戴紅良，賈桂枝，趙 頌，趙 艷，張曉紅，王洪新

(遼寧醫(yī)學(xué)院 1.護(hù)理學(xué)院、2.遼寧省心腦血管藥物研究重點實驗室、3.生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室、4.科學(xué)實驗中心，遼寧 錦州 121001)

黃芪多糖對異丙腎上腺素誘發(fā)的SERCA2a表達(dá)及活性降低的影響

戴紅良1,2，賈桂枝3，趙 頌4，趙 艷4，張曉紅3，王洪新2

(遼寧醫(yī)學(xué)院 1.護(hù)理學(xué)院、2.遼寧省心腦血管藥物研究重點實驗室、3.生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室、4.科學(xué)實驗中心，遼寧 錦州 121001)

目的 探討黃芪多糖對異丙腎上腺素(isopreterenol, ISO)刺激下心肌細(xì)胞SERCA2a表達(dá)的影響。方法 采用Real-time PCR法檢測SERCA2a mRNA的表達(dá)；利用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測SERCA2a蛋白的表達(dá)。以4-硝基酚磷酸二鈉(p-NPP)法檢測SERCA2a的活性。結(jié)果 與對照組相比，ISO組心肌細(xì)胞SERCA2a mRNA及蛋白的表達(dá)均明顯降低，而黃芪多糖劑量依賴性地逆轉(zhuǎn)上述降低。此外，黃芪多糖還可明顯提高SERCA2a的活性。結(jié)論 黃芪多糖可緩解ISO引起的SERCA2a表達(dá)及活性的下調(diào)。該作用可能是黃芪多糖緩解心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，進(jìn)而發(fā)揮其心血管保護(hù)作用的重要機(jī)制。

黃芪多糖；心肌細(xì)胞；異丙腎上腺素；Ca2+超載；SERCA2a；心肌保護(hù)

黃芪多糖(astragalus polysaccharide, APS)是補(bǔ)氣中藥黃芪的有效成分之一。具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗腫瘤等多種生物活性[1-3]。研究發(fā)現(xiàn)，APS具有明顯的心血管保護(hù)效應(yīng)。APS經(jīng)口服給藥后對糖尿病心肌病及心肌肥厚等都有一定的改善作用[4]。我們最近的研究證實，APS抗肥厚的機(jī)制與其對細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載的抑制作用有關(guān)[5]。但對其抑制Ca2+超載的機(jī)制尚不明確。研究發(fā)現(xiàn)黃芪注射液可明顯抑制肌質(zhì)網(wǎng)/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATP酶2a(sarco/endoplasmic reticulum 2a, SERCA2a)的表達(dá)[6]，APS對糖尿病心肌病心臟SERCA2a表達(dá)也呈現(xiàn)明顯抑制效應(yīng)[7]，于是，我們推測APS的抗心肌細(xì)胞Ca2+超載效應(yīng)可能與其抑制SERCA 2a的表達(dá)有關(guān)。本研究將探討APS對SERCA2a表達(dá)及活性的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物出生1～3 d的Sprague-Dawley(SD)大鼠乳鼠，♀♂不拘，由遼寧醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。

1.2 藥品與試劑APS購自陜西森弗生物技術(shù)有限公司(純度大于98%)。胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料研究所；胰蛋白酶、DMEM低糖培養(yǎng)基、異丙腎上素素(isopreteronol， ISO)、4-硝基酚(p-NP)、4-硝基酚磷酸二鈉(p-NPP)均購于美國Sigma公司；牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)蛋白定量試劑盒美國Pierce公司；SERCA2a一抗購于美國Promega公司；β-actin一抗購于美國Sigma公司；辣根過氧化物酶(horseradish peroxide, HRP)標(biāo)記的二抗購于美國Santa Cruz公司。TRIzol 試劑購自美國Invitrogen公司，引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，逆轉(zhuǎn)錄及實時熒光定量PCR試劑盒購自大連寶生物工程有限公司。

1.3 新生大鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)新生大鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)方法，參照文獻(xiàn)[8]。 取出生1～3 d SD大鼠乳鼠，開胸取出心臟，用D-Hanks液沖洗3次后剪成約1 mm3大小的碎塊，在37 ℃條件下，以0.8 g/L胰蛋白酶消化分離細(xì)胞。將消化完畢的細(xì)胞以差速貼壁法進(jìn)行純化后，置于含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合后，換以含0.04%胎牛血清的DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，將細(xì)胞分組用于實驗。

1.4 Real-time PCR測心肌細(xì)胞內(nèi)SERCA2a mRNA的表達(dá)采用TRIzol提取細(xì)胞中總RNA，用紫外分光光度儀測定RNA的濃度和純度，要求A260/A280=1.8～2.0。cDNA合成：0.5 μg RNA, 25℃、10 min，48℃、30 min，95℃、5 min。采用SYBR Green I熒光染料，參照試劑盒說明完成qPCR。目的基因SERCA2a上游引物為5′-TCTGACTTTCGTTGGCTGTG-3′,下游引物為5′-GCCTTTGTTATCCCCAGTGA-3′,內(nèi)參基因β-actin上游引物為5′-TCTGTGTGGATTGGTGGCTCTA-3′,下游引物為5′-CTGCTTGCTGATCCACATCTG-3′。PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃ 30 s，95℃ 5 s、60℃ 30 s 40個循環(huán)。獨立實驗重復(fù)3次，采用相對定量法(comparative delta-delta Ct)定量。

1.5 Western blot測心肌細(xì)胞內(nèi)SERCA2a蛋白的表達(dá)收集細(xì)胞，加細(xì)胞裂解液RIPA[( 1%乙基苯基聚乙二醇 (nonidet P 40, NP-40)，0.5% 脫氧膽酸鈉，l%十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate, SDS)，0.1%苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonylfluoride, PMSF)] 提取細(xì)胞總蛋白，2,2-聯(lián)喹啉-4,4-二甲酸二鈉(bicinchoninic acid，BCA)法測定蛋白濃度。取50 μg總蛋白，以1×樣品緩沖液配平上樣體積，沸水煮5 min后置10% SDS-PAGE中進(jìn)行電泳，待電泳完成后電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜。用5%脫脂牛奶封閉1 h，接著加SERCA2a及GAPDH一抗4 ℃孵育過夜。TBS-T充分洗膜后，以HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h。TBS-T洗膜后，化學(xué)發(fā)光法(enhanced chemiluminescence，ECL)顯色。 利用美國國立衛(wèi)生研究院(national institutes of health，NIH) ImageJ 1.42軟件對掃描的條帶進(jìn)行灰度分析。

1.6 SERCA2a活性檢測心肌細(xì)胞在4℃勻漿，12 000 r·min-1離心20 min后，收集上清進(jìn)行蛋白定量及SERCA2a的活性檢測。20 μl 上清加入100 μl 反應(yīng)體系 (mmol·L-1：MgCl21.5， EGTA 1.5，KCl 150，HEPES 20，0.01%TritonX-100，含或不含CaCl26.5；pH 7.4)中。37℃孵育10 min后加入100 mmol·L-14-硝基酚磷酸二鈉(p-NPP)10 μl，再孵育30 min后加入2 ml 反應(yīng)終止液 (500 mmol·L-1Tris，55 mmol·L-1EDTA)。用分光光度計在波長405 nm處讀取光密度值，并通過4-硝基酚(p-NP)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行換算。SERCA2a活性用每分鐘每克蛋白產(chǎn)生的p-NP的微摩爾數(shù)(μmol·g-1·min-1)表示。

2 結(jié)果

2.1 APS對心肌細(xì)胞SERCA2a mRNA表達(dá)的影響與正常組比較，心肌細(xì)胞經(jīng)10 μmol·L-1ISO處理48 h后SERCA2a mRNA表達(dá)明顯降低。APS能劑量依賴性地緩解此種降低，見Fig 1。

2.2 APS對心肌細(xì)胞SERCA2a蛋白表達(dá)的影響與正常組比較，心肌細(xì)胞經(jīng)10 μmol·L-1ISO處理48 h后SERCA2a 蛋白表達(dá)明顯降低。APS能劑量依賴性地緩解此種降低，見Fig 2。

Fig 1 Effect of APS on expression of SERCA2a mRNA in rat cardiac myocytes(n=3)

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsISO group.

Fig 2 Effect of APS on expression of SERCA2a protein in rat cardiac myocytes (n=3)

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsISO group.

2.3 APS對心肌細(xì)胞SERCA2a活性的影響與正常組比較，心肌細(xì)胞經(jīng)10 μmol·L-1ISO處理48 h后，SERCA2a活性明顯降低。APS能劑量依賴性地緩解此種降低，見Fig 3。

3 討論

Ca2+超載是指細(xì)胞內(nèi)Ca2+的異常性升高。在正常情況下，Ca2+作為一個重要的細(xì)胞內(nèi)第二信使，在心肌電活動及興奮-收縮偶聯(lián)中發(fā)揮著必不可少的作用。在正常情況下，心肌細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度是受到多種機(jī)制的嚴(yán)密調(diào)控的。當(dāng)心肌細(xì)胞因去極化興奮時，Ca2+循細(xì)胞膜上的內(nèi)向鈣電流(inward Ca2+current, ICa)進(jìn)入心肌細(xì)胞，進(jìn)入的Ca2+又誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)肌質(zhì)網(wǎng)Ca2+向胞質(zhì)的進(jìn)一步釋放，最終引起心肌細(xì)胞內(nèi)的游離Ca2+濃度升高。當(dāng)Ca2+濃度升高到一定程度時即引起心肌的收縮。接著， Ca2+又轉(zhuǎn)運出胞質(zhì)，從而使心肌舒張。目前已發(fā)現(xiàn)有4條通路負(fù)責(zé)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+的恢復(fù)，即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣泵、細(xì)胞膜Na+/Ca2+交換體、細(xì)胞膜鈣泵和線粒體Ca2+單向輸送體[9]。當(dāng)上述各種調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的機(jī)制發(fā)生異常時，便可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的異常升高，即出現(xiàn)Ca2+超載。

Fig 3 Effect of APS on SERCA2a activity (n=5)

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsISO group.

各種心血管異常表現(xiàn)如缺血/再灌注損傷、心律失常、心肌細(xì)胞肥大及凋亡等都與心肌細(xì)胞內(nèi)的Ca2+超載密切相關(guān)[10-13]。我們之前研究發(fā)現(xiàn)黃芪多糖能夠明顯抑制ISO作用下心肌細(xì)胞內(nèi)的舒張期Ca2+超載。本實驗在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討黃芪多糖改善Ca2+超載的機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，92%舒張期胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度的恢復(fù)依賴于SERCA2a的重攝取[14]。ISO是誘發(fā)SERCA表達(dá)及活性降低的重要因素[15]。最近發(fā)現(xiàn)APS可抑制糖尿病心肌病心臟SERCA2a的表達(dá)[7]。我們在本研究中檢測了APS對ISO作用下SERCA2a表達(dá)及活性的影響。結(jié)果顯示，ISO明顯地降低了SERCA2a的mRNA及蛋白的表達(dá)及其活性，而APS能夠劑量依賴性逆轉(zhuǎn)上述改變。表明APS可以阻止ISO引起的SERCA2a mRNA及蛋白水平的下調(diào)，從而維持SERCA2a攝取靜息期Ca2+的能力，緩解心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)，APS可緩解ISO引起的SERCA2a表達(dá)及活性的下調(diào)。該作用可能是APS緩解心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，進(jìn)而發(fā)揮其心血管保護(hù)作用的重要機(jī)制。

[1] Du X, Zhao B, Li J, et al. Astragalus polysaccharides enhance immune responses of HBV DNA vaccination via promoting the dendritic cell maturation and suppressing Treg frequency in mice[J].IntImmunopharmacol, 2012, 14(4): 463-70.

[2] Huang W M, Liang Y Q, Tang L J, et al. Antioxidant and anti-inflammatory effects of Astragalus polysaccharide on EA.hy926 cells[J].ExpTherMed, 2013, 6(1):199-203.

[3] Li J, Bao Y, Lam W, et al. Immunoregulatory and anti-tumor effects of polysaccharopeptide and astragalus polysaccharides on tumor-bearing mice[J].ImmunopharmImmunot, 2008, 30(4): 771-82.

[4] Chen W, Yu M H, Li Y M, et al. Beneficial effects of astragalus polysaccharides treatment on cardiac chymase activities and cardiomyopathy in diabetic hamsters[J].Actadiabetologica, 2010, 47 (Suppl 1): 35-46.

[5] Dai H L, Jia G Z, Liu X, et al. Astragalus polysaccharide inhibits isoprenaline-induced cardiac hypertrophy via suppressing Ca2+-mediated calcineurin/NFATc3 and CaMKII signaling cascades[J].EnvironToxicolPharmacol, 2014, 38(1): 263-71.

[6] 盧 振, 胡申江, 孫 堅, 等. 黃芪對SHR心肌SERCA表達(dá)及血管平滑肌鈣離子水平影響的初步探討[J]. 浙江中醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 2004, 28(5): 60-2.

[6] Lu Z, Hu S J, Sun J, et al. Effect of astragalus membranaceus on Ca2+-ATPase in the myocardium and calcium Ions content in vascular smooth muscle in spontaneously hypertensive rats[J].JZhejiangColofTraChinMed, 2004, 28(5): 60-2.

[7] Chen W, Xia Y, Zhao X, et al. The critical role of Astragalus polysaccharides for the improvement of PPARalpha [ correction of PPRAalpha]-mediated lipotoxicity in diabetic cardiomyopathy[J].PloSOne, 2012, 7(10): e45541.

[8] 賈桂枝,王洪新,李 紅,等. 左卡尼汀調(diào)控鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶表達(dá)抑制過氧化氫誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡作用[J]. 中國藥理學(xué)通報, 2014, 30(3):425-8.

[8] Jia G Z, Wang H X, Li H, et al. Anti-apoptotic effect of L-carnitine on H2O2-induced cardiomyocytesvia inhibition of calcineurin overexpression[J].ChinPharmacolBull, 2014, 30(3):425-8.

[9] Meng D, Chen X J, Bian Y Y, et al. Effect of astragalosides on intracellular calcium overload in cultured cardiac myocytes of neonatal rats[J].AmJChinMed, 2005, 33(1): 11-20.

[10] Assayag M, Saada A, Gerstenblith G, et al. Mitochondrial performance in heat acclimation-a lesson from ischemia/reperfusion and calcium overload insults in the heart[J].AmJPhysiolRegulIntegrCompPhysiol, 2012, 303(8): R870-81.

[11] ter Keurs H E, Wakayama Y, Sugai Y, et al. Role of sarcomere mechanics and Ca2+overload in Ca2+waves and arrhythmias in rat cardiac muscle[J].AnnNYAcadSci, 2006, 1080: 248-67.

[12] Pan Z W, Zhang Y, Mei D H, et al. Scutellarin exerts its anti-hypertrophic effects via suppressing the Ca2+-mediated calcineurin and CaMKII signaling pathways[J].NaunynSchmiedebergsArchPharmacol, 2010, 381(2): 137-45.

[13] 戴紅良,賈桂枝,劉 堃,等. 左卡尼汀通過抑制鈣/鈣調(diào)素依賴蛋白激酶Ⅱ信號通路抑制過氧化氫誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞凋亡[J]. 中國病理生理雜志, 2013, 29(7): 1250-4.

[13] Dai H L, Jia G Z, Liu K, et al. L-carnitine inhibits H2O2-induced rat cardiomyocyte apoptosis through suppressing Ca2+/CaMKII signaling pathway[J].ChinJPathophysiol, 2013, 29(7):1250-4.

[14] Bassani J W, Bassani R A, Bers D M. Relaxation in rabbit and rat cardiac cells: speciesdependent differences in cellular mechanisms[J].JPhysiol, 1994, 476(2): 279-93.

[15] Linck B, Boknik P, Baba H A, et al. Long-term beta adrenoceptor-mediated alteration in contractility and expression of phospholamban and sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase in mammalian ventricle[J].JPharmacolExpTher, 1998, 286(1):531-8.

Effect of astragalus polysaccharide on isopreterenol induced SERCA2a expression and activity downregulation

DAI Hong-liang1,2, JIA Gui-zhi3, ZHAO Song4, ZHAO Yan4, ZHANG Xiao-hong3, WANG Hong-xin2

(1.SchoolofNursing, 2.LiaoningProvincialKeyLaboratoryofCardiovascularandCerebrovascularDrugResearch, 3.DeptofBiochemistryandMolecularBiology, 4.CentreofScientificExperiment,LiaoningMedicalUniversity,JinzhouLiaoning121001,China)

Aim To explore the effect of astragalus polysaccharide (APS) on SERCA2a expression and activity in cardiac myocytes under isopreterenol (ISO) stimulation. Methods SERCA2a mRNA and protein expression were evaluated by real-time PCR and Western blot, respectively. SERCA2a activity was determined by p-NPP method. Results Compared with control, cardiomyocytes in ISO group exhibited significantly decreased expression of SERCA2a both in mRNA and protein levels. APS reversed these decreases in a dose-dependent manner. Furthermore, APS also significantly improved SERCA2a activity. Conclusions APS effectively buffers ISO induced downregulation of SERCA2a expression and activity. These effects appear to mediate APS’s cardiovascular protection against Ca2+overload.

astragalus polysaccharide; cardiomyocyte; isopreteronol; Ca2+overload; SERCA2a; cardioprotection

時間：2015-3-3 11:08 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150303.1108.018.html

2014-11-08,

2014-12-24

國家自然科學(xué)基金資助項目(No 30973898)

戴紅良(1982-), 男, 博士, 講師，研究方向:心血管藥理學(xué), E-mail: jy2006hldai@sohu.com; 王洪新(1964-), 男, 博士, 教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向:心血管藥理學(xué), 通訊作者，E-mail: jyhxwang@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.03.018

A

1001-1978(2015)03-0388-04

R-332；R284.1；R322.11；R348.1；R542.2；R977.6