結(jié)果

2.1.1 外植體消毒結(jié)果 從圖1～2可知，無(wú)論是水培枝萌發(fā)棗頭、棗股還是野外一年新生的棗頭、棗股和二次枝，經(jīng)不同消毒處理后均表現(xiàn)為隨著表面消毒劑處理時(shí)間的增長(zhǎng)，污染率呈下降趨勢(shì)。且消毒處理時(shí)間相同時(shí)，棗頭污染程度較棗股重，二次枝污染較當(dāng)年生棗頭、棗股輕，可能是二次萌發(fā)時(shí)間較遲，所接觸到的微生物較少。水培枝棗頭、棗股在相同時(shí)間消毒劑處理下比采穗圃所采當(dāng)年生棗頭、棗股輕，應(yīng)是水培枝放置在人工氣候室中培養(yǎng)時(shí)減少了與微生物接觸機(jī)會(huì)，以它為來(lái)源的外植體攜帶的微生物量相應(yīng)減少。

2.1.2 不同外植體的篩選 水培枝棗頭、棗股5 min，當(dāng)年生棗頭、棗股、二次枝9 min升汞處理后接種在MS+NAA 1.00 mg/L培養(yǎng)基上培養(yǎng)30天后發(fā)現(xiàn)，6%水培枝棗頭出現(xiàn)褐化，92%材料基部出現(xiàn)不同程度的愈傷化，2%材料在統(tǒng)計(jì)時(shí)未見(jiàn)有任何反應(yīng)。從表3中5種材料的表現(xiàn)可見(jiàn)，水培枝棗頭可作為‘中秋酥脆棗不定芽誘導(dǎo)的外植體。

2.2 不定芽誘導(dǎo)與生長(zhǎng)

將水培枝棗頭接種于Y1～Y5號(hào)培養(yǎng)基上，接種5天后，棗頭基部開(kāi)始膨大，到15～20天時(shí)，可見(jiàn)葉腋處出現(xiàn)不定芽，此芽生長(zhǎng)迅速，到30天時(shí)部分不定芽已長(zhǎng)至1.5 cm長(zhǎng)。從表4可知，隨著生長(zhǎng)素NAA濃度的升高，棗頭啟動(dòng)率上升，而不定芽產(chǎn)生率則先上升后下降，以Y4培養(yǎng)基表現(xiàn)最佳。

2.3 不定芽增殖

將先期組培所得的基礎(chǔ)苗中的部分不定芽接種于Z1～Z5的增殖培養(yǎng)基上，30天時(shí)統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表5。平均增殖率會(huì)隨著生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素濃度的升高而增加，平均不定芽長(zhǎng)度則為Z4培養(yǎng)基表現(xiàn)較好。綜合快繁對(duì)增殖培養(yǎng)階段的要求，以Z4培養(yǎng)基最為適于‘中秋酥脆棗的增殖。

2.4 不定根生長(zhǎng)

將2 cm長(zhǎng)的不定梢接種于S1-S6號(hào)生根培養(yǎng)基上，10天時(shí)不定梢基部開(kāi)始膨大，14～15天時(shí)膨大部分出現(xiàn)愈傷組織，20天時(shí)愈傷組織中出現(xiàn)小突起，此突起越長(zhǎng)越大，30天時(shí)可見(jiàn)成形的不定根。從生根情況（表6）看，在0.05～0.15 m/L的濃度范圍內(nèi)，隨著NAA濃度升高，不定根的產(chǎn)生率、平均生根數(shù)和平均根長(zhǎng)均呈上升趨勢(shì)。相同濃度的NAA中，1/2MS生根率和平均生根數(shù)高于1/4MS，平均根長(zhǎng)則1/4MS表現(xiàn)較好。但總體來(lái)說(shuō)，S3培養(yǎng)最有利于‘中秋酥脆棗組培苗生根。

3 結(jié)論

‘中秋酥脆棗組培采用1年生休眠枝條在室內(nèi)水培后萌發(fā)的棗頭芽作外植體易于進(jìn)行消毒處理，外植體誘導(dǎo)率高，培養(yǎng)最易獲得成功。MS+6-BA 2.5 m/L+NAA0.15mg∥L是理想的誘導(dǎo)培養(yǎng)基；而為了獲得較理想的增殖倍數(shù)和不定芽生長(zhǎng)量，MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L是理想的增殖培養(yǎng)基；在1/2MS+NAA0.15 mg/L培養(yǎng)基上，‘中秋酥脆棗生根良好。以上培養(yǎng)基均添加蔗糖30 gm、瓊脂7.5g/L，pH 6.0。

4 討論

4.1 外植體選擇與滅菌

棗樹(shù)組織培養(yǎng)選用莖尖、莖段、棗果、葉片等作為外植體，如雞心棗選用帶腋芽莖段，尜尜棗選用生長(zhǎng)季節(jié)棗頭莖段㈣，金絲小棗選用當(dāng)年生根蘗條水培芽、1年生休眠枝水培芽，酸棗選用休眠枝萌發(fā)的棗頭莖尖均成功再生。筆者試驗(yàn)表明1年生休眠枝水培后萌發(fā)的棗頭芽是中秋酥脆棗組培的最佳外植體，其原因如下：（1）材料來(lái)源較多，冬季進(jìn)行修剪時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量的1年生枝條；（2）第2年時(shí)，該枝條所攜帶的營(yíng)養(yǎng)充足，同時(shí)生理活性較強(qiáng)對(duì)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的誘導(dǎo)較敏感；（3）枝條在室內(nèi)水培時(shí)，所接觸的外源微生物相對(duì)較少，可以減輕外植體的污染程度，這與代麗等研究㈣結(jié)論一致。用棗股芽作外植體培養(yǎng)一段時(shí)間后，會(huì)萌發(fā)但不能成苗，而選擇棗頭芽作為外植體可形成發(fā)育良好的組培苗，是因?yàn)闂楊^芽具備有形成樹(shù)體骨架和結(jié)果枝的潛力，這與尜尜棗研究一致。至于取材時(shí)間、取材部位，有待進(jìn)一步探索。

棗外植體滅菌時(shí)，視外植體的污染程度選用不同的消毒方法，消毒時(shí)間越長(zhǎng)，滅菌效果越好，但外植體受表面消毒劑的傷害也越深，表現(xiàn)為褐化程度增加，誘導(dǎo)率下降，因此滅菌時(shí)間長(zhǎng)短非常關(guān)鍵，應(yīng)在消毒效果更好的前提下，盡量縮短滅菌時(shí)間，選用更有效的消毒劑。筆者采用二次消毒法，能有效殺滅外植體上的外生菌，與冬棗、臺(tái)灣青棗類似?！星锼执鄺椝嘀楊^用升汞滅菌5 min綜合效果最好，和雞心棗、青棗相同，短于冬束。

4.2 培養(yǎng)基選擇

棗類進(jìn)行組培時(shí)，基本培養(yǎng)基選用MS、改良MS、H、White、改良WPM，筆者采用改良MS進(jìn)行‘中秋酥脆棗組培，能有效再生，這應(yīng)與基因型差異有關(guān)。

進(jìn)行棗類組培時(shí)，TDZ、6-BA、ZT等細(xì)胞分裂素都用來(lái)誘導(dǎo)和增殖不定芽，但研究發(fā)現(xiàn)不同種類的細(xì)胞分裂素使用濃度和作用不同，如6-BA在棗類組培上的使用濃度范圍為0.5～5.0 mg/L，TDZ為0.005～0.01 mg/Ltm，6～BA可單獨(dú)應(yīng)用于棗的不定芽誘導(dǎo)，而低濃度TDZ、ZT在棗類不定芽誘導(dǎo)中可與6-BA協(xié)同作用，但不同再生階段作用濃度不同。‘中秋酥脆棗不定芽誘導(dǎo)和增殖的最適6-BA濃度分別為2.5、1.5 mg/L，這應(yīng)是不同棗類品種間基因型的差異導(dǎo)致植物材料內(nèi)源激素水平差異所致。

NAA、IAA、IBA等生長(zhǎng)素均可用于誘導(dǎo)棗類愈傷組織產(chǎn)生、不定芽生長(zhǎng)和生根。IBA是一種廣泛應(yīng)用于棗類組培的生長(zhǎng)素，誘導(dǎo)效果好，但I(xiàn)BA售價(jià)較高，快繁時(shí)應(yīng)考慮成本問(wèn)題，故筆者取NAA作為生長(zhǎng)素應(yīng)用于‘中秋酥脆棗的不定芽和生根誘導(dǎo)。