鐘 杰， 賈 君， 楊萬舉

外源性H2O2對(duì)大鼠純化視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活及軸突生長(zhǎng)的影響

鐘 杰， 賈 君， 楊萬舉

武漢市中心醫(yī)院眼科，武漢 430014

目的 研究外源性H2O2對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（retinal ganglion cells，RGCs）存活和軸突生長(zhǎng)狀況的影響及其與神經(jīng)微絲蛋白NF－H表達(dá)變化的關(guān)系，探討H2O2的氧化應(yīng)激引起RGCs損傷的機(jī)制。方法 純化培養(yǎng)SD乳鼠RGCs，應(yīng)用不同濃度H2O2（250、500μmol／L）分別作用4、8、24、32h后測(cè)定存活、有突起的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)及其最長(zhǎng)突起長(zhǎng)度。采用免疫組織化學(xué)染色加圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)H2O2對(duì)RGCs表達(dá)神經(jīng)微絲蛋白NF－H的影響。結(jié)果 純化培養(yǎng)的SD大鼠RGCs純度可達(dá)96.24%。H2O2以濃度和時(shí)間依賴的方式影響純化培養(yǎng)的RGCs存活數(shù)，500μmol／L的H2O2在32h可以導(dǎo)致RGCs存活數(shù)下降約50%。同時(shí)，500μmol／L H2O2孵育后RGCs細(xì)胞軸突長(zhǎng)度與對(duì)照組比較明顯減短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），且減短程度隨時(shí)間延長(zhǎng)而增大；NF－H表達(dá)差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），且NF－H在RGCs中分布紊亂。結(jié)論 H2O2的氧化應(yīng)激損傷能夠以時(shí)間和濃度依賴的方式影響純化培養(yǎng)的RGCs存活，可影響RGCs軸突生長(zhǎng)，這可能與其下調(diào)RGCs中神經(jīng)微絲蛋白的表達(dá)有關(guān)。

視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞； 外源性過氧化氫； 細(xì)胞存活； 軸突； 神經(jīng)微絲蛋白

目前關(guān)于青光眼視神經(jīng)損害的發(fā)病機(jī)制有很多學(xué)說，其中氧化應(yīng)激反應(yīng)損傷在青光眼的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用［1－2］。視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（retinal ganglion cells，RGCs）的死亡和神經(jīng)纖維的丟失是青光眼的特征性病理改變，但其發(fā)生機(jī)制尚不完全清楚［3］。神經(jīng)微絲蛋白－H（neurofilament proteins，NF－H）是神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突的標(biāo)志性蛋白，參與神經(jīng)細(xì)胞軸突生長(zhǎng)過程，起到維持軸突直徑的作用［45］。因此，氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)RGCs的影響可能與調(diào)節(jié)NF－H的表達(dá)有關(guān)。我們以不同濃度的外源性H2O2作用于RGCs，檢測(cè)經(jīng)體外純化培養(yǎng)的RGCs存活數(shù)和軸突生長(zhǎng)狀況，觀察NF－H表達(dá)水平的變化趨勢(shì)，進(jìn)一步探討青光眼的發(fā)生機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 RGCs純化培養(yǎng)和鑒定

1.1.1 取材 由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供20只生后1～3d的清潔級(jí)SD乳鼠，處死后取出眼球，解剖顯微鏡下鈍性分離視網(wǎng)膜組織并剪碎。加0.125%胰蛋白酶（含0.1g／L的DNA酶，美國Sigma公司），在37℃下消化10～15min。加含20%胎牛血清（杭州四季青公司）的DMEM／F12（美國Hyclone公司）培養(yǎng)液終止消化，離心半徑8cm，900r／min離心8min，棄上清液，加完全培養(yǎng)液，制成單細(xì)胞懸液，接種至直徑100mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)。

1.1.2 三步法純化 取第1培養(yǎng)皿，預(yù)先以1∶100羊抗鼠IgG抗體室溫包被，24h后用不含血清的DMEM／F12培養(yǎng)液漂洗3次；用1∶100小鼠抗大鼠Thyl.1OX－7單克隆抗體（美國Chemicon公司）室溫下包被，24h后再以不含血清的DMEM／F12培養(yǎng)液漂洗3次，在包被好的培養(yǎng)皿內(nèi)加入視網(wǎng)膜單細(xì)胞懸液及DMEM／F12培養(yǎng)液，37℃條件下培養(yǎng)30min，使RGCs與Thyl.1單克隆抗體充分結(jié)合；用0.125%胰蛋白酶消化后，完全培養(yǎng)液終止消化，離心半徑8cm，900r／min離心5min。培養(yǎng)液重懸，細(xì)胞以4×107／L的終濃度接種入第2培養(yǎng)皿（預(yù)鋪多聚賴氨酸，美國Sigma公司的清潔蓋玻片），培養(yǎng)12h后加入終濃度為10μmol／L的阿糖胞苷（以抑制星型膠質(zhì)細(xì)胞和非神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)），即為純化的RGCs。純化后培養(yǎng):培養(yǎng)24h的純化RGCs的蓋玻片移入第3培養(yǎng)皿（含單層第2代星型膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液），48h換液1次，換半量培養(yǎng)液。

1.1.3 細(xì)胞鑒定 純化培養(yǎng)12h的RGCs用Thyl.1單克隆抗體免疫熒光細(xì)胞染色，檢測(cè)其細(xì)胞純度。熒光顯微鏡下觀察Thyl.1單克隆抗體標(biāo)記陽性的細(xì)胞與同一視野中的細(xì)胞總數(shù)之比為RGCs的純度。視野的選取以培養(yǎng)板的蓋玻片中央為中心，分別在其上、下、左、右、中5個(gè)方向隨機(jī)選取5個(gè)顯微鏡（200倍）掃描視野框（框面積0.27mm2），每次實(shí)驗(yàn)隨機(jī)取2個(gè)孔計(jì)數(shù)，3次實(shí)驗(yàn)共30個(gè)視野。

1.2 檢測(cè)H2O2對(duì)RGCs的影響

1.2.1 RGCs細(xì)胞分組 每次實(shí)驗(yàn)取材均用20只SD乳鼠的視網(wǎng)膜組織，一起消化純化培養(yǎng)，按統(tǒng)一密度接種于培養(yǎng)板，使各組細(xì)胞密度一致。每次實(shí)驗(yàn)周期，將0、250、500μmol／L H2O2加入純化培養(yǎng)的RGCs中作用4、8、24、32h。每個(gè)實(shí)驗(yàn)周期分為上述12組，每組9孔?？偣仓貜?fù)3個(gè)周期，共計(jì)使用60只乳鼠。

1.2.2 RGCs存活數(shù)和軸突生長(zhǎng)情況檢測(cè) 每4h在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，記錄RGCs存活數(shù)和存活時(shí)間。采用HMIAS－2000型全自動(dòng)醫(yī)學(xué)彩色圖像分析系統(tǒng)計(jì)數(shù)每個(gè)視野中分散的、有軸突的、存活的RGCs及其最長(zhǎng)軸突的長(zhǎng)度（每個(gè)視野隨機(jī)取5個(gè)細(xì)胞進(jìn)行測(cè)量，共30個(gè)視野，150個(gè)軸突）。

1.2.3 NF－H免疫組織化學(xué)染色 利用小鼠抗大鼠抗NF－H 200單克隆抗體（武漢博士德生物技術(shù)有限公司），采用SABC法對(duì)RGCs的NF－H行免疫組織化學(xué)染色，采用HMIAS－2000型全自動(dòng)醫(yī)學(xué)彩色圖像分析系統(tǒng)（武漢同濟(jì)千屏影像工程公司），測(cè)定不同壓力下RGCs中NF－H的表達(dá)水平，用吸光度（A）值表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示，組間均數(shù)比較采用方差分析或t檢驗(yàn)，所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 純化的RGCs純度檢測(cè)及鑒定

用抗大鼠Thyl.1單克隆抗體對(duì)純化培養(yǎng)12h后的RGCs進(jìn)行熒光免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)。RGCs純度為96.24%。多數(shù)細(xì)胞的胞膜及軸突均有明顯的綠色熒光染色，細(xì)胞核區(qū)空染，細(xì)胞形態(tài)清晰。培養(yǎng)至第3天的細(xì)胞軸突較短，第7天細(xì)胞軸突較長(zhǎng)，相互鄰近細(xì)胞間的軸突發(fā)生連接。見圖1。

圖1 純化培養(yǎng)第3天的RGCs Thy1.1免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色圖像（×400）Fig.1 Immunofluorescent staining image of RGCs on the third day of culture（Thy1.1antibody，×400）

2.2 H2O2對(duì)RGCs存活數(shù)、軸突、NF－H表達(dá)水平的影響

2.2.1 H2O2的氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)RGCs存活數(shù)的影響 分別應(yīng)用不同濃度（250、500μmol／L）H2O2誘導(dǎo)RGCs細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，并設(shè)立正常培養(yǎng)細(xì)胞為對(duì)照組，在不同時(shí)間（4、8、24、32h）測(cè)定細(xì)胞存活數(shù)。實(shí)驗(yàn)顯示H2O2能夠以時(shí)間和濃度依賴的方式減少RGCs的細(xì)胞數(shù)（圖2）。500μmol／L H2O2孵育32h可以導(dǎo)致RGCs細(xì)胞為對(duì)照組的50%。

圖2 不同濃度H2O2處理不同時(shí)間對(duì)RGCs細(xì)胞存活數(shù)的影響Fig.2 Effects of treatment with H2O2at different concentrations for different time on the survival of RGCs

2.2.2 H2O2的氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)RGCs軸突的影響

純化培養(yǎng)的RGCs在正常培養(yǎng)液中孵育8、24、32 h，未見軸突長(zhǎng)度的明顯變化；在含500μmol／L H2O2細(xì)胞培養(yǎng)液中孵育8、24、32h，24、32h組與8 h組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；不同時(shí)間與對(duì)照組比較，可見細(xì)胞軸突長(zhǎng)度明顯變短，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。見表1。

表1 各組培養(yǎng)的RGCs最長(zhǎng)突起長(zhǎng)度比較（μm，）Table 1 Comparison of the length of the longest process of RGCs in each group（μm，）

表1 各組培養(yǎng)的RGCs最長(zhǎng)突起長(zhǎng)度比較（μm，）Table 1 Comparison of the length of the longest process of RGCs in each group（μm，）

H2O2t值P值6.859 0.000 24h73.64±42.93 37.56±22.26 9.301 0.000.88 32h68.44±39.73 35.96±22.10 8.764 0.000 F值0.842 4.133 P值0.431 0.017

2.2.3 H2O2的氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)RGCs中NF－H的影響 純化培養(yǎng)的RGCs在正常培養(yǎng)液中孵育8、24、32h，未見NF－H的明顯變化；在含500μmol／L H2O2細(xì)胞培養(yǎng)液中孵育8、24、32h，與對(duì)照組比較，可見NF－H表達(dá)明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（表2）。對(duì)照組RGCs中NF－H免疫組化染色，DAB顯色可見免疫陽性產(chǎn)物NF－H為棕褐色網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，NF－H絲狀結(jié)構(gòu)排列規(guī)則而均勻，細(xì)胞已具有成熟神經(jīng)元特征，細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，核大而圓，核膜、核仁清晰（圖3）。500μmol／L H2O2作用32h組可見細(xì)胞形態(tài)極不規(guī)則，核周棕褐色陽性反應(yīng)產(chǎn)物大量聚集，胞質(zhì)內(nèi)周邊區(qū)域陽性反應(yīng)染色變淺，NF－H在RGCs中分布紊亂（圖4）。

表2 各組培養(yǎng)的RGCs中NF－H表達(dá)的比較（A值，）Table 2 Comparison of NF－H expression in RGCs in each group（Avalue，）

表2 各組培養(yǎng)的RGCs中NF－H表達(dá)的比較（A值，）Table 2 Comparison of NF－H expression in RGCs in each group（Avalue，）

孵育時(shí)間0μmol／L H2O2500μmol／L H2O2t值P值8h0.47±0.20 0.14±0.05 5.079 0.000 24h0.54±0.20 0.07±0.01 7.296 0.000 32h0.47±0.19 0.06±0.01 6.723 0.000 F值0.418 21.434 P值0.662 0.000

圖3 對(duì)照組RGCs神經(jīng)絲蛋白NF－H免疫組化染色Fig.3 Immunohistochemistry staining of NF－H in RGCs in control group

圖4 500μmol／L H2O2作用32h組RGCs神經(jīng)絲蛋白NF－H免疫組化染色Fig.4 Immunohistochemistry staining of NF－H in RGCs treated with 500μmol／L H2O2for 32h

3 討論

在青光眼中，RGCs的死亡是青光眼視神經(jīng)損傷的最終共同通路，目前關(guān)于導(dǎo)致RGCs凋亡的可能機(jī)制主要包括:神經(jīng)營養(yǎng)因子剝奪、膠質(zhì)細(xì)胞激活、谷氨酸興奮毒性、缺血以及氧化應(yīng)激損傷等［6－8］。其中氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)、活性氧產(chǎn)生增多在青光眼的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用［1－2］。在本研究中，以500μmmol／L的H2O2孵育32h后可以導(dǎo)致RGCs存活數(shù)下降約50%。

神經(jīng)微絲蛋白NF是構(gòu)成神經(jīng)元胞體和神經(jīng)軸突細(xì)胞骨架的主要成分，在維護(hù)神經(jīng)元功能和軸漿轉(zhuǎn)運(yùn)等一系列與脊髓損傷修復(fù)相關(guān)的病理生理變化中發(fā)揮重要作用［9］。NF分別由相對(duì)分子質(zhì)量為68 000（NF－L）、160 000（NF－M）及200 000（NF－H）的3種多肽亞單位組成。其中相對(duì)分子質(zhì)量為200 000的NF－H僅存在于軸突中。已有研究表明脊髓損傷后NF－200即NF－H陽性神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)量及神經(jīng)細(xì)胞著色程度與后肢功能的恢復(fù)情況有密切關(guān)系［10］。因此，NF－H是神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突的標(biāo)志性蛋白，可以作為判斷神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突生長(zhǎng)的指標(biāo)［11］。

在本研究中，我們采用體外純化培養(yǎng)的RGCs，分別在不同濃度的外源性H2O2下作用不同時(shí)間，結(jié)果顯示H2O2的氧化應(yīng)激損傷能夠以時(shí)間和濃度依賴的方式影響純化培養(yǎng)的RGCs存活，可影響RGCs軸突生長(zhǎng)，下調(diào)RGCs中神經(jīng)微絲蛋白的表達(dá)。這提示氧化應(yīng)激損傷可以直接影響RGCs的軸突生長(zhǎng)，此種影響與其下調(diào)NF－H表達(dá)水平有關(guān)。

H2O2引起NF－H表達(dá)水平下調(diào)，與RGCs存活和軸突生長(zhǎng)情況相關(guān)，研究表明磷酸化的NF－H在調(diào)節(jié)神經(jīng)微絲的生長(zhǎng)、運(yùn)輸、形態(tài)與功能上起關(guān)鍵作用，也與一些神經(jīng)變性疾病發(fā)病機(jī)制相關(guān)［12］。正常情況下，NF－H在軸突中大部分是以磷酸化形式存在，在核周樹突中多以去磷酸化形式存在［4］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖3中對(duì)照組RGCs細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，神經(jīng)絲蛋白NF－H呈棕褐色網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，排列規(guī)則而均勻，主要分布于軸突中。而圖4中500μmol／L H2O2作用32h組RGCs細(xì)胞形態(tài)極不規(guī)則，棕褐色陽性反應(yīng)產(chǎn)物大量聚集于核周，胞質(zhì)內(nèi)周邊區(qū)域，包括軸突中陽性反應(yīng)染色變淺，NF－H在RGCs中分布變紊亂，表明氧化應(yīng)激損傷打破了NF－H在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中的結(jié)構(gòu)布局，直接造成NFs合成能力下降和NF的磷酸化水平，其原因可能為:①造成軸膜Ca－ ATPase活性改變和鈣離子內(nèi)流，細(xì)胞內(nèi)鈣離子的蓄積，從而激活大量蛋白水解酶，引起神經(jīng)元內(nèi)NFs等結(jié)構(gòu)蛋白的水解；②調(diào)解NFs磷酸化和去磷酸化的磷酸酶和蛋白激酶動(dòng)態(tài)平衡的改變。這些原因均可造成神經(jīng)元中NFs的減少和異常分布，進(jìn)而導(dǎo)致RGCs軸突運(yùn)輸?shù)漠惓＃绊戄S突生長(zhǎng)，使RGCs變性、萎縮，最終導(dǎo)致RGCs死亡。

綜上所述，H2O2的氧化應(yīng)激損傷可影響純化培養(yǎng)的RGCs存活和軸突生長(zhǎng)，這可能與其下調(diào)RGCs中NF的表達(dá)水平有關(guān)。由此可見，氧化應(yīng)激反應(yīng)損傷在青光眼的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用。

［1］ Qu J，Wang D，Grosskreutz C L.Mechanisms of retinal ganglion cell injury and defense in glaucoma［J］.Exp Eye Res，2010，91（1）:48－53.

［2］ Tezel G.The immune response in glaucoma:aperspective on the roles of oxidative stress［J］.Exp Eye Res，2011，93（2）: 178－186.

［3］ Wein F B，Levin L A.Current understanding of neuroprotection in glaucoma［J］.Curr Opin Ophthalmo1，2002，13（2）:61－67.

［4］ Gotow T.Neurofilaments in health and disease［J］.Med Electron Microsc，2000，33（4）:173－199.

［5］ Uchida A，Brown A.Arrival，reversal，and departure of neurofilaments at the tips of growing axons［J］.Mol Biol Cell，2004，15（9）:4215－4225.

［6］ Band L R，Hall C L，Richardson G，et al.Intracellular flow in optic nerve axons:a mechanism for cell death in glaucoma［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2009，50（8）:3750－3758.

［7］ Chrysostomou V，Rezania F，Trounce I A，et a1.Oxidative stress and mitochondrial dysfunction in glaucoma［J］.Curt Opin Harmacol，2013，13（1）:12－15.

［8］ 李珂，賈君.重組人促紅細(xì)胞生成素對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響［J］.華中科技大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2014，43（2）:227－230.

［9］ Uchida K，Baba H，Maezawa Y，et al.Progressive changes in neurofi lament proteins and growth－associated protein－43immunoreactivities at the site of cervical spinal cord compression in spinal hyperostotic mice［J］.Spine，2002，27（5）:480－486.

［10］ Yabe J T，Wang F S，Chylinski T，et al.Selective accumulation of the high Molecular weight neurofilament subunit within the distal region of growing axonal neurites［J］.Cell Motil Cytoskeleton，2001，50（1）:1－12.

［11］ Kamda T，Koda M，Dezawa M，et al.Transplantation of bone marrow stromal cell－derived Schwann cells promotes axonal regeneration and functional recovery after complete transaction of adult rat spinal cord［J］.J Neuropathol Exp Neurol，2005，64（1）:37－45.

［12］ Shea T B，F(xiàn)lanagan L A.Kinesin，dynein and neurofilament transport［J］.Trends Neurosci，2001，24（11）:644－648.

（2014－12－24 收稿）

Effects of Exogenous H2O2on Survival and Axonal Growth of Rat Retinal Ganglion Cells

Zhong Jie，Jia Jun，Yang Wanju
Department of Ophthalmology，Wuhan Central Hospital，Wuhan 430014，China

ObjectiveTo examine the effects of exogenous H2O2on the survival and axonal growth of retinal ganglion cells（RGCs）and on the expression of neurofilament protein－H（NF－H）in order to explore the mechanism of RGCs damage caused by H2O2－induced oxidative stress Methods The number of viable RGCs with axon－like processes and the length of the longest process were measured in RGCs which were obtained from SD neonatal rats（n＝20，postnatal 1－3days），purified，cultured and then treated with H2O2of 0，250and 500μmol／L respectively.The expression of NF－H and its distribution in primary RGCs were detected by immunohistochemical technique and microscopic image－analysis technique.Results The purity of RGCs was 96.24%.H2O2affected the survival and growth of RGCs in a time－and concentration－dependent manner.The viability of RGCs was reduced by 50%after treatment with 500μmmol／L H2O2for 32h.Moreover，the processes of H2O2－treated RGCs were much shorter than those of untreated cells（P＜0.01），which was accentuated with extended treatment time.NF－H was significantly down－expressed in RGCs treated with H2O2and it was distributed unevenly in RGCs.Conclusion H2O2－induced oxidative stress injury can affect the survival of purified and cultured RGCs in a time－and concentration－dependent manner，and affect their axonal growth，which may be associated with the down－regulated expression of NF－H protein in RGCs.

retina ganglion cells； exogenous H2O2； cell survival； axons； neurofilament protein－H

R774

10.3870／j.issn.1672－0741.2015.02.016

鐘 杰，女，1981年生，主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，E－mail:349946046＠qq.com