豬肚菇粗多糖脫蛋白脫色工藝優(yōu)化研究

方婷等

摘 要 以豬肚菇粗多糖為原料，對其脫蛋白和脫色工藝條件進行優(yōu)化。采用蛋白酶法和sevag法聯(lián)合除蛋白，研究不同酶添加量、處理溫度、pH值和處理時間等因素對蛋白脫除率的影響，采用正交設(shè)計對工藝條件進行了優(yōu)化。豬肚菇多糖脫色采用大孔吸附樹脂，系統(tǒng)研究樹脂靜態(tài)吸附與動態(tài)吸附試驗。結(jié)果表明：最佳脫蛋白工藝為：2 mg/mL豬肚菇粗多糖溶液，木瓜蛋白酶用量1 mg，酶解溫度60 ℃，酶解pH值5.5，酶解時間5 h，sevag試劑處理2次，豬肚菇多糖蛋白質(zhì)脫除率和多糖損失率分別為85.18%和23.41%；最佳脫色工藝為：選用NKA-9樹脂脫色，靜態(tài)吸附時樹脂用量1 ∶ 10，時間5 h，溫度30 ℃，動態(tài)吸附時pH6.0，洗脫速率3 BV/h，豬肚菇多糖脫色率和多糖損失率分別為84.19%和20.79%。

關(guān)鍵詞 豬肚菇；多糖；蛋白酶法；脫蛋白；大孔樹脂；脫色

中圖分類號 S646.9 文獻標識碼 A

Abstract Using pork bellies mushroom polysaccharides as the raw material， the deproteinized and decoloration process conditions were optimized. Protein enzymatic hydrolysis with sevag method was used to removal protein. The rate of protein removal and polysaccharide loss of pork tripe mushroom polysaccharide were studied under different enzyme dosage， time， temperature， and pH. The optimum process of protein in pork tripe mushroom polysaccharides was obtained through orthogonal experiments. Then， a method for decoloration of pork tripe mushroom polysaccharides was developed through static and dynamic adsorption tests. Its optimum process for the removal of protein：enzyme dosage 1mg， temperature 60 ℃， pH of 5.5 and a time of 5 h， then treated twice with sevag method， protein removal rate was 85.18%， the rate of loss of polysaccharide 23.41%. The optimum bleaching processes， NKA-9 resin optimal conditions for the amount of resin adsorption 1 ∶ 10， time 5 h， and temperature 30 ℃， the dynamic adsorption conditions of pH 6， elution rate 3 BV/h， tripe bleaching mushrooms rate of 84.19%， 20.79% loss rate of polysaccharides.

Key words Pork bellies mushrooms； Polysaccharides； Protease law； Deproteinised； Macroporous resin； Decoloration

豬肚菇（Panus giganteus（Berk.）Corner）是中國近年來新開發(fā)的一種功能性食用菌，學(xué)名大杯傘，又稱“大杯蕈”、“大杯香菇”等[1-4]。豬肚菇子實體是一種食、藥兼用菌，營養(yǎng)價值頗高，其中以豬肚菇多糖在其行使生物活性中發(fā)揮重要作用，邵穎[5]報道豬肚菇子實體凍干粉中多糖有很高的DPPH自由基清除力，然而，初步提取的豬肚菇多糖中含有一定的蛋白質(zhì)、色素等雜質(zhì)，不同程度地影響豬肚菇多糖的活性，嚴重制約了其在功能性食品等領(lǐng)域的開發(fā)應(yīng)用。

目前，粗多糖脫蛋白主要通過sevag法[6]、三氯乙酸法[7]、酶法[8]、鹽酸法[9]、樹脂法[10]等，多糖化學(xué)法脫色可能導(dǎo)致部分多糖水解，造成一定的損失并對其功能產(chǎn)生較大影響。因此，大多采用蛋白酶法降解雜蛋白。其中，木瓜蛋白酶源于番木瓜[11]，是一種含巰基（-SH）的內(nèi)切酶，有很強的專一性，被廣泛應(yīng)用于各類精細產(chǎn)品的脫蛋白工藝。另外，在多糖脫色研究中，徑向流柱已成為一種有效的分離技術(shù)，該方法根據(jù)原料組成和結(jié)構(gòu)差異選擇不同高分子填充物加強分離效率[12-13]?；诖耍狙芯恳缘鞍酌摮始岸嗵菗p失率為指標，采用木瓜蛋白酶與sevag法聯(lián)用對豬肚菇多糖脫蛋白工藝[11]，優(yōu)化工藝參數(shù)；同時采用徑向流色譜法，確立豬肚菇多糖脫色工藝，以期為豬肚菇多糖的深加工提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑 豬肚菇子實體購自福州農(nóng)貿(mào)市場；木瓜蛋白酶購自北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司，比活力4 000 U/mg；大孔吸附樹脂為6種大孔樹脂（AB-8、NKA-9、NKA-Ⅱ、X-5、HPD-600、HP-20型），購自上海摩速科學(xué)器材有限公司，物理化學(xué)性質(zhì)見表1；無水乙醇、正丁醇、氯仿、濃硫酸、苯酚、葡萄糖（均為分析純）。

1.1.2 儀器與設(shè)備 UV-2000紫外-可見分光光度計為尤尼柯（上海）儀器有限公司產(chǎn)；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)；層析柱Φ3.5×30 cm：上海禾汽玻璃儀器有限公司產(chǎn)；HL-2B型恒流泵上海滬西分析儀器廠有限公司產(chǎn)；L-530型臺式低速離心機，長沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)湘儀離心機儀器有限公司產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 豬肚菇粗多糖制備流程 參考王珊等的方法[7]。

1.2.2 多糖含量和蛋白質(zhì)含量的檢測方法 多糖含量測定采用苯酚-硫酸法；蛋白質(zhì)含量測定采用考馬斯亮藍法。

1.2.3 酶法聯(lián)合sevag法脫蛋白試驗 （1）單因素實驗：配制2 mg/mL豬肚菇粗多糖溶液，經(jīng)不同溫度（40 ℃～70 ℃）、pH值（4.0～7.0）、木瓜蛋白酶的酶添加量（0.5～1.5 mg）和酶解時間（2～7 h）酶解，再經(jīng)100 ℃沸水中煮15 min滅酶并離心離心10 min（4 000 r/min），后采用sevag法脫蛋白，取上清液測定蛋白質(zhì)和多糖含量，根據(jù)公式計算蛋白脫除率及多糖損失率。

蛋白脫除率/%=

×100

多糖損失率/%=

×100

（2）正交試驗：根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取蛋白酶添加量（A）、酶解時間（B）、酶解的溫度（C）和pH值（D）4個因素，以蛋白質(zhì)脫除率為指標，進行正交試驗，因數(shù)及水平設(shè)計如表2。

1.2.4 大孔樹脂吸附法脫色試驗 （1）樹脂種類的篩選：選用AB-8、NKA-9、NKA-Ⅱ、X-5、HPD-600、HPD-20型6種大孔樹脂對豬肚菇多糖溶液進行靜態(tài)吸附試驗，根據(jù)脫色率篩選出最佳的樹脂。

脫色率/%=

×100

（2）樹脂靜態(tài)吸附試驗：選用篩選出脫色率最佳的樹脂研究其靜態(tài)吸附工藝的關(guān)鍵參數(shù)，包括樹脂用量（每10 mL水中含樹脂1～6 g）、吸附時間（1～10 h）及吸附溫度（20～70 ℃）。將脫蛋白后的豬肚菇多糖加入適量NKA-9型大孔樹脂，并置于20 ℃水浴恒溫振蕩器中振蕩24 h（110 r/min），將多糖樣品抽濾后取上清液，繪制靜態(tài)脫色率曲線和多糖損失率曲線，分析樹脂脫色效果。

（3）樹脂動態(tài)吸附試驗：在靜態(tài)吸附工藝參數(shù)研究的基礎(chǔ)上進行動態(tài)吸附工藝研究。采用徑向流色譜法，將去離子水加入層析柱中，再將預(yù)處理好的20 mL NKA-9型樹脂裝入Φ 3.5×25 cm同方向?qū)游鲋?。分別考察上柱液pH值（2.0～8.0）及吸附流速（2～8 BV/h）對脫色效果的影響，清液取樣，繪制靜態(tài)脫色率曲線和多糖損失率曲線，確定最佳工藝參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶法聯(lián)合sevag法脫蛋白試驗

2.1.1 單因素試驗 （1）不同酶解溫度對豬肚菇多糖蛋白脫除率的影響：由圖1可知，當(dāng)酶解pH值為5.0，酶解時間為4 h，酶添加量為1 mg時，隨著酶解溫度的升高，蛋白質(zhì)脫除率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當(dāng)酶解溫度達到60 ℃時，蛋白脫除率達到最大。這是由于隨著溫度的升高，酶活力增強，酶液的擴散作用相對提高；但當(dāng)溫度繼續(xù)上升時，蛋白酶結(jié)構(gòu)發(fā)生轉(zhuǎn)變，酶活力受到抑制，蛋白脫除率隨之下降。同時，不同溫度處理下，多糖損失率一直維持在30%以下。因此，選擇60 ℃為酶解的最適溫度。

（2）不同酶解pH值對豬肚菇多糖蛋白脫除率的影響：酶在水解體系中的活性與底物解離狀態(tài)在一定程度受pH的作用。由圖2可知出，當(dāng)酶解溫度為60 ℃，酶解時間為4 h，酶添加量為1 mg時，酶解pH小于5.0時，蛋白脫除率隨著pH的增加而迅速上升；酶解pH大于5.0時，蛋白脫除率隨著pH的增大而顯著降低（p﹤0.05）。同時，隨著pH的升高，多糖損失率也在不斷提高，因此，選擇5.0為酶解的最適pH值。

（3）不同酶解時間對豬肚菇多糖蛋白脫除率的影響：由圖3可知，當(dāng)酶解溫度為60 ℃，酶解pH值為5.0，酶添加量為1 mg時，當(dāng)酶促反應(yīng)時間達到一定時，底物量濃度降低，使得酶促反應(yīng)速率降低，蛋白脫除率開始下降。不同酶解時間對多糖損失率影響并不顯著。因此，選擇4 h為最佳酶解時間。

（4）不同酶添加量對豬肚菇多糖蛋白脫除率的影響：由圖4可知，當(dāng)酶解溫度為60 ℃，酶解pH為5.0，酶解時間為4 h時，隨著酶濃度的上升，酶與底物接觸的機會增加，脫蛋白效果明顯增強，在添加量為1 mg時最大；之后蛋白脫除率尚無較大變化。同時，隨著酶用量的增加，多糖損失率也緩慢上升?？紤]木瓜蛋白酶在水解蛋白質(zhì)的同時，也具有從蛋白質(zhì)的水解物再合成蛋白類物質(zhì)的能力，因此，選擇1 mg為酶解的最適酶添加量。

2.1.2 正交試驗 由試驗結(jié)果可以看出，酶用量、溫度、時間、pH值均不同程度地影響蛋白脫除率，選擇酶量、溫度、時間、pH值 4種因素，以蛋白脫除率為指標，確定正交試驗，結(jié)果如表3所示。

由表4可看出，影響蛋白質(zhì)脫除率的主次因素是A>C>B>D，即酶添加量（A）>時間（C）>溫度（B）>pH值（D）。對正交實驗結(jié)果進行方差分析（表5），可以看出酶添加量對蛋白脫除率影響極顯著（p<0.01），處理時間和溫度對蛋白脫除率效果影響顯著。酶法脫除豬肚菇粗多糖蛋白質(zhì)的最優(yōu)工藝參數(shù)為A2B2C2D2，即酶添加量1 mg，溫度60 ℃，處理時間5 h，pH值為5.5。在此條件下，蛋白質(zhì)脫除率為72.71%，多糖損失率為18.78%。

原料經(jīng)酶處理后，大部分游離蛋白質(zhì)及部分與多糖結(jié)合的蛋白質(zhì)被水解，粗多糖中蛋白質(zhì)含量大大降低，將酶處理過后的豬肚菇多糖利用sevag試劑進行2次脫蛋白處理，蛋白脫除率為85.18%，多糖損失率為23.41%。當(dāng)sevag試劑處理次數(shù)超過2次，原料蛋白脫除率無明顯增加，但多糖損失率將顯著增加。試驗結(jié)果顯示，酶處理過后的豬肚菇多糖經(jīng)5次sevag試劑處理，多糖損失率將達32.34%。

2.2 大孔樹脂吸附法脫色試驗

2.2.1 樹脂種類的篩選 選用6種大孔樹脂對豬肚菇多糖溶液進行靜態(tài)吸附試驗，結(jié)果見表5。由表5可知，6種大孔樹脂中大孔樹脂NKA-9脫色率為75.9%，多糖損失率為22.1%，吸附能力強，且多糖損失率較低，所以選擇大孔吸附樹脂NKA-9做進一步吸附試驗。

2.2.2 NKA-9型樹脂對豬肚菇多糖溶液色素的靜態(tài)吸附研究 （1）樹脂用量對脫色率和多糖損失率的影響：由圖5可知，當(dāng)脫色時間為24 h，吸附溫度為20 ℃時，隨著樹脂NKA-9用量的增加，脫色率顯著下降，且當(dāng)用量達到3 g后，脫色率較為穩(wěn)定，并未進一步提高。這可能是由于某些色素與大孔吸附樹脂結(jié)合性較弱，無法被吸附。同時，樹脂用量的增加導(dǎo)致少量多糖被吸附，多糖損失率緩慢上升。因此，樹脂用量選擇每10 mL水中含樹脂1 g。

（2）吸附時間對脫色率和多糖損失率的影響：由圖6可知，當(dāng)樹脂用量為1 g/10 mL，吸附溫度為20 ℃時，隨著脫色時間的延長，脫色率顯著增大，脫色時間達5 h之后，脫色率基本保持不變，色素的吸附與解析達到動態(tài)平衡。同時，多糖損失率隨著脫色時間的增加并未出現(xiàn)顯著改變。因此，脫色時間選擇5 h。

（3）吸附溫度對脫色率和多糖損失率的影響：由圖7可知，當(dāng)樹脂用量為1 g/10 mL，脫色時間為5 h時；隨著溫度的升高，色素分子擴散加速，多糖溶液的粘度下降，有利于色素與多糖分子分離，在溫度為30 ℃時達到最佳效果，然后變化緩慢。這是由于吸附為一放熱過程，溫度提高到一定程度，解吸速度高于吸附速度，脫色率降低，同時多糖的損失率也會增大。因此，脫色溫度應(yīng)控制在30 ℃左右較為合適。

2.2.3 NKA-9型樹脂對豬肚菇多糖溶液色素的動態(tài)吸附研究 （1）上柱液pH值對脫色率的影響：由圖8可知，當(dāng)上柱溫度30 ℃，流速2 BV/h時；NKA-9樹脂的脫色率是隨著pH值的增大呈緩慢的先上升后下降的趨勢，在pH值為6達到最大值，這可能是由于豬肚菇多糖中的色素在偏酸性條件下呈弱極性或非極性。當(dāng)溶液偏堿性時，某些色素分子構(gòu)象可能發(fā)生改變，從而使脫色率降低。

（2）不同流速對脫色率的影響：由圖9可知，當(dāng)上柱溫度30 ℃，pH值為6.0時流速3 BV/h色素吸附效果最佳。這可能是由于流速越慢越有利于豬肚菇多糖液中色素分子充分擴散，充分被樹脂吸附。流速過快，無法充分接觸吸附造成脫色率快速下降。在沒有進行脫蛋白脫色前的豬肚菇多糖中蛋白質(zhì)含量約為15.2%，色素含量約為13.58%，除蛋白之后的蛋白質(zhì)含量為0.065 6%，脫色后的色素含量為0.021 5%，蛋白質(zhì)含量明顯下降，脫色效果明顯。

3 討論與結(jié)論

陳俊真[14]研究了香菇多糖脫蛋白工藝，表明采用酶法和sevag法聯(lián)用的蛋白脫除率達88.1%。張怡等[15]人采用蛋白酶法結(jié)合Sevag法對金柑粗多糖進行脫蛋白，優(yōu)化了酶添加量、溫度、pH值、時間等工藝參數(shù)，金桔粗多糖蛋白脫除率可達85.18%。肖麗霞等[16]在香菇多糖的樹脂脫色工藝里具體提出樹脂對食用菌多糖的有效脫色。羅璽等[17]人采用D303樹脂對靈芝多糖脫色工藝進行響應(yīng)面優(yōu)化，結(jié)果表明脫色率高達91.89%。綜上所述，本文采用的酶解法結(jié)合sevag法及大孔樹脂吸附法具有一定的可行性，并且在純化效率和多糖得率方面相比其他方法有明顯優(yōu)勢。

本研究以蛋白脫除率、脫色率及多糖損失率為評價指標，采用蛋白酶法綜合Sevag法對豬肚菇多糖溶液進行脫蛋白處理，及大孔樹脂吸附法對脫蛋白后的豬肚菇多糖進行脫色處理，通過正交試驗優(yōu)化，確定最佳脫蛋白工藝為：酶添加量1 mg，溫度60 ℃，作用時間5 h，pH值5.5，sevag試劑處理2次。在此工藝下，蛋白質(zhì)脫除率和多糖損失率分別為85.18%和23.41%。脫色最佳工藝為：NKA-9樹脂用量1 ∶ 10，脫色時間5 h，脫色溫度30 ℃，pH值6.0，流速3 BV/h。在此工藝下，脫色率為84.19%，多糖損失率為20.79%。

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