韓巖智，劉 浩，阮開學

(新疆石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院消化內科 832008)

·論著·

幽門螺桿菌感染小鼠胃黏膜組織細胞因子變化的實驗研究*

韓巖智，劉 浩，阮開學

(新疆石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院消化內科 832008)

目的 研究幽門螺旋桿菌(簡稱幽門螺桿菌)感染小鼠胃黏膜組織細胞因子變化,初步探討幽門螺桿菌感染的免疫機制。方法 選取8～10周齡BALB/c小鼠24只，雌雄各半，分為觀察組和對照組，兩組造模前均禁食12 h，觀察組以2×109CFU/mL濃度的幽門螺桿菌菌液 0.5 mL/d灌胃，連續(xù)7 d。對照組灌胃給生理鹽水，0.5 mL/d，連續(xù)7 d，進行幽門螺桿菌感染小鼠胃黏膜造模。采用實時定量熒光PCR(Real-time PCR)檢測檢測感染2、4周后，小鼠血漿中γ干擾素(IFN-γ)、重組改構人腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素-8(IL-8)以及IL-10 mRNA的表達量，并于感染4周后，處死小鼠，無菌取各組小鼠的胃組織，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗夾心法檢測胃黏膜組織中IFN-γ、TNF-α、IL-8及IL-10蛋白的水平。結果 兩組小鼠感染2周后，觀察組IL-8高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。感染4周后，IFN-γ、TNF-α、IL-8的mRNA及蛋白表達量均明顯上升，但觀察組上升幅度明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論 TH2細胞在幽門螺桿菌感染中的作用表現(xiàn)不明顯，能促進TH1型細胞細胞因子的表達，引發(fā)TH1為主的免疫反應。

螺桿菌，幽門；胃黏膜；細胞因子類；感染

近年來研究發(fā)現(xiàn)，幽門螺旋桿菌(下文簡寫為幽門螺桿菌)與胃潰瘍、胃癌的發(fā)生密切相關[1-2]。細胞因子是指主要由免疫細胞分泌的、能調節(jié)細胞功能的小分子多肽，他們有調節(jié)機體多種細胞的生理功能，在胃腸道黏膜免疫系統(tǒng)中起著至關重要的調控作用[3-4]。本研究采用8～10周齡BALB/c小鼠12只，灌胃給幽門螺桿菌菌液，連續(xù)7 d，進行造模。之后采用實時定量熒光PCR(Real-time PCR)檢測感染2、4周后各小鼠部分細胞因子mRNA的變化及酶聯(lián)免疫吸附試驗夾心法檢測感染4周后小鼠胃黏膜組織中部分細胞因子蛋白的表達量。本文初步探討了幽門螺桿菌感染的免疫機理，旨在為幽門螺桿菌的預防及治療提供部分理論依據(jù)和重要參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取8～10周齡BALB/c小鼠24只，雌雄各12只，體質量18～22 g。分為觀察組和對照組，每組12只。各組小鼠在周齡、體質量、性別構成比以及灌胃給藥操作等方面差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，說明兩組小鼠具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 造模方法 兩組造模前均禁食12 h，觀察組BALB/c小鼠灌胃給2×109CFU/mL濃度的幽門螺桿菌菌液，0.5 mL/d，連續(xù)7 d；對照組灌胃給生理鹽水，0.5 mL/d，連續(xù)7 d[3]。之后正常飼養(yǎng)，自由飲食飲水。

1.2.2 檢測血漿中γ干擾素(IFN-γ)、重組改構人腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素-8(IL-8)以及IL-10的表達量 感染2周后，從各組小鼠眼眶靜脈叢采集小鼠的血液，感染4周后，采集小鼠的血液，并處死小鼠，無菌條件下取各組小鼠的胃黏膜組織。將血液樣本進行離心3 500 r/min。采用Real-time PCR檢測感染2、4周后，小鼠血漿中IFN-γ、TNF-α、IL-8以及IL-10 mRNA表達量。操作方法：首先，血漿總RNA的提取，進行逆轉錄；其次，將得到的cDNA后進行熒光PCR擴增。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗夾心法檢測胃黏膜組織中IFN-γ、TNF-α、IL-8以及IL-10蛋白的水平。取胃黏膜組織，勻漿，取上清液。儀器使用酶標儀，實驗操作步驟嚴格按照試劑盒上的說明進行。

1.2.3 觀察指標 幽門螺桿菌感染小鼠胃黏膜的造模后，分別檢測感染2、4周后小鼠血漿中IFN-γ、TNF-α、IL-8以及IL-10 mRNA的表達量，以及感染4周后，檢測胃黏膜組織中IFN-γ、TNF-α、IL-8以及IL-10蛋白的水平。

2 結果

2.1 感染2周后，兩組小鼠血漿中IFN-γ、TNF-α、IL-8以及IL-10的mRNA表達量 感染2周后，將兩組小鼠血漿中的IFN-γ、TNF-α、IL-8以及IL-10 mRNA表達量進行比較，觀察組IL-8 mRNA的表達量，明顯高于對照組，組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 感染2周后血漿中各指標表達量的比較

2.2 感染4周后，兩組小鼠血漿中IFN-γ、TNF-α、IL-8以及IL-10的mRNA表達量 感染4周后，將兩組小鼠血漿中的IFN-γ、TNF-α、IL-8以及IL-10 mRNA表達量進行比較，IFN-γ、TNF-α以及IL-8的表達量，觀察組明顯高于對照組，組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 感染4周后血漿中各指標表達量的比較

2.3 感染4周后，兩組小鼠胃黏膜組織中IFN-γ、TNF-α、IL-8以及IL-10蛋白水平 感染4周后，將兩組小鼠胃黏膜組織中IFN-γ、TNF-α、IL-8以及IL-10蛋白的水平進行比較，觀察組IFN-γ、TNF-α以及IL-8蛋白的水平明顯高于對照組，組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 感染4周后胃黏膜組織中各指標蛋白水平的比較

3 討論

幽門螺桿菌是一種呈S形或弧形彎曲狀的微需氧細菌，呈革蘭染色陰性[5-6]，寄生于胃黏膜上皮表面及胃內黏膜層腺腔中。有研究發(fā)現(xiàn)，幽門螺桿菌是慢性胃炎和消化性潰瘍的重要致病因素之一[7-9]。本文分析了幽門螺桿菌感染小鼠胃黏膜組織細胞因子變化，初步探討了幽門螺桿菌感染的免疫機制。

本組資料首先進行幽門螺桿菌感染小鼠胃黏膜組織造模，結果顯示，各組小鼠感染2周后，觀察組小鼠血漿中IFN-γ、TNF-α以及IL-10 mRNA表達量和對照組小鼠血漿比較差異無統(tǒng)計學意義，僅IL-8明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。感染4周后，觀察組小鼠血漿中IFN-γ、TNF-α、IL-8以及IL-10的mRNA表達量明顯高于對照組。觀察組胃黏膜組織中IFN-γ、TNF-α、IL-8以及IL-10 mRNA的表達量明顯高于對照組。感染4周后，觀察組胃黏膜組織中IFN-γ、TNF-α、以及IL-8蛋白水平明顯高于對照組。

由于IFN-γ能夠增強各種炎癥細胞如巨噬細胞、中性粒細胞的活性。TNF-α、IL-8均有很強的抗炎活性[10-11]。同時TNF-α能夠正向調節(jié)IL-8的產(chǎn)生。IL-8具有強大的多形核細胞趨化性及激活的功能[12-13]。但感染4周后，無論是血漿中的IL-10 mRNA表達量還是胃黏膜組織中IL-10蛋白的水平與對照組相比較，均無明顯變化。表明IL-10在幽門螺桿菌感染小鼠胃黏膜中上升不明顯，說明幽門螺桿菌感染對TH2型細胞因子表達無明顯作用[14-15]。綜上所述，幽門螺桿菌感染小鼠胃黏膜組織，對TH2細胞作用表現(xiàn)不明顯，但能促進TH1型細胞細胞因子的表達，引發(fā)TH1為主的免疫反應。

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Experimental study of cytokines in gastric mucosa of mice with Helicobacter pylori infection*

HanYanzhi,LiuHao,RuanKaixue

(DepartmentofInternalMedicine,theFirstAffiliatedHospitalofShiheziMedicalUniversity,Shihezi,Xinjiang832008,China)

Objective To study the change of cytokines in gastric mucosa of mice with Helicobacter pylori infection and explore the immune mechanism.Methods Twenty-four 8-10 weeks-old BALB/c mice were randomly divided into observation group and control group.After first 12 hours of fasting,observation group was given 0.5 mL/d Helicobacter pylori bacterial liquid with concentration of 2×109CFU/mL for 7 consecutive days.The control group was fed with 0.5 mL/d saline for 7 consecutive days.Then the mice were infected with Helicobacter pylori gast model was established.Using Real-time PCR to detect the expressions of IFN-γ,TNF-α,IL-8 and IL-10 in murine plasma within 2,4 weeks after infection.And after 4 weeks of infection,mice were sacrificed,and their stomach tissue sterile were separated.ELISA was used to detect the levels of IFN-γ,TNF-α,IL-8,and IL-10 mRNA in gastric mucosa.Results There was significantly difference between groups 2 weeks after infection(P<0.05).With lastingness of infection,the expression and the mRNA of IFN-γ,TNF-α,IL-8 were significantly increased,and the rate of increase of observation group was higher(P<0.05).Conclusion TH2 cells may have no effect on Helicobacter pylori infection in mice gastric mucosa and promote the expression of TH1-type cytokines,triggering immune response of TH1.

Helicobacter pylori;gastric mucosa;cytokines;infection

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.03.002

國家自然科學基金資助項目(49201065)。 作者簡介： 韓巖智(1981-),主治醫(yī)師,碩士，主要從事消化內科及消化疾病內鏡診療方向研究。

R332

A

1671-8348(2015)03-0293-02

2014-09-08

2014-11-21)