賀曉龍，邵 青，姚 堯，王延峰，2*，張 昊

(1.延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院；2.陜西省區(qū)域生物資源保育與利用工程技術(shù)研究中心；3.陜西省紅棗重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(延安大學(xué))，陜西延安716000)

山丹丹皂苷提取工藝初探

賀曉龍1，2，3，邵 青1，姚 堯1，王延峰1，2*，張 昊1

(1.延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院；2.陜西省區(qū)域生物資源保育與利用工程技術(shù)研究中心；3.陜西省紅棗重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(延安大學(xué))，陜西延安716000)

用正交試驗(yàn)方法對(duì)山丹丹總皂苷提取工藝中的溫度、乙醇濃度、料液比和提取時(shí)間4個(gè)因素進(jìn)行研究比較，使用AB-8大孔吸附樹脂進(jìn)行分離，冷凍干燥得到純山丹丹皂苷。以三七總皂苷為標(biāo)準(zhǔn)，用紫外可見分光光度計(jì)在270 nm出對(duì)山丹丹總皂苷的含量進(jìn)行測(cè)定，篩選出簡(jiǎn)單可靠，并且適合工廠化生產(chǎn)的山丹丹總皂苷的提取工藝。最佳的提取工藝條件是：提取溫度為70℃，料液比為1∶10，回流提取時(shí)間為3 h，提取液濃度為80%。

山丹丹；皂苷；提取

山丹丹，學(xué)名也叫細(xì)葉百合，屬于百合科百合屬植物，其肉質(zhì)鱗莖的鱗片。據(jù)醫(yī)藥典籍《本草綱目》記載，百合味甘、微苦、性平、具有補(bǔ)益心肺、固腎、補(bǔ)腦、清心、安神、鎮(zhèn)靜、清潤(rùn)肺燥、調(diào)理脾胃、養(yǎng)陰止血、消暑等功效[1，2]。研究證明，百合中主要含有酚酸甘油酯、甙類、生物堿及其多糖，它們都是有藥用價(jià)值的活性成分，皂甙對(duì)人體的新陳代謝起著重要的生理作用，可以抑制血清中脂類氧化，抑制過氧化脂質(zhì)的生成，降低血清中膽固醇的含量，抑制過氧化脂質(zhì)對(duì)肝臟的損傷，防止動(dòng)脈硬化和抗腫瘤的等作用[3-5]。

本文以陜北山丹丹種球?yàn)樵?，采?因素3水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，對(duì)其總皂苷的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，為山丹丹總皂苷的提取探索出一條較為合理的提取工藝，為山丹丹的綜合開發(fā)利用提供了參考依據(jù)。

1 材料與試劑

1.1 供試材料

山丹丹種球，由延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供。新鮮山丹丹種球清洗干凈于常溫下通風(fēng)陰干至干燥后，用粉碎機(jī)粉碎，過100目篩，用密封瓶干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器與試劑

干燥箱、粉碎機(jī)、恒溫水浴鍋、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、低速離心機(jī)、超聲波清洗器、UV-2600紫外可見分光光度計(jì)、真空干燥器等實(shí)驗(yàn)室常用儀器設(shè)備；乙醇、正丁醇、三七皂苷對(duì)照品(純度為99.0%)，蒸餾水等實(shí)驗(yàn)藥品。

1.3 試劑的配制

1.3.1 三七皂苷對(duì)照液

精確稱取三七總皂苷對(duì)照品100 mg，溶解在10 mg去離子水中，搖勻[4]。

1.3.2 水飽和正丁醇

在150 mL的分液漏斗中分別加入21 mL水和100 mL正丁醇，振搖3 min后，靜置分層去下層，上層則為水飽和正丁醇[5]。

1.3.3 乙醇溶液

分別配濃度為60%、70%、80%的乙醇溶液，備用。

2 試驗(yàn)方法

2.1 單因素提取試驗(yàn)

2.1.1 提取溫度

查閱文獻(xiàn)[6]針對(duì)溫度對(duì)皂苷提取的影響，我們從而設(shè)置了較為精細(xì)的三個(gè)溫度點(diǎn)：65℃、70℃、75℃進(jìn)行試驗(yàn)。固液比為1∶10，提取時(shí)間為2.5 h的條件下，精確稱取5 g進(jìn)行試驗(yàn)，提取得到的皂苷含量分別記做A1，A2，A3。

2.1.2 料液比

根據(jù)提取液浸沒山丹丹粉末的最小的提取液體積比為1∶6。因此本實(shí)驗(yàn)設(shè)置了三個(gè)料液比分別為：1∶6、1∶8、1∶10。而后精確稱取5g山丹丹樣品，提取溫度為70℃，提取液濃度為70%乙醇溶液，提取2.5 h，得到的皂苷粗品分別記做B1，B2，B3。

2.1.3 提取時(shí)間

設(shè)置三個(gè)時(shí)間梯度2 h、2.5 h、3 h，從而精確稱取5 g山丹丹樣品，在70℃下加入1∶10的70%乙醇溶液，分別提取得到皂苷粗品記做C1，C2，C3。

2.1.4 提取液濃度

當(dāng)乙醇濃度低于60%的，蛋白質(zhì)很難以沉淀或離心的形式被除去。導(dǎo)致提取液混濁，不利于后續(xù)的分離工作，因此選擇的提取液濃度為60%、70%、80%三個(gè)濃度點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)是在精確稱取50 g山丹丹樣品，在70℃下，料液比為1∶10，提取時(shí)間為2.5 h，分別得到皂苷粗品記做D1，D2，D3。

2.2 山丹丹皂苷的提取及純化

2.2.1 山丹丹皂苷的提取

精確稱取5 g山丹丹粉末，精確至0.01，按正交試驗(yàn)表所列條件用不同濃度乙醇在水浴中加熱回流提取數(shù)次，而后合并提取液，過濾并回收乙醇至干，殘?jiān)铀芙庵翢o醇味，用水飽和正丁醇萃取5次至正丁醇層無色，回收正丁醇后水浴濃縮蒸干，用少許去離子水溶解備用，用AB-8大孔吸附樹脂柱吸出糖類等不被吸附的物質(zhì)，用乙醇溶液洗脫，收集洗脫液，并濃縮至干，用去離子水溶解，冷凍干燥24 h后，分別收集山丹丹皂苷粗品，用去離子水分別定容至50 mL，待用。

2.3 山丹丹皂苷的分析方法

2.3.1 三七總皂苷的吸光值測(cè)定

精確稱取100 mg三七總皂苷，用10 mL水溶解，吸取1 mL原液，稀釋成5 mL，用UV-2600紫外分光光度計(jì)進(jìn)行光譜掃描，測(cè)定其紫外吸光值為270 nm。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取100 mg三七總皂苷，用10 mL水溶解，配成10 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用移液槍分別量取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于具塞試管內(nèi)，分別加去離子水稀釋成5 mL，搖勻，靜止5 min。以去離子水作空白對(duì)照，用UV-2600分光光度計(jì)于270 nm處測(cè)定其吸光度，平行測(cè)定3次。以樣品濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖1)。線性方程為y=1.754x+0.074，r2=0.9992。

圖1 皂甙標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.3 山丹丹總皂苷含量測(cè)定

將冷凍干燥得到的皂苷粉末用去離子水溶解，定容至25 mL，從各組中分別吸取1 mL，加入4 mL去離子水，搖勻，靜止5 min，置于UV-2600紫外分光光度計(jì)下測(cè)定其濃度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品總皂苷的含量。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 提取溫度的選擇，提取溫度對(duì)山丹丹總皂甙提取的影響，結(jié)果見表1。

表1 提取溫度對(duì)山丹丹總皂甙提取的影響

由表1可以看出，在一定的溫度范圍內(nèi)，皂苷提取量先增加后降低，在70℃的時(shí)候到達(dá)最高值。經(jīng)本實(shí)驗(yàn)確定最佳提取溫度為70℃。

3.1.2 料液比的選擇，料液比對(duì)山丹丹總皂甙提取的影響，結(jié)果見表2。

表2 料液比對(duì)山丹丹總皂甙提取的影響

根據(jù)表2中的料液比的增加山丹丹總皂苷的提取量在逐漸增加，因此結(jié)合提取液用量和成本方面的綜合因素，最適的料液比為1∶10。不過不提倡使用過多提取液。

3.1.3 提取時(shí)間的選擇，提取時(shí)間對(duì)山丹丹總皂甙提取的影響，結(jié)果見表3。

表3 提取時(shí)間對(duì)山丹丹總皂甙提取的影響

根據(jù)表3的提取時(shí)間的增多，山丹丹總皂苷的提取量就相應(yīng)得增多，而進(jìn)一步增加提取時(shí)間會(huì)講題山丹丹皂苷的提取效率，因此在提取時(shí)間為3 h的時(shí)候，山丹丹皂苷的提取率達(dá)到最優(yōu)。

3.1.4 提取液濃度的選擇，提取濃度對(duì)山丹丹總皂甙提取的影響，結(jié)果見表4。

表4 提取濃度對(duì)山丹丹總皂甙提取的影響

從上表可以得出，當(dāng)提取液濃度為80%的時(shí)候，山丹丹總皂苷的提取量最多，因此，本實(shí)驗(yàn)確定最佳的提取濃度為80%。

3.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，選擇提取溫度、料液比、提取時(shí)間和提取液濃度四個(gè)作為考察因素，每個(gè)因素各取3個(gè)水平進(jìn)行4因素3水平的正交試驗(yàn)[7]?？疾煲蛩丶熬唧w水平見表5，試驗(yàn)結(jié)果見表6，方差分析結(jié)果見表7。

表5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表

通過比較各因素的極差值可以看出，影響總皂苷的因素順序是提取液濃度>提取時(shí)間>料液比>提取溫度，得出最佳提取條件為提取溫度75℃，料液比1/8，提取時(shí)間2 h，提取液濃度80%。

通過表6可以看出各因素的極差值分別為RA=0.947、RB=0.833、RC=0.603、RD=1.08。通過比較各因素的極差值R的大小可以得出影響總皂甙的提取的因素順序?yàn)樘崛∫簼舛?提取溫度>料液比>提取時(shí)間，即最佳提取條件為A2B3C3D3。

表6 正交試驗(yàn)結(jié)果

從表7可以看出影響山丹丹總皂苷提取的因素中，提取溫度具有極顯著性差異，說明溫度對(duì)總皂苷含量的影響最為顯著，而料液比和提取時(shí)間有顯著性差異，說明料液比和提取時(shí)間對(duì)總皂苷的提取有一定影響。結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)即用濃度為70%，在60℃回流提取3次，每次3 h。經(jīng)方差分析[8]可以的出A、B、C都具有特別顯著性差異，表明提取溫度、料液比、提取時(shí)間對(duì)總皂甙含量的影響顯著。而提取液濃度對(duì)提取效果影響較小。

表7 正交試驗(yàn)方差分析表

3.3 效應(yīng)曲線圖結(jié)果分析

通過圖2能更為直觀的分析出，提取溫度、料液比、提取時(shí)間這3個(gè)的因素是隨著設(shè)置的增加提取率則相應(yīng)得增加。提取液濃度則是先降低再增加。結(jié)合之前正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)的結(jié)果，可以得出本次試驗(yàn)最佳的提取方案為A2B3C3D3，即提取溫度為70℃，1∶10的料液比例，回流提取3 h，提取液濃度為80%。

圖2 山丹丹總皂甙提取效應(yīng)曲線圖

4 結(jié)論

4.1 本試驗(yàn)通過單因素實(shí)驗(yàn)得知提取溫度、料液比、提取時(shí)間和提取液濃度對(duì)山丹丹皂苷提取效果有一定的影響。根據(jù)正交試驗(yàn)研究，在一定的基礎(chǔ)上明確了山丹丹皂苷提取過程中的各個(gè)條件的摸索以及優(yōu)化，并且得出了在70℃，10倍于材料的80%的乙醇提取液，提取3 h的條件下，可以得到比較高的山丹丹皂苷提取量。

4.2 試驗(yàn)中的還存在如下問題：由于試驗(yàn)條件和時(shí)間的限制，只選取了三個(gè)比較窄的范圍作為考察內(nèi)容，而在提取液濃度方面應(yīng)該設(shè)置更為廣泛的濃度梯度，以便于更為準(zhǔn)確的找出適宜的提取濃度，提高提取產(chǎn)量；本試驗(yàn)參考相關(guān)文獻(xiàn)綜合比較選擇了提取次數(shù)為3次，而沒有進(jìn)行試驗(yàn)性的研究探索，后續(xù)工作會(huì)針對(duì)提取次數(shù)對(duì)皂苷提取率的影響做進(jìn)一步的試驗(yàn)研究；在提取過程中發(fā)現(xiàn)部分提取液的浪費(fèi)比較嚴(yán)重，這必然造成極大浪費(fèi)。

[1]中國(guó)人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中國(guó)藥典，1995版[M].廣州：廣東科技出版社，1995：107.

[2]吳曉斌，任鳳蓮，邱昌桂，等.百合皂苷的提取﹑純化及其鑒定[J].廣州化學(xué)，2005，30(2)：36-40..

[3]楊林莎，孫艷紅，方曉艷.中藥百合的研究進(jìn)展[J].河南中醫(yī)藥學(xué)刊，2002，17(1)：74-6.

[4]吳英華，郭宇，任鳳蓮.打孔媳婦數(shù)值春花百合皂甙的工藝研究[J].化工科技，2009，17(3)：24-25.

[5]梁朝輝.黃豆皂甙的提取和分離方法的初探[J].中國(guó)公共衛(wèi)生，1999，15(11)：1043-1044.

[6]潘青友.百合渣中總皂苷的提取純化與免疫活性研究[D].無錫：江南大學(xué)，2013.

[7]鄭用熙.分析化學(xué)中的數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法[M].北京：科學(xué)出版社，1986：180-219.

[8]王叔淳.食品分析數(shù)理統(tǒng)計(jì)與質(zhì)量控制[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1991：68-101.

[責(zé)任編輯 李曉霞]

2015-03-10

陜西省高水平大學(xué)建設(shè)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目(生物學(xué)2012SXTS06)，陜西科技廳農(nóng)業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目(2012k01-12)，陜西省教育廳科研計(jì)劃項(xiàng)目(2012JK835)，延安市科技項(xiàng)目(2012ks-13)共同資助。

賀曉龍(1982—)，男，陜西臨潼人，延安大學(xué)實(shí)驗(yàn)師。 *通訊作者

Q946.83

A

1004-602X(2015)02-0073-04