馮 歡，張 超，張哲愷，章 銘，張 豐

（第四軍醫(yī)大學(xué)1.學(xué)員旅十五連;2.學(xué)員旅十三連;3.基礎(chǔ)部病理學(xué)教研室，陜西西安 710032）

H3K27me3去甲基化酶Jmjd3調(diào)節(jié)胎鼠肺上皮細(xì)胞增殖和分化

馮 歡1，張 超1，張哲愷2，章 銘2，張 豐3*

（第四軍醫(yī)大學(xué)1.學(xué)員旅十五連;2.學(xué)員旅十三連;3.基礎(chǔ)部病理學(xué)教研室，陜西西安 710032）

目的 分析H3K27me3特異去甲基化酶Jmjd3（KDM6B）在胎鼠肺生長(zhǎng)發(fā)育過程中的作用。方法 HE染色、PAS染色和免疫組化方法檢測(cè)E19.5Jmjd3基因敲除胎鼠肺生長(zhǎng)發(fā)育情況。結(jié)果 與野生型（Jmjd3+/+）胚胎比較，雜合型敲除（Jmjd3+/－）胚胎的肺發(fā)育稍差，但純合型敲除（Jmjd3－/－）胚胎肺發(fā)育明顯不良，支氣管的纖毛上皮細(xì)胞和Clara細(xì)胞以及肺泡的Ⅰ型和Ⅱ型上皮細(xì)胞分化不良。Jmjd3－/－胚胎肺上皮細(xì)胞增殖指數(shù)高于野生型和Jmjd3+/－組，未發(fā)現(xiàn)Jmjd3－/－胚胎肺上皮細(xì)胞凋亡異常。結(jié)論 Jmjd3對(duì)胎鼠肺上皮細(xì)胞的增殖和分化具有重要調(diào)節(jié)作用。

Jmjd3;肺上皮細(xì)胞;增殖;分化

*通信作者（corresponding author）:zhf1975@fmmu.edu.cn

近年來表觀遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)核小體組蛋白N-端的氨基酸可發(fā)生甲基化和乙酰化等化學(xué)修飾，這些修飾組合起來形成“組蛋白密碼”，決定基因的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)［1］。隨著特異產(chǎn)生或降解這些修飾的基因發(fā)現(xiàn)，表觀遺傳分子的功能學(xué)研究成為新的研究熱點(diǎn)［2-3］。Jmjd3是一個(gè)特異降解組蛋白H3第27位氨基酸（賴氨酸）上3甲基（H3K27me3）的組蛋白去甲基化酶［4-8］，Jmjd3敲除基因小鼠實(shí)驗(yàn)表明Jmjd3對(duì)于巨噬細(xì)胞、神經(jīng)元和軟骨細(xì)胞發(fā)育分化具有重要調(diào)節(jié)作用［9-11］，由于Jmjd3－/－小鼠出生后 1 ～2 h內(nèi)死亡，伴全身紫紺，因此Jmjd3－/－小鼠的肺發(fā)育可能存在異常［11］，為了檢測(cè) Jmjd3是否調(diào)節(jié)肺發(fā)育，本研究從組織學(xué)水平探討Jmjd3在肺上皮細(xì)胞的增殖和分化中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

Jmjd3+/－小鼠由中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所陳德桂研究員惠贈(zèng)，Jmjd3－/－小鼠由Jmjd3+/－雌雄小鼠交配產(chǎn)生。由于Jmjd3－/－小鼠出生后死亡，因此，本研究以E19.5胎鼠肺組織作為研究對(duì)象?？贵w如下:兔抗Jmjd3抗體、兔抗AQP5抗體和兔抗 Ki67（abcam公司），兔抗H3K27me3抗體（Millpore公司），兔抗 β-tubulin抗體（GeneTex公司）、兔抗CCSP抗體和兔抗ABCA3抗體（Seven hills bioregents公司）。TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）凋亡檢測(cè)試劑盒（Promega公司）。

1.2 方法

1.2.1 敲除Jmjd3基因:Jmjd3基因敲除方法見前期研究報(bào)道［11］，小鼠遺傳背景為 C57/BL6，Jmjd3F/+與EIIa-cre小鼠（Jackson實(shí)驗(yàn)室 No.003724）交配產(chǎn)生Jmjd3+/－小鼠。本實(shí)驗(yàn)采用5只Jmjd3+/－雄鼠與10只Jmjd3+/－雌鼠交配。每籠放置1只雄鼠和兩只雌鼠，24 h后雌雄分開飼養(yǎng)。小鼠在第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)，條件為SPF級(jí)別環(huán)境，飼養(yǎng)室溫度控制在20～23℃，飲用水和飼料經(jīng)過高溫消毒。基因型鑒定所需DNA模板來自胎鼠尾巴，用常規(guī)PCR方法鑒定，PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳20 min后，紫外顯影儀下拍照分析。基因鑒定引物序列249-F:5'-GAGACCCCTGTTTGGTTACC AG-3';250-F:5'-GCAGTATAAAACCAGAGGAAAC AATG-3';251-R:5'-GAGGCAGAACCTGAGCAAGAC C-3'.以249/251和250/251為引物，PCR產(chǎn)物大小約400 bp。249/251和250/251引物PCR結(jié)果雙陽(yáng)性為雜合型敲除，249/251引物PCR結(jié)果陽(yáng)性，而250/251引物PCR結(jié)果陰性為野生型，249/251引物PCR結(jié)果陰性，而250/251引物PCR結(jié)果陽(yáng)性為純合型敲除。

1.2.2 組織處理和染色:給E19.5胎鼠編號(hào)后，體視鏡下剪開每只胎鼠胸腔，取肺組織，4%甲醛固定24 h，石蠟包埋，切片，厚度為4 μm，切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水后，對(duì)切片進(jìn)行蘇木精和尹紅或糖原（PAS）染色，之后無水乙醇脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片。普通光學(xué)顯微鏡觀察小鼠肺組織結(jié)構(gòu)和發(fā)育情況。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色:石蠟切片脫蠟至水，PBS浸泡5 min。3%H2O2室溫孵育10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，PBS洗滌5 min×3次（置搖床上）。正常山羊血清封閉，室溫孵育30 min，傾去血清，勿洗。滴加一抗工作液，4℃過夜。從冰箱取出，室溫復(fù)溫1 h，之后 PBS沖洗，5 min×3次。滴加適量抗兔辣根酶標(biāo)記二抗（1/500）工作液，室溫孵育2 h。PBS沖洗，5 min×3次。DAB顯色劑顯色1～5 min。蒸餾水沖洗，蘇木素襯染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片。普通光學(xué)顯微鏡觀察小鼠肺發(fā)育和分化標(biāo)記物表達(dá)情況。

1.2.4 細(xì)胞增殖和凋亡分析:用免疫組織化學(xué)染色細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞增殖。用TUNEL試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡，方法按照說明書進(jìn)行。普通光學(xué)顯微鏡觀察小鼠肺細(xì)胞增殖和凋亡情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Jmjd3基因敲除胎鼠結(jié)果

Jmjd3+/－雌雄小鼠交配后19.5 d檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)7只小鼠懷孕，處死孕鼠，觀察到平均每只孕鼠體內(nèi)有6～9只胎鼠，共計(jì)52只胎鼠。Jmjd3+/+胎鼠有 13 只，Jmjd3+/－胎鼠 27 只，Jmjd3－/－胎鼠12只，一窩代表性胎鼠基因型鑒定結(jié)果（圖1）。Jmjd3表達(dá)強(qiáng)度在Jmjd3+/－胎鼠肺組織略低于Jmjd3+/+的胎鼠肺組織，在Jmjd3－/－胎鼠肺組織檢測(cè)不到 Jmjd3蛋白信號(hào)（圖2A～C）。相反，H3K27me3的信號(hào)強(qiáng)度在Jmjd3－/－胎鼠肺組織最強(qiáng)（圖2D～F）。

圖1 小鼠胚胎基因型鑒定Fig 1 Genotype of mouse embryos

2.2 組織形態(tài)學(xué)分析Jmjd3基因敲除對(duì)胎鼠肺發(fā)育的影響

每個(gè)顯微鏡低倍視野下Jmjd3+/－胎鼠的肺泡數(shù)目略少于Jmjd3+/+胎鼠肺泡的數(shù)目，但是Jmjd3+/－胎鼠的肺泡間隔卻略寬于Jmjd3+/+胎鼠的肺泡間隔 （圖3A:a～f;3B）。另外，Jmjd3+/+胎鼠的大部分支氣管上皮細(xì)胞頂端已經(jīng)明顯空泡化，而Jmjd3+/－胎鼠的支氣管上皮細(xì)胞只有少數(shù)細(xì)胞的頂端出現(xiàn)空泡化 （圖3A:c，f;3B）。相對(duì)于Jmjd3+/+和Jmjd3+/－胎鼠，Jmjd3－/－胎鼠肺泡數(shù)目明顯減少，肺泡管腔狹窄或缺如，肺泡間隔明顯增厚并且細(xì)胞數(shù)目增加，而且，Jmjd3－/－胎鼠支氣管上皮細(xì)胞看不到頂端空泡化細(xì)胞 （圖3A:a～i;3B）。

2.3 Jmjd3基因敲除對(duì)肺上皮細(xì)胞分化的影響

相對(duì)于Jmjd3+/+和Jmjd3+/－胎鼠，Jmjd3－/－胎鼠細(xì)支氣管內(nèi)Tubulin和CCSP陽(yáng)性細(xì)胞明顯減少，同時(shí)，肺泡內(nèi)ABCA3和AQP5陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目也嚴(yán)重減少（圖4）。另外，PAS染色發(fā)現(xiàn)Jmjd3－/－胎鼠支氣管和肺泡內(nèi)存在大量含糖類黏液（圖5）。

2.4 Jmjd3基因敲除對(duì)肺上皮細(xì)胞增殖和分化的影響

Ki67在Jmjd3－/－胎鼠肺組織中表達(dá)率明顯高于Jmjd3+/+和Jmjd3+/－胎鼠組（圖 6A:a ～ c，6B）。Jmjd3+/+、Jmjd3+/－和Jmjd3－/－胎鼠肺組織中細(xì)胞凋亡沒有明顯差異（圖6A:d～f，6C）。

3 討論

圖2 肺組織的Jmjd3（A～C）和H3K27me3（D～F）的免疫組織化學(xué)Fig 2 Immnohistochemistry assays of Jmjd3（A～C）and H3K27me3（D～F）in lung tissues（×200）

圖3 組織學(xué)方法檢測(cè)小鼠肺發(fā)育情況Fig 3 Developmental status of mice lung were examined by tissue assays

圖4 分子標(biāo)志檢測(cè)方法分析小鼠肺發(fā)育情況Fig 4 Developmental stantus of mice lung by molecalar markers investagations

多種肺疾病的發(fā)生與肺早期發(fā)育分化不良有關(guān)，但是關(guān)于肺正常發(fā)育的分子機(jī)制目前還不完全清楚［12-13］?；蚯贸∈髮?shí)驗(yàn)表明轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)分子對(duì)肺的正常發(fā)育和分化具有重要調(diào)節(jié)作用，但是有關(guān)表觀遺傳調(diào)控分子在肺發(fā)育分化過程中的作用還不清楚［12-13］。本研究發(fā)現(xiàn)H3K27me3去甲基化酶Jmjd3基因敲除小鼠有明顯的肺發(fā)育不良，表現(xiàn)為肺泡數(shù)目減少、肺泡間隔增寬、處于增殖期的肺泡和支氣管上皮細(xì)胞數(shù)目增加，以及支氣管和肺泡內(nèi)存在大量未吸收黏液。該結(jié)果拓展了從表觀遺傳角度理解肺發(fā)育和分化的分子機(jī)制，為進(jìn)一步研究Jmjd3在肺相關(guān)疾病中的作用奠定了基礎(chǔ)。Jmjd3影響肺上皮細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)結(jié)果已報(bào)道［14］，但是該文獻(xiàn)結(jié)果沒有提及Jmjd3+/－胎鼠的肺發(fā)育情況，也沒有提及Jmjd3基因敲除對(duì)肺上皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響。本研究用免疫組織細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)到Jmjd3基因敲除后，H3K27me3在肺上皮細(xì)胞內(nèi)整體水平升高，提示Jmjd3促進(jìn)肺上皮細(xì)胞分化與其去甲基化酶的催化活性有關(guān)。與該推測(cè)一致，Jmjd3直接降解SP-B和AQP5基因啟動(dòng)子上的H3K27me3水平，從而影響肺Ⅰ型和Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞的分化［14］。結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測(cè)Jmjd3蛋白可能直接調(diào)節(jié)脂滴轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ABCA3和水通道蛋白AQP5的表達(dá)，從而促進(jìn)肺上皮細(xì)胞的分化成熟，Jmjd3基因敲除將導(dǎo)致這些基因無法表達(dá)，引起支氣管和肺泡內(nèi)的液體無法被吸收，最終導(dǎo)致Jmjd3－/－胎鼠出生后無法正常呼吸而死亡。

圖5 水吸收程度檢測(cè)小鼠肺發(fā)育狀態(tài)Fig 5 Developmental status of mice lung were exammed by water absorptivity assays

圖6 增生和凋亡檢測(cè)小鼠肺發(fā)育情況Fig 6 Developmental status of mice lung were examined by proliferation and apoptisis assays

最近Jmjd3基因敲除小鼠沒有明顯的肺發(fā)育異常［15］，原因是并沒有完全敲除Jmjd3，而只是敲除了Jmjd3 的一個(gè)剪接體（isoform）［5，14］。由于 Jmjd3 有兩個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS），其中一個(gè)TSS位于第1外顯子的上游，另一個(gè)TSS位于第1和第2外顯子之間［5］。該作者在第1和第2個(gè)外顯子之間的內(nèi)含子區(qū)域插入1個(gè)剪切受體盒子，因此只敲除第1個(gè)TSS，結(jié)果只敲除了Jmjd3基因的1個(gè)剪接體［15］。因此，小鼠表型類似本研究的Jmjd3雜合型基因敲除小鼠，而與本研究的Jmjd3－/－小鼠表型存在明顯差異。

綜上所述，Jmjd3在支氣管和肺泡上皮的發(fā)育和分化過程中具有重要作用，其發(fā)揮作用的主要機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié) β-Tubulin、CCSP、ABCA3和AQP5等分化基因的表達(dá)而促進(jìn)肺上皮細(xì)胞分化，具體的分子機(jī)制還需要進(jìn)一步的工作來驗(yàn)證。

［1］Jenuwein T，Allis CD.Translating the histone code［J］.Science，2001，293:1074-1080.

［2］Greer EL，Shi Y.Histone methylation:a dynamic mark in health，disease and inheritance ［J］.Nat Rev Genet，2012，13:343-357.

［3］Pedersen MT，Helin K.Histone demethylases in development and disease ［J］.Trends Cell Biol，2010，20:662-671.

［4］Agger K，Cloos PA，Christensen J，et al.UTX and Jmjd3 are histone H3K27 demethylases involved in HOX gene regulation anddevelopment ［J］. Nature，2007，449:731-734.

［5］De Santa F，Totaro MG，Prosperini E，et al.The histone H3 lysine-27 demethylase Jmjd3 links inflammation to inhibition of polycomb-mediated gene silencing ［J］.Cell，2007，130:1083-1094.

［6］Lan F，Bayliss PE，Rinn JL，et al.A histone H3 lysine 27 demethylase regulates animal posterior development［J］.Nature，2007，449:689-694.

［7］Xiang Y，Zhu Z，Han G，et al.Jmjd3 is a histone H3K27 demethylase［J］.Cell Res，2007，17:850-857.

［8］Jepsen K，Solum D，Zhou Tet al.SMRT-mediated repression of an H3K27 demethylase in progression from neural stem cell to neuron［J］.Nature，2007，450:415-419.

［9］Satoh T，Takeuchi O，Vandenbon A，et al.The Jmjd3-Irf4 axis regulates M2 macrophage polarization and host responses against helminth infection ［J］.Nat Immunol，2010，11:936-944.

［10］Park DH，Hong SJ，Salinas RD，et al.Activation of neuronal gene expression by the Jmjd3 demethylase is required for postnatal and adult brain neurogenesis［J］.Cell Rep，2014，8:1290-1299.

［11］Zhang F，Xu L，Xu L，et al.Jmjd3 promotes chondrocyte proliferation and hypertrophy during endochondral bone formation in mice［J］.J Mol Cell Biol，2015，7:23-34.

［12］Rock JR，Hogan BL.Epithelial progenitor cells in lung development，maintenance，repair，and disease［J］.Annu Rev Cell Dev Biol，2011，27:493-512.

［13］Morrisey EE，Hogan BL.Preparing for the first breath:genetic and cellular mechanisms in lung development［J］.Dev Cell，2010，18:8-23.

［14］Li Q，Wang HY，Chepelev I，et al.Stage-dependent and locus-specific role of histone demethylase Jumonji D3（Jmjd3）in the embryonic stages of lung development［J］.PLoS Genet，2014，10:e1004524.DOI:10.1371/journal.pgen.1004524.

［15］Burgold T，Voituron N，Caganova M，et al.The H3K27 demethylase Jmjd3 is required for maintenance of the embryonic respiratory neuronal network，neonatal breathing，and survival［J］.Cell Rep，2012，2:1244-1258.

H3K27me3 demethylase Jmjd3 regulates proliferation and differentiation of embryonal lung epithelia of mice

FENG Huan1，ZHANG Chao1，ZHANG Zhe-kai2，ZHANG Ming2，ZHANG Feng3*

（1.Company 15;2.Company 13，Student Brigade;3.Dept.of Pathology，Basic Medical College，the Fourth Military Medical University，Xi'an 710032，China）

ObjectiveTo investigate the role of H3K27me3 demethylase Jmjd3（KDM6B）during the development of lung in embryonal mice.MethodsJmjd3knockout embryos of E19.5 mice were examined by HE，PAS and immnohistochemistry assays.ResultsThe developmental defects of the lung of Jmjd3 heterozygous（Jmjd3+/－）embryos were mild is compared toJmjd3+/+embryos.However，Jmjd3－/－mice suffered from the severe hypoplasia of lung tissue.Differentiated defects of ciliated cell，Clara cell，typeⅠ and Ⅱ alveolar epithelial cells were observed inJmjd3－/－embryos.The index of cell proliferation was increased inJmjd3－/－embryos as compared to wildtype andJmjd3+/－embryos.No difference in apoptosis profile was found in these embryos.ConclusionsJmjd3 is essential for proliferation and differentiation of embryonal lung epithelia of mice.

Jmjd3;epithelia of lung;proliferation;differentiation

Q132.7

A

10.16352/j.issn.1001-6325.2015.09.006

1001-6325（2015）09-1176-06

2014-01-19

2015-04-27

國(guó)家自然科學(xué)基金（31000559）

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