孫明立，逄 蕾，鞠學(xué)鵬，孫海剛，余澗坤，趙海山，姚維范，魏敏杰

ω-3魚(yú)油脂肪乳對(duì)輻射損傷小鼠造血系統(tǒng)保護(hù)作用的研究

孫明立，逄 蕾，鞠學(xué)鵬，孫海剛，余澗坤，趙海山，姚維范，魏敏杰*

目的 研究ω-3魚(yú)油脂肪乳對(duì)電離輻射引起小鼠骨髓損傷的影響，旨在闡明ω-3魚(yú)油脂肪乳對(duì)輻射性造血損傷的保護(hù)作用。方法 采用直線加速器一次性6.0 Gy全身照射ICR小鼠，建立輻射損傷小鼠模型。取各組小鼠外周血用于白細(xì)胞(WBC)和血小板(PLT)計(jì)數(shù)，取骨髓進(jìn)行瑞氏-吉姆薩染色觀察骨髓象改變，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)骨髓細(xì)胞凋亡百分率，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)骨髓細(xì)胞凋亡抑制因子 BCL-XL的表達(dá)。結(jié)果 與空白對(duì)照組(BC組)相比，生理鹽水組(NS組)小鼠外周血WBC和PLT計(jì)數(shù)均明顯減少(P<0.05)，骨髓增生降低，早期及晚期凋亡率顯著增加(P<0.05)，凋亡抑制因子BCL-XL表達(dá)降低；與生理鹽水組相比，ω-3魚(yú)油脂肪乳(ω-3組)可顯著提高小鼠外周血WBC和PLT計(jì)數(shù)(P<0.05)，促進(jìn)骨髓增生，抑制骨髓細(xì)胞凋亡率(P<0.05)，增加凋亡抑制因子BCL-XL的表達(dá)。結(jié)論 ω-3魚(yú)油脂肪乳可以促進(jìn)骨髓造血系統(tǒng)恢復(fù)，對(duì)輻射導(dǎo)致的造血系統(tǒng)損傷具有良好的保護(hù)作用。

輻射損傷； 造血系統(tǒng)； 細(xì)胞凋亡；ω-3魚(yú)油脂肪乳

0 引言

隨著社會(huì)的進(jìn)步，輻射給環(huán)境和人類(lèi)健康帶來(lái)越來(lái)越多的危害，其不僅可引起放射病、 內(nèi)分泌紊亂、 免疫功能低下等近期不良反應(yīng)，還可誘發(fā)血液病等遠(yuǎn)期不良反應(yīng)。ω-3 魚(yú)油脂肪乳(尤文)是目前臨床上常用的脂肪乳，主要由α-亞麻酸、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)等組成。目前，關(guān)于ω-3 魚(yú)油脂肪乳的研究主要集中于其調(diào)控機(jī)體炎癥和免疫功能[1-2]，而對(duì)于其在骨髓造血系統(tǒng)方面的研究報(bào)道少見(jiàn)。本研究擬通過(guò)探討ω-3 魚(yú)油脂肪乳對(duì)X射線誘導(dǎo)的小鼠骨髓輻射損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制，為ω-3魚(yú)油脂肪乳用于輻射防護(hù)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 ICR小鼠24只，雌雄各半，體重18～20 g，購(gòu)于吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，室溫普通飼料飼養(yǎng)，自由飲水進(jìn)食。

1.2 主要試劑及儀器 ω-3魚(yú)油脂肪乳(華瑞制藥有限公司)；Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒(北京寶賽生物技術(shù)有限公司)；碘化丙啶(美國(guó)Sigma公司)；兔抗鼠BCL-XL多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)；DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；瑞氏-吉姆薩染液(上海生工生物工程股份有限公司)；PRIMUS-K型X射線治療機(jī)(德國(guó)SIEMENS公司)；KX-21N型全自動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(日本SYSMEX公司)；FACS Calibur流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理 將小鼠按體重隨機(jī)分組如下：①空白對(duì)照組(BC組)；②生理鹽水組(NS組)；③ω-3魚(yú)油脂肪乳組(ω-3組)。ω-3組小鼠尾靜脈注射ω-3魚(yú)油脂肪乳15 mL/kg，BC組及NS組注射等量的生理鹽水，1次/d，連續(xù)給藥4 d。給藥第3天，NS組和ω-3組小鼠給予X線一次性全身照射，照射劑量6.0 Gy，BC組小鼠給予假照射。照射后第1天，處死各組小鼠，取外周血及骨髓用于后續(xù)檢測(cè)。

1.4 白細(xì)胞及血小板計(jì)數(shù) 照射后第1天，采用摘眼球采血法取小鼠外周血，用4%的EDTA抗凝，全自動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)計(jì)數(shù)WBC及PLT。

1.5 小鼠骨髓象分析 照射后第1天，取小鼠胸骨，用鑷子擠壓出骨髓，用15 μL的BSA稀釋?zhuān)d玻片上推片，晾干后，采用瑞氏-吉姆薩染色法染色，光鏡下觀察骨髓象變化。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡 照射后第1天，取骨髓并分離單細(xì)胞懸液， PBS洗2遍，棄上清，用200 μL的Bending Buffer重懸沉淀，每個(gè)樣品中分別加入10 μL Annexin V-FITC和5 μL PI染液，室溫避光孵育15 min，加入300 μL PBS，上機(jī)進(jìn)行檢測(cè)，利用CellQuest 3.0軟件分析數(shù)據(jù)。

1.7 免疫組化骨髓細(xì)胞中BCL-XL的表達(dá) 照射后第1天，將骨髓單細(xì)胞懸液用PBS洗2遍，棄上清，加入1 mL Tris-HCL，8 min后離心去上清，PBS重懸后制備細(xì)胞涂片。免疫組織化學(xué)檢測(cè)、光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠骨髓細(xì)胞BCL-XL表達(dá)量的變化。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，采用student-Newman-Keuls法進(jìn)行組間比較；設(shè)定檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05，P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ω-3魚(yú)油脂肪乳對(duì)輻射小鼠外周血中WBC和PLT計(jì)數(shù)的影響 照射后第1天，NS組小鼠外周血WBC和PLT計(jì)數(shù)均較BC組顯著降低(P<0.05)；ω-3組小鼠外周血WBC和PLT計(jì)數(shù)較NS組顯著升高(P<0.05)，但仍低于BC，如圖1所示。

圖1 各組小鼠WBC和PLT計(jì)數(shù)結(jié)果(n=8)

A.WBC計(jì)數(shù)，B.PLT計(jì)數(shù)

2.2 ω-3魚(yú)油脂肪乳對(duì)輻射小鼠骨髓象的影響 BC組小鼠骨髓象為正常骨髓象；照射后第1天，NS組小鼠骨髓增生顯著抑制，表現(xiàn)為增生減低，粒紅比降低，造血細(xì)胞減少，成熟紅細(xì)胞大小一致，無(wú)明顯淡染區(qū)等變化；ω-3組小鼠骨髓增生較NS組顯著增加，但仍低于BC組，如圖2所示。

圖2 各組小鼠骨髓象(瑞氏-吉姆薩染色法，1 000×)

2.3 ω-3魚(yú)油脂肪乳對(duì)輻射小鼠骨髓細(xì)胞凋亡的影響 照射后第1天，NS組小鼠骨髓細(xì)胞早期凋亡率和晚期凋亡率均較BC組顯著增加(P<0.05)；ω-3組小鼠骨髓早期凋亡率和晚期調(diào)亡率均較NS組降低(P<0.05),如圖3所示。

圖3 各組小鼠骨髓細(xì)胞凋亡百分比(n=3)

2.4 ω-3魚(yú)油脂肪乳對(duì)輻射小鼠骨髓細(xì)胞中BCL-XL表達(dá)的影響 BC組小鼠骨髓細(xì)胞BCL-XL呈陽(yáng)性表達(dá)。照射后第1天，NS組小鼠骨髓細(xì)胞BCL-XL表達(dá)顯著降低，幾乎為陰性表達(dá)；ω-3組小鼠骨髓細(xì)胞BCL-XL表達(dá)較NS組增加，但仍低于BC組，如圖4所示。

3 討論

ω-3多不飽和脂肪酸(PUFA)是ω-3魚(yú)油脂肪乳的主要成分，包括二十五碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞膜磷脂類(lèi)，如花生四烯酸類(lèi)物質(zhì)和細(xì)胞因子等水解產(chǎn)生的生物活性。ω-3魚(yú)油脂肪乳能對(duì)患者的免疫功能和臨床指標(biāo)產(chǎn)生有益的影響[3-4]。本研究發(fā)現(xiàn)，ω-3魚(yú)油脂肪乳在輻射損傷后造血系統(tǒng)的修復(fù)中起重要作用。

圖4 各組小鼠骨髓細(xì)胞BCL-XL表達(dá)(免疫組化SP法,1 000×)

電離輻射對(duì)骨髓的損傷主要表現(xiàn)為造血功能的障礙，而造血功能障礙主要表現(xiàn)為以WBC和PLT為主的全血細(xì)胞減少[5]。因此，本研究首先考察ω-3魚(yú)油脂肪乳對(duì)輻射小鼠外周血中WBC和PLT計(jì)數(shù)的影響，結(jié)果顯示，與BC組比較，NS組的WBC和PLT計(jì)數(shù)顯著降低；與NS組比較，ω-3組小鼠外周血中WBC和PLT計(jì)數(shù)顯著增加。骨髓象是反映骨髓造血能力的直觀指標(biāo)。本研究進(jìn)一步觀察了照射后骨髓象的變化及ω-3魚(yú)油脂肪乳對(duì)其的影響，結(jié)果顯示，ω-3魚(yú)油脂肪乳可部分逆轉(zhuǎn)輻射所致的骨髓增生減慢，這與對(duì)外周血中WBC和PLT計(jì)數(shù)的影響結(jié)果一致，提示ω-3魚(yú)油脂肪乳對(duì)造血系統(tǒng)具有保護(hù)作用。

研究表明， 電離輻射不僅可導(dǎo)致細(xì)胞衰老，還可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6-7],且細(xì)胞凋亡是輻射所致骨髓細(xì)胞死亡的主要方式。Bcl-2蛋白家族與凋亡的發(fā)生關(guān)系密切，可分為2類(lèi)：凋亡抑制基因，包括Bcl-2和BCL-XL等；凋亡促進(jìn)基因，包括Bax等。Bcl-2和BCL-XL具有同源性，共同表達(dá)于造血細(xì)胞，但二者作用有差異。BCL-XL高表達(dá)于早期造血干細(xì)胞， 是支持早期造血干細(xì)胞存活的主要效應(yīng)蛋白，是原始或定向紅系祖細(xì)胞成熟所必需的成分[8]，同時(shí)也能維持未成熟巨核系祖細(xì)胞的存活與分化[9]，而B(niǎo)cl-2在早期造血干細(xì)胞中的表達(dá)僅1%～4%。本研究觀察了輻射引起骨髓細(xì)胞凋亡的情況，檢測(cè)凋亡抑制因子BCL-XL表達(dá)的變化及ω-3魚(yú)油脂肪乳對(duì)其的影響，以探討ω-3魚(yú)油脂肪乳對(duì)輻射所致造血系統(tǒng)損傷的保護(hù)作用機(jī)制。結(jié)果顯示，輻射可引起骨髓細(xì)胞凋亡明顯增加、凋亡抑制因子BCL-XL表達(dá)降低，而ω-3魚(yú)油脂肪乳可抑制骨髓細(xì)胞凋亡、促進(jìn)BCL-XL表達(dá)。表明電離輻射可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，ω-3魚(yú)油脂肪乳可通過(guò)促進(jìn)凋亡抑制因子BCL-XL表達(dá)抑制骨髓細(xì)胞的凋亡。

總之，ω-3魚(yú)油脂肪乳可通過(guò)促進(jìn)凋亡抑制因子BCL-XL表達(dá)抑制骨髓細(xì)胞的凋亡，改善骨髓的造血狀況，加快骨髓造血功能的恢復(fù)，值得臨床應(yīng)用，但其確切的作用機(jī)制有待于進(jìn)一步探討。

[1] 胡國(guó)強(qiáng)，陳威.含ω-3魚(yú)油脂肪乳的腸外營(yíng)養(yǎng)液對(duì)胃腸道腫瘤病人術(shù)后免疫與炎性因子的影響[J].腸外與腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng),2015,(1):16-19.

[2] 佟飛,高夢(mèng)穎,王霞,等.ω-3魚(yú)油脂肪乳對(duì)嚴(yán)重腹腔感染患者免疫功能的影響[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2014,36(10):1108-1110.

[3] 胡國(guó)強(qiáng),陳威.含ω-3魚(yú)油脂肪乳的腸外營(yíng)養(yǎng)液對(duì)胃腸道腫瘤病人術(shù)后免疫與炎性因子的影響[J].腸外與腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng),2015,22(1):16-19.

[4] 唐衛(wèi)東,陳琪,邵雪波,等.ω-3魚(yú)油脂肪乳劑對(duì)膿毒癥患者炎癥反應(yīng)和免疫功能的影響[J].全科醫(yī)學(xué)臨床與教育，2015,13(1):19-21.

[5] 周永,糜漫天,楊鎮(zhèn)洲,等.染料木素對(duì)小鼠輻射造血損傷保護(hù)作用的研究[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006,28(24):2406-2409.

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Protective effect of Omega-3 fish oil fat emulsion on hematopoietic system of mouse suffering radiation injury

SUN Ming-li,PANG Lei,JU Xue-peng,SUN Hai-gang,YU Jian-kun,ZHAO Hai-shan,YAO Wei-fan,WEI Min-jie*

(Department of Pharmacology,School of Pharmacy,China Medical University,Shenyang 110122,China)

Objective To observe the effect of Omega-3 fish oil fat emulsion on mouse bone marrow injury induced by ionizing radiation and to elucidate the protective effects of Omega-3 fish oil fat emulsion on hematopoietic injury caused by radiation.Methods The animal model of radiation injury was established by applying one dose of 6.0 Gy whole-body ionizing radiation by linear accelerator on ICR mice.The peripheral blood was collected to count white blood cell(WBC)and platelet(PLT).Marrow was collected to observe the changes of bone marrow by Wright-Giemsa staining.The apoptosis of bone marrow cell was detected by flow cytometry.The expression of BCL-XL in bone marrow cells was detected by immunocytochemical method.Results Compared with that in the blank control group(BC group),WBC and PLT count in peripheral blood of the normal saline group(NS group)significantly reduced(P<0.05),bone marrow hyperplasia reduced,early and late apoptosis rate increased significantly(P<0.05),BCL-XL decreased.Compared with that in NS group,omega-3 fish oil fat emulsion(omega-3 group)can significantly improve the peripheral blood WBC and PLT count(P<0.05),promote the proliferation of bone marrow,significantly inhibit the apoptosis rate of bone marrow cells(P<0.05),increase the expression of BCL-XL.Conclusion Omega-3 fish oil fat emulsion can promote the recovery of the injured bone marrow hematopoietic system,exert a good protective effect on the radiation injury of hematopoietic system.

Radiation injury;Hematopoietic system;Cell apoptosis;Omega-3 fish oil fat emulsion

2014-11-25

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室，沈陽(yáng) 110122

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201506004