張 麗 陳婷婷 劉永林 周郁鴻 李曉芳 陳益民

再生障礙性貧血患者外周血CD55、CD59表達分析

張 麗 陳婷婷 劉永林 周郁鴻 李曉芳 陳益民

再生障礙性貧血；CD55；CD59；C3；C4；免疫球蛋白再生障礙性貧血（aplastic anemia，AA）是一種多原因引起的血液疾病，近年來T細胞免疫誘導的重要性在再障發(fā)病機制中逐漸被揭示[1-2]，本課題前期亦證實AA患者外周血存在T細胞的異常活化[3-4]和調(diào)節(jié)性T細胞的異常[5]，但體液免疫在AA發(fā)病機制的作用仍然存在爭論，因此我們通過檢測AA患者外周血粒、紅細胞表面CD55和CD59的表達和補體的變化，探討補體系統(tǒng)在AA發(fā)生過程中的作用。

1 對象與方法

1.1 研究對象 2010年7月—2012年9月在浙江省中醫(yī)院門診或住院就診AA患者81例，其中男40例，女41例，年齡5~77歲，中位年齡31歲，平均（33.7±20.6）歲；所有病例均為初次就診，診斷均參照文獻[6]。非AA組為浙江省中醫(yī)院體檢人群，共31名，其中男17名，女14名，年齡13~64歲，中位年齡33歲，平均（31.2±15.4）歲，外周血細胞計數(shù)排除AA和明顯感染。

1.2 儀器與試劑 美國BD公司PE-anti-CD55鼠抗人單克隆抗體,PE-anti-CD59鼠抗人單克隆抗體單抗體、PC5-anti-CD19鼠抗人單克隆抗體、鼠抗人PE-anti-IgG1同型對照、鼠抗人PC5-anti-IgG1同型對照。美國Beckman公司IgG、IgA、IgM、C3、C4試劑。美國Beckman公司EPICS-XL流式細胞儀、Immage全自動特定蛋白儀。

表1 兩組CD55、CD59表達與血清補體比較（±s）

表1 兩組CD55、CD59表達與血清補體比較（±s）

注：與非AA組比較，t=3.715、2.777、3.732、3.711、4.935、6.809，△P<0.05；AA：再生障礙性貧血

組別非AA組AA組例數(shù)31 81紅細胞（%） 粒細胞（%）CD55 97.92±1.40 94.54±7.88△CD59 97.85±1.67 93.06±15.28△CD55 99.28±0.69 91.92±17.72△CD59 97.88±2.20 93.83±9.17△C3（g/L）1.03±0.26 0.86±0.11△C4（g/L）0.30±0.10 0.20±0.05△

1.3 指標檢測 兩組均取外周血5mL，其中2mLEDTA-K2抗凝備用，3mL全血靜置15min后，2000rpm離心5min，取血清，全自動特定蛋白儀檢測IgG、IgA、IgM、C3、C4含量。取抗凝的外周血1μL，加入PBS緩沖液200μL稀釋，然后取3根試管，分別加入稀釋后紅細胞20μL和PE-anti-CD55抗體20μL、稀釋后紅細胞20μL和PE-anti-CD59抗體20μL、稀釋后紅細胞20μL和PE-anti-IgG1抗體，室溫孵育30min，加入PBS綬沖液1mL，上流式細胞儀分析。另取3根試管，分別加入全血100μL，再加入0.84%NH4Cl，室溫放置30min，加入PBS 5mL，1500rpm離心5min，棄上清，分別加入PE-anti-CD55、PE-anti-CD59、PE-anti-IgG1抗體，室溫孵育30min，加入PBS緩沖液1mL，上流式細胞儀分析。取2根試管，分別加入全血100μL，分別加入PC5-anti-CD19、PC5-anti-IgG1抗體，室溫孵育30min，再加入0.84%NH4Cl，室溫放置30min，加入PBS 5mL，1500rpm離心5min，棄上清，加入PBS緩沖液1mL，上流式細胞儀分析。

表2 兩組外周血B細胞比例與免疫球蛋白IgG、IgA、IgM比較（±s）

表2 兩組外周血B細胞比例與免疫球蛋白IgG、IgA、IgM比較（±s）

注：AA：再生障礙性貧血

非AA組AA組1.32±0.43 1.41±0.47 31 81 10.36±2.26 9.43±6.48 16.10±3.8 15.45±4.62 3.21±0.65 3.65±0.72

2 結(jié)果

2.1 兩組CD55、CD59表達與血清補體比較 與非AA比較，81例AA患者外周血紅、粒細胞CD55和CD59表達、血清補體含量顯著降低（P<0.05），見表1。

2.2 兩組外周血B細胞比例與免疫球蛋白IgG、I-gA、IgM比較 與非AA組比較，AA患者外周血B細胞比例與免疫球蛋白IgG、IgA、IgM差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表2。

3 討論

CD55又稱促衰變因子，廣泛分布在血細胞、黏膜上皮細胞和其他組織細胞表面，能與細胞表面瞬時形成的C3轉(zhuǎn)化酶裂解失活；CD59又稱膜反應性溶血抑制劑，廣泛分布于各個血細胞和組織細胞的表面，主要組織膜攻擊復合物的形成。CD55、CD59作為主要的膜結(jié)合調(diào)節(jié)蛋白，保護宿主正常細胞免遭補體活化介導的損傷[7]。造血干細胞存在PIG-A基因突變，可導致錨蛋白CD55、CD59表達缺失。文獻報道AA造血干細胞存在PIG-A突變和體液免疫異常[8]。因此本課題組檢測81例AA患者外周血紅、粒細胞CD55、CD59的表達，發(fā)現(xiàn)AA患者外周血中粒、紅細胞的CD55和CD59的表達較非AA組顯著下降，血清C3、C4濃度較正常組降低，結(jié)果與李玉云等[8]結(jié)果一致。推測由于再障患者免疫功能紊亂、造血微環(huán)境異常等，部分干細胞可發(fā)生PIG-A基因突變，使CD55、CD59表達減少，降低對補體活化的抑制，從而使補體活化增強，水平降低。當CD55、CD59降低一定程度，血細胞則會出現(xiàn)獲得性膜缺陷，發(fā)生溶血。AA患者CD55、CD59表達缺失和補體數(shù)量的異常提示補體系統(tǒng)在AA發(fā)生或病情進展過程中發(fā)揮重要的作用，檢測外周血CD55、CD59及補體C3、C4等可能有助于AA的發(fā)現(xiàn)和療效監(jiān)測。

本研究發(fā)現(xiàn)，AA患者B細胞數(shù)量及免疫球蛋白IgG、IgA、IgM并無顯著改變。提示抗體介導的體液免疫功能可能與再障發(fā)生、發(fā)展無關，抑或AA患者雖無數(shù)量的異常，但可能存在功能上的異常，這有待進一步研究證實。

［1］Kook H，Risitano AM，ZengW，etal.Changes in T-cell VB-repertoire in aplastic anemia：effects of different immunosuppressive regimens［J］.Blood，2002，99（10）：3668-3675.

［2］Maciejewski JP，Risitano A，Kook H，et al.Immune patho-physiology of aplastic anemia［J］.Int J Hematol，2002，76（suppl 1）：207-214.

［3］劉永林，周郁鴻，陳益民，等.流式熒光雜交技術(shù)檢測再生障礙性貧血患者血清細胞因子［J］.臨床檢驗雜志，2011，29（8）：572.

［4］朱琳超，劉永林，周郁鴻，等.流式細胞術(shù)檢測慢性再生障礙性貧血患者T細胞活化的研究［J］.浙江中醫(yī)藥大學學報，2012，36（7）：767-769.

［5］劉永林，周郁鴻，陳益民，等.再生障礙性貧血患者外周血調(diào)節(jié)性T細胞γδT細胞表達分析［J］.浙江中醫(yī)藥大學學報，2012，36（10）：1077-1078.

［6］張之南.血液病診斷及療效標準［M］.第3版.北京：科學技術(shù)出版社，2007：19-21.

［7］Ruiz-Argüelles A，Llorente L.The role of complement regu-Latory proteins（CD55 and CD59）in the pathogenesis of autoimmune hemocytopenias［J］.Autoimmun Rev，2007，6（3）：155-161.

［8］李玉云，昝麗娜，王衛(wèi)國，等.再生障礙性貧血患者PIG-A基因外顯子2、4、5突變及粒細胞CD55、CD59的表達［J］.癌變畸變突變，2009，21（4）：254-257.

（收稿：2015-03-05 修回：2015-04-20）

浙江省中醫(yī)藥科技計劃項目（2013ZB045）

浙江中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院（杭州 310006）

劉永林，13336165550