王建美陳菲盛柳青葉其蓁

1.金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院藥學(xué)部，浙江金華321000；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥劑科，浙江溫州325000

甲潑尼松龍對多索茶堿在大鼠體內(nèi)藥動學(xué)的影響

王建美1陳菲1盛柳青1葉其蓁2

1.金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院藥學(xué)部，浙江金華321000；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥劑科，浙江溫州325000

目的考察單次尾靜脈注射甲潑尼松龍對大鼠體內(nèi)多索茶堿藥動學(xué)的影響。方法將12只雄性大鼠隨機(jī)分成多索茶堿組及合并用藥組，用反相高效液相色譜法（RP-HPLC）測定大鼠給藥前后不同時(shí)間點(diǎn)多索茶堿的血清濃度，通過PK Solver 2.0軟件擬合計(jì)算，對兩組大鼠的多索茶堿主要藥動學(xué)參數(shù)進(jìn)行比較。結(jié)果兩組大鼠多索茶堿AUC0～t、AUC0～∞、t1/2比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），合并用藥組較單獨(dú)用藥組均增加；而Cl_obs合并用藥組較多索茶堿組減少。結(jié)論甲潑尼松龍可能對多索茶堿在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)有影響，會減慢其體內(nèi)的代謝和消除。

甲潑尼松龍；多索茶堿；藥動學(xué)；反相高效液相色譜法

多索茶堿是具有抗炎平喘作用的新一代甲基黃嘌呤的衍生物，通過抑制平滑肌細(xì)胞內(nèi)的磷酸二酯酶達(dá)到擴(kuò)張支氣管、松弛平滑肌的作用，本品與茶堿和氨茶堿比較，具有療效強(qiáng)、毒性較低的特點(diǎn)，臨床上廣泛用于治療支氣管哮喘、支氣管炎、間質(zhì)性肺炎等慢性阻塞性肺疾病[1-4]。糖皮質(zhì)激素具有抗炎、抗過敏、抗休克、抗毒等藥理作用，甲潑尼松龍作為人工合成的中效糖皮質(zhì)激素，有較強(qiáng)的抗炎活性，并有較高的肺部濃度，能減輕慢性阻塞性肺疾病患者的急性炎癥和氣道阻塞。有文獻(xiàn)報(bào)道，臨床上聯(lián)合使用兩者能有效控制各種慢性阻塞性肺疾病的癥狀[5-7]。聯(lián)合用藥所致藥動學(xué)變化的研究已成為合理用藥的一個(gè)重要領(lǐng)域，多索茶堿是茶堿類藥物，治療窗比較窄，且影響其代謝的因素及藥物較多，如張文穎等[8]研究了大鼠體內(nèi)阿魏酸鈉對多索茶堿的藥動學(xué)影響，但關(guān)于甲潑尼松龍對多索茶堿藥動學(xué)影響問題未見文獻(xiàn)報(bào)道。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)建立了一種同時(shí)測定甲潑尼松龍和多索茶堿濃度的反相高效液相色譜法，研究多索茶堿及其與甲潑尼松龍聯(lián)用時(shí)大鼠體內(nèi)藥動學(xué)參數(shù)，為進(jìn)一步研究甲潑尼松龍?jiān)谌梭w內(nèi)對多索茶堿的影響提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

2487型HPLC儀（美國Waters公司，包括Breeze色譜工作站，2487紫外檢測器，20μl自動進(jìn)樣閥）；SB30001電子天平；1004型分析電子天平；TDL80-2型離心沉淀器；WH-90A微型旋渦混合器；多索茶堿對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：100625-201202）；甲潑尼松龍對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：100828-200501）；氫化可的松對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：100152-200206）；注射用多索茶堿（開封康諾藥業(yè)有限公司，規(guī)格0.3 g，批號：D142823）；注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉（Pfizer Manufacturing Belgium NV，規(guī)格40 mg，批號：A06793）；甲醇、乙腈為色譜純；水為重蒸餾水；其他試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)對象

健康雄性SD大鼠12只，清潔級，體重300～320 g，浙江省實(shí)驗(yàn)動物中心提供。大鼠隨機(jī)分成多索茶堿組及甲潑尼松龍和多索茶堿聯(lián)合用藥組，每組6只。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件色譜柱為Diamonsil C18柱（150mm× 4.6mm，5μm），流動相為乙腈-0.1%磷酸緩沖溶液（含1mol/L氫氧化鈉，pH 3.8）（28∶72），檢測波長為263 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為20μl，流速為1.0 ml/min，內(nèi)標(biāo)物為氫化可的松。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制精密稱取內(nèi)標(biāo)氫化可的松10mg，加甲醇溶解并定容至10ml容量瓶，使成1.0 mg/m l的內(nèi)標(biāo)儲備液。精密稱取多索茶堿25 mg，用甲醇溶解并定容至25 ml容量瓶，使成1.0 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。放置于4℃冰箱中備用。

取多索茶堿標(biāo)準(zhǔn)儲備液適量，置于加有定量內(nèi)標(biāo)氫化可的松和大鼠血清0.5 ml的離心管中，用甲醇配成濃度分別為50、25、12、6、3、1.5、0.8、0.4μg/ml的含藥血清，渦旋混合1min，10 000 r/min離心10 min，靜置20min，取上清液過濾，進(jìn)樣20μl[9]。

1.3.3 藥動學(xué)實(shí)驗(yàn)多索茶堿組：多索茶堿用注射用氯化鈉溶解，通過尾靜脈單劑量一次注射多索茶堿50mg/kg。給藥前取空白血，給藥后按10、30、60、90、120、180、240、300、360 min眼眶取血約0.6 ml，37℃水浴中放置2 h后，于離心機(jī)中3000 r/min低溫離心5min，吸取血清，將血清儲存在－20℃待測。

合并用藥組：甲潑尼松龍用自帶的稀釋液稀釋。通過尾靜脈同時(shí)給予甲潑尼松龍100 mg/kg和多索茶堿50 mg/kg，給藥后按前述時(shí)間點(diǎn)從眼眶取血約0.6ml，按前述“多索茶堿組”方法處理樣本，以測定各時(shí)間點(diǎn)多索茶堿的血藥濃度。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理藥動學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用PK Solver 2.0藥動學(xué)軟件計(jì)算程序擬合，求出主要藥動學(xué)參數(shù)，計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

圖1 空白血清色譜圖

圖2 空白血清+多索茶堿+內(nèi)標(biāo)氫化可的松+甲潑尼松龍色譜圖

2.1 方法的專屬性

按“1.3.1色譜條件”測定大鼠空白血清色譜圖見圖1；大鼠空白血清+多索茶堿+內(nèi)標(biāo)氫化可的松+甲潑尼松龍的色譜圖見圖2。多索茶堿、內(nèi)標(biāo)氫化可的松和甲潑尼松龍的保留時(shí)間分別為：3.974、12.846、21.607 min，三者峰型良好，分離完全，另外血清中的內(nèi)源性物質(zhì)對待測物出峰也不造成干擾。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果

對“1.3.2”配制的多索茶堿溶液進(jìn)行高效液相色譜分析，相關(guān)圖譜見圖3，以測得多索茶堿峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比Y對血清藥物濃度X（μg/ml）進(jìn)行線性回歸，重復(fù)測定5次，得多索茶堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.0814X－0.0466（r=0.9997），線性范圍為0.8～50μg/ml，最低檢測濃度為0.4μg/ml。

圖3 合并用藥組給藥后30 m in色譜圖

2.3 回收率和精密度試驗(yàn)

取空白血清200μl，精密加入適量多索茶堿，制備成高中低三個(gè)濃度的多索茶堿標(biāo)準(zhǔn)血清樣品（含多索茶堿分別為30、7.5、1μg/ml和20、5、0.5μg/ml），按“1.3.2”項(xiàng)下自“渦旋混合1 min”起處理后進(jìn)行分析。在1 d之內(nèi)連續(xù)測定5次計(jì)算日內(nèi)精密度（用日內(nèi)RSD表示），連續(xù)測定3 d計(jì)算日間精密度（用日間RSD表示），結(jié)果見表1。

表1 多索茶堿回收率與精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=5）

2.4 藥動學(xué)結(jié)果

采用非房室模型對兩組大鼠的單次尾靜脈注射多索茶堿50mg/kg后血藥濃度數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，其中峰濃度和達(dá)峰時(shí)間采用實(shí)測值，兩組的具體藥動學(xué)參數(shù)見表2，平均血藥濃度（n=6）的藥時(shí)曲線見圖4。與多索茶堿組比較，合并用藥組半衰期（t1/2）、達(dá)峰濃度（Cmax）、AUC0～t、AUC0～∞上升，血漿清除率（Cl_obs）下降。兩組的t1/2、AUC0～t、AUC0～∞比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表2）。

表2 合用甲潑尼松龍前后多索茶堿藥動學(xué)參數(shù)變化

圖4 合用甲潑尼松龍前后多索茶堿平均血藥濃度的藥時(shí)曲線

3 討論

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的取血點(diǎn)是通過學(xué)習(xí)相關(guān)參考文獻(xiàn)[10-14]，并進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)確定。在血清除蛋白方法建立實(shí)驗(yàn)過程中，選用過文獻(xiàn)報(bào)道的三氯醋酸、高氯酸作為蛋白沉淀劑，以減少血清中待測物的稀釋倍數(shù)，提高回收率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，上述方法血清內(nèi)源性雜質(zhì)對樣品峰干擾大，檢出面積小，降低了靈敏度，且不利于保護(hù)色譜柱。采用2倍體積的甲醇沉淀蛋白，方法簡單，色譜峰峰型較好，回收率高且血清內(nèi)源性物質(zhì)不影響待測物和內(nèi)標(biāo)的測定。

《FDA藥物相互作用研究指南（草案）》體內(nèi)藥物相互作用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)提出[15]，體內(nèi)藥物藥動學(xué)研究通常采用比較藥物濃度在有和沒有合用藥物時(shí)的變化情況。根據(jù)指南設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)，單次尾靜脈注射多索茶堿組和同時(shí)注射甲潑尼松龍與多索茶堿組。比較兩組藥動學(xué)參數(shù)發(fā)現(xiàn)，多索茶堿的t1/2從單用藥組的108.71min增加到175.09 min，AUC0～t從1359.22μg/（ml·min）增加到1771.86μg/（ml·min），Cmax略有上升，而Cl_obs則從3.33×10-2L/（min·kg）降低到1.95×10-2L/（min·kg）。筆者認(rèn)為多索茶堿和甲潑尼松龍?jiān)诟嗡幟复x上的相互作用可能是合并用藥組多索茶堿t1/2明顯延長、AUC0～t明顯增加的原因。有研究表明，茶堿類藥物的代謝酶主要為肝微粒體代謝酶CYP1A2[16-17]，肝藥酶P450的活性受多種因素影響，如給藥劑量、用藥方式、藥物劑型以及種族差異等因素。雖然未見甲潑尼松龍?bào)w內(nèi)代謝情況的報(bào)道，但有文獻(xiàn)報(bào)道[18]，大劑量皮質(zhì)激素潑尼松的穩(wěn)態(tài)血藥濃度會對肝藥酶P450產(chǎn)生抑制。本實(shí)驗(yàn)從甲潑尼松龍合并用藥組AUC0～t的明顯上升推測，甲潑尼松龍可能會對肝藥酶產(chǎn)生影響。多索茶堿的藥動學(xué)研究結(jié)果差異較大，多索茶堿藥時(shí)曲線符合一室、二室模型的都有報(bào)道[19-20]，且藥動學(xué)參數(shù)差異較大，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，甲潑尼松龍100mg劑量可能減慢多索茶堿的消除，也可能是多索茶堿在不同大鼠體內(nèi)的個(gè)體差異引起。關(guān)于甲潑尼松龍對人體內(nèi)多索茶堿藥動學(xué)的影響需經(jīng)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

[1]羅莉蓉.氨茶堿與多索茶堿治療慢性阻塞性肺疾病療效對比觀察[J].臨床合理用藥雜志，2015，8（2）：75-76.

[2]Sankar J，Lodha R，Kabra SK.Doxofylline：the nextgenerationmethylxanthine[J].Indian JPediatr，2008，75（3）：251-254.

[3]譚磊.多索茶堿與氨茶堿治療支氣管哮喘臨床療效的對比觀察[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué)，2012，18（8）：11-12.

[4]郭春麗.甲潑尼龍琥珀酸鈉治療慢性阻塞性肺疾病急性加重期98例[J].陜西醫(yī)學(xué)雜志，2012，40（2）：242-243.

[5]張冠磊.甲基強(qiáng)的松龍聯(lián)合多索茶堿治療COPD急性加重期療效分析[J].現(xiàn)代診斷與治療，2013，24（6）：1306-1307.

[6]陳莉亞.多索茶堿聯(lián)合甲強(qiáng)龍治療毛細(xì)支氣管炎療效觀察[J].中國現(xiàn)代醫(yī)生，2011，49（27）：80-81.

[7]孫偉，曹志新.慢性阻塞性肺疾病的藥物治療進(jìn)展[J].中國臨床醫(yī)生，2013，42（2）：12-14.

[8]張文穎，徐彩虹，周虹，等.多索茶堿與阿魏酸鈉藥物動力學(xué)相互作用研究[J].中國藥劑學(xué)雜志，2009，7（4）：318-327.

[9]翁愛彬，方劍英，鄭荔莉.RP-HPLC法同時(shí)測多索茶堿和3種抗癲癇藥血藥濃度[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，33（6）：79-81.

[10]顧健，李玉珍.多索茶堿與莫西沙星在大鼠體內(nèi)藥動學(xué)的相互作用[J].中國藥學(xué)雜志，2003，38（4）：285-289.

[11]張峻，姚勤，周瓊.RP-HPLC法同時(shí)測定人血漿中茶堿和多索茶堿的濃度[J].中國藥房，2010，21（42）：3974-3975.

[12]李朵璐，闞全程，劉玲.左氧氟沙星對多索茶堿在健康人體內(nèi)藥動學(xué)的影響[J].中國新藥與臨床藥學(xué)雜志，2008，27（9）：680-683.

[13]馮瑞華，李志強(qiáng)，苑振亭.西尼地平對多索茶堿在大鼠體腸內(nèi)吸收的影響[J].中國藥房，2007，10（11）：1058-1060.

[14]郭利，楊秀嶺，王淑梅，等.丁苯酞對大鼠體內(nèi)多索茶堿藥動學(xué)的影響[J].中國藥房，2013，24（25）：2337-2339.

[15]劉治軍，傅得興，湯光.FDA藥物相互作用研究指南（草案）2006版解讀[J].國際藥學(xué)研究雜志，2008，35（1）：5-6.

[16]Stavaric B.Methylxanthines：toxicity to humans.1.Theophylline[J].JChem Toxicol，1988，26（6）：541-565.

[17]胡曼曼，胡國新，周曙華.葛根素注射液對多索茶堿在大鼠體內(nèi)藥動學(xué)的影響[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2013，32（2）：149-151.

[18]石大偉，高曉春.甲強(qiáng)龍對環(huán)孢素A在兔體內(nèi)的藥動學(xué)影響[A]//2011年浙江省醫(yī)學(xué)會臨床藥學(xué)分會學(xué)術(shù)年會論文匯編[C].2011：128-130.

[19]闞全程，李朵璐，師秀琴.HPLC測定慢性阻塞性肺疾病患者血清中多索茶堿濃度及其藥動學(xué)研究[J].藥物分析雜志，2009，29（5）：845-848.

[20]袁雅冬，趙芳，王淑梅.左氧氟沙星對慢性阻塞性肺疾病急性加重患者的多索茶堿血藥濃度的影響研究[J].中國藥房，2012，23（34）：3206-3209.

Effect of methylprednisolone on the pharmacokinetics of doxofylline in rats

WANG Jian-mei1CHEN Fei1SHENG Liu-qing1YEQi-zhen2
1.Department of Pharmacy,School of Medicine,Jinhua College of Profession and Technology in Zhejiang Province,Jinhua 321000,China;2.Department of Pharmacy,the First Affiliated Hospital ofWenzhou Medical University in Zhejiang Province,Wenzhou 325000,China

Objective To study the effect of single dosemethylprednisolone on the pharmacokinetics of doxofylline in rats.M ethods Male ratswere randomly divided into doxophylline group and combined treatment group(doxophylline+ methylprednisolone).RP-HPLCmethod was adopted to determine the serum concentration for different time before and after administration of doxofylline.Pharmacokinetic parameterswere calculated by PK Solver 2.0 pharmacokinetics software.Pharmacokinetic parameterswere compared between two groups of rats.Results The two groups had statistical difference in ratswith AUC0～t,AUC0～∞,t1/2(P<0.05).The indexs of combined treatment group were increased than that of doxophylline group,Cl_obs group of combined treatment group was decreased compared with doxofylline group.Conclusion Methylprednisolone has influence on the pharmacokinetics of doxofylline in rats,will slow the body′smetabolism and elimination.

Methylprednisolone;Doxofylline;Pharmacokinetics;RP-HPLC

R969.1

A

1674-4721（2015）04（c）-0022-04

2015-02-28本文編輯：李亞聰）

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014KYA218）