周 密，何百成，秧茂盛,2

(1.重慶市生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016; 2.吉首大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理教研室，湖南 吉首 416000)

美洛昔康抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖與Wnt/β-catenin 信號(hào)的關(guān)系研究

周 密1，何百成1，秧茂盛1,2

(1.重慶市生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016; 2.吉首大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理教研室，湖南 吉首 416000)

目的 研究美洛昔康(meloxicam，Mel)對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo增殖抑制作用及其機(jī)制。方法 以人結(jié)腸癌細(xì)胞株LoVo為研究對(duì)象，體外藥物敏感試驗(yàn)(結(jié)晶紫染色)和流式細(xì)胞術(shù)(FCM)分析Mel對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用；流式細(xì)胞術(shù)和HE染色檢測(cè)Mel對(duì)細(xì)胞凋亡的影響；螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒檢測(cè)Mel對(duì)Wnt/β-catenin通路信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響；Western blot檢測(cè)Mel對(duì)細(xì)胞內(nèi)β-catenin蛋白水平的影響。結(jié)果 與對(duì)照組相比，Mel能抑制LoVo細(xì)胞增殖，72 h、100 μmol·L-1Mel的細(xì)胞抑制率高達(dá)(57.635±3.86)%(t=10.044，P=0.001)；Mel能誘導(dǎo)LoVo細(xì)胞凋亡，24 h、60 μmol·L-1Mel的細(xì)胞凋亡率達(dá)到(33.6±1.7)%(t=30.166，P=0.001)；Mel能降低TCF/LEF及Myc/Max報(bào)告質(zhì)粒的螢光素酶活性，24 h、60 μmol·L-1Mel 可使TCF/LEF和Myc/Mac報(bào)告的熒光素酶活性分別降至(40.05±2.79)%(t=14.864,P=0.001)和(35.9±2.38)%(t=16.904,P=0.001)；Mel能下調(diào)細(xì)胞內(nèi)β-catenin蛋白水平，40 μmol·L-1Mel在24、48 h時(shí)，可將β-catenin蛋白水平分別降至(71±3.78)%(t=7.353，P=0.003)、(52.66±3.57)%(t=11.724，P=0.001)。結(jié)論 Mel能抑制LoVo細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，其機(jī)制可能與抑制 Wnt /β-catenin通路信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，降低細(xì)胞內(nèi)β-catenin蛋白水平有關(guān)。

美洛昔康；人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞；增殖抑制；凋亡誘導(dǎo)；Wnt /β-catenin信號(hào)；β-catenin蛋白

美洛昔康(meloxicam，Mel)是一種烯醇胺類(lèi)的非甾體抗炎藥(NSAIDs)，是臨床上控制風(fēng)濕性疾病的主要藥物之一，其胃腸道副作用較少、腎毒性較低。目前已有研究顯示，Mel在不同類(lèi)型腫瘤包括胃癌、乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌等具有增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用，但相關(guān)機(jī)制還有待闡明[1-3]。結(jié)腸癌(colorectal carcinoma, CRC)是一種發(fā)病率和死亡率呈逐年上升的惡性腫瘤，在常見(jiàn)的胃腸道惡性腫瘤中，結(jié)腸癌的發(fā)病率位居全球第2位。結(jié)腸癌診療技術(shù)的發(fā)展為患者帶來(lái)了一定的福音，但晚期患者的預(yù)后仍不理想，5年生存率仍維持在50%左右[4]。早期結(jié)腸癌的首選治療方式是手術(shù)切除，而晚期或復(fù)發(fā)病例則以藥物治療為主。研究表明，Wnt信號(hào)通路在腸道發(fā)育和腫瘤發(fā)生過(guò)程中扮演重要角色；β-catenin 蛋白水平調(diào)節(jié)因子發(fā)生突變，可導(dǎo)致β-catenin蛋白的胞質(zhì)和核累積，使Wnt信號(hào)通路被過(guò)度激活，可能參與結(jié)腸癌的發(fā)生[5-6]。因此，β-catenin 可能是結(jié)腸癌的藥物治療靶點(diǎn)。本工作研究Mel對(duì)結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其相關(guān)機(jī)制，期望能給Mel的抗腫瘤新用途提供初步的實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)與相關(guān)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑及細(xì)胞培養(yǎng)人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞購(gòu)自ATCC(American Type Culture Collection)；Meloxicam購(gòu)自西安昊軒生物科技有限公司；試驗(yàn)所用抗體購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology公司；Lipofectamine購(gòu)自Invitrogen公司；培養(yǎng)細(xì)胞采用DMEM高糖培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、100 kU ·L-1青霉素和0.1 g·L-1鏈霉素)、DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清均購(gòu)自Hyclone；培養(yǎng)條件為5% CO2和37 ℃。其它常用的生物化學(xué)和分子生物學(xué)試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及分組分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組使用Mel處理，Mel用DMSO溶解，設(shè)立20、40、60、80和100 μmol·L-1五個(gè)實(shí)驗(yàn)組；對(duì)照組的處理是使用相同體積的DMSO。

1.3 結(jié)晶紫染色法評(píng)估增殖生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的細(xì)胞鋪于24孔板，每孔的細(xì)胞數(shù)目為5×103，分別使用20、40、60、80和100 μmol·L-1的Mel或加入DMSO溶劑處理。藥物作用細(xì)胞24、48和72 h后進(jìn)行結(jié)晶紫染色以檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的試驗(yàn)重復(fù)3次。移除培養(yǎng)基，用預(yù)冷PBS(4 ℃)洗3次去除殘余培養(yǎng)基。每孔加入用PBS緩沖、用體積分?jǐn)?shù)為 0.1的甲醛配制的飽和結(jié)晶紫溶液0.2 mL， 室溫下孵育25 min后，棄結(jié)晶紫染液，用PBS清洗3次以除去未與細(xì)胞結(jié)合結(jié)晶紫。將24孔板置于室溫下晾干后進(jìn)行掃描。每孔加入體積分?jǐn)?shù)為 0.2 的乙酸 0.2 mL震蕩 10 min以溶解結(jié)晶紫，采用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定OD值(λ =590 nm)定量。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的細(xì)胞接種于6 孔板，每孔細(xì)胞數(shù)目為1×105，貼壁后按實(shí)驗(yàn)分組分別加入20、40、60 μmol·L-1的Mel或加入DMSO溶劑處理24 h，用無(wú)EDTA的胰蛋白酶消化收集細(xì)胞后，用預(yù)冷PBS(4 ℃)洗滌2次，隨后重懸于1 mL PBS(4 ℃)。收集的細(xì)胞通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞周期和凋亡分析，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒法將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的細(xì)胞接種于T25培養(yǎng)瓶，每瓶細(xì)胞數(shù)為1×106。 細(xì)胞貼壁后，每個(gè)T25用Lipofectamine轉(zhuǎn)染3.0 μg LEF/TCF4報(bào)告質(zhì)粒(pTOP-Luc)和E-box報(bào)告質(zhì)粒(pBG-Myc/Max-Luc)，轉(zhuǎn)染6 h后換DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。換液12 h后消化細(xì)胞，并接種于24孔板中，每孔的細(xì)胞數(shù)目為5×103，細(xì)胞貼壁后按實(shí)驗(yàn)分組分別加入20、40、60 μmol·L-1的Mel進(jìn)行干預(yù)或加入DMSO溶劑處理。24 h后，充分裂解細(xì)胞，樣品上機(jī)檢測(cè)。螢光素酶活性測(cè)定Wnt/β-catenin信號(hào)通路活性，方法參照試劑盒(美國(guó)NEB公司)說(shuō)明書(shū)；BCA 法測(cè)定抽提總蛋白濃度用于結(jié)果校正；每組重復(fù)3次。

1.6 HE染色每組取對(duì)數(shù)期2×103個(gè)細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞爬片，24 h后分別使用20、40、60 μmol·L-1的Mel或加入DMSO溶劑干預(yù)。加藥24 h后棄培養(yǎng)基，用體積分?jǐn)?shù)為0.95的酒精固定細(xì)胞，用蘇木精和伊紅分別對(duì)細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行染色，然后進(jìn)行梯度乙醇脫水、二甲苯透明，最后滴加中性樹(shù)脂封片。凋亡細(xì)胞鑒定經(jīng)典的形態(tài)學(xué)特征使用正置顯微鏡(日本Nikon)，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 Western blot 實(shí)驗(yàn)將對(duì)數(shù)期細(xì)胞接種于6 孔板中，每孔中的細(xì)胞數(shù)為1×105，分別使用20、40 μmol·L-1的Mel和DMSO溶劑處理，并設(shè)溶劑對(duì)照，相同條件下分別培養(yǎng)24 h、48 h后收集細(xì)胞，抽提各組總蛋白，細(xì)胞裂解和溶胞產(chǎn)物通過(guò)煮沸10 min變性，采用BCA法進(jìn)行總蛋白定量；總蛋白用10%的變性聚丙烯酰胺不連續(xù)凝膠(SDS-PAGE)進(jìn)行電泳，將目標(biāo)蛋白從凝膠電轉(zhuǎn)至PVDF 膜，隨后按Western blot常規(guī)方法進(jìn)行操作，化學(xué)發(fā)光法ECL顯影，凝膠成像儀(美國(guó)BIO-RAD公司)成像并分析結(jié)果；每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 Mel對(duì)細(xì)胞增殖的影響結(jié)晶紫染色及細(xì)胞周期分析結(jié)果顯示(Fig 1)，Mel干預(yù)組與對(duì)照組相比增殖明顯受到抑制，量化結(jié)果顯示(Tab 1),Mel的增殖抑制作用表現(xiàn)為時(shí)間和濃度依賴性。流式細(xì)胞周期結(jié)果顯示，G1期細(xì)胞明顯增多，細(xì)胞DNA合成受到阻滯。Mel能明顯抑制人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞增殖。

Fig 1 Effects of meloxicam on the proliferation of LoVo cells

LoVo cells were treated with different concentrations of meloxicam for 24, 48 and 72 h, followed by crystal violet viability assay and flow cytometry analysis. A: Crystal violet staining results; B: Flow cytometry measurement of cell cycle.

Tab 1 The analysis results of the crystal violet staining

**P<0. 01vscontrol group.

2.2 Mel對(duì)細(xì)胞凋亡的影響流式細(xì)胞分析及 HE染色結(jié)果顯示(Fig 2)，分別使用20、40 和 60 μmol·L-1Mel處理LoVo細(xì)胞24 h后，細(xì)胞凋亡率以濃度依賴的方式而增加，對(duì)照組的凋亡率為(4.47±0.19)%，而20、40 和 60 μmol·L-1的Mel組的細(xì)胞凋亡率分別為(10.04±0.56)%(t=16.324，P=0.001)、(16.14±0.71)%(t=25.145，P=0.001)、(33.6±1.7)%(t=30.766，P=0.001)。HE染色結(jié)果直觀地顯示，在(400×)正置顯微鏡下，細(xì)胞凋亡的經(jīng)典形態(tài)學(xué)變化包括細(xì)胞收縮，核固縮，細(xì)胞偽足減少等。Mel能促進(jìn)LoVo 細(xì)胞凋亡。

Fig 2 Effects of meloxicam on apoptosis in LoVo cells

LoVo cells were treated with different concentrations of meloxicam for 24 h, followed by flow cytometry measurement of cell apoptosis and H&E stain. A: Flow cytometry measurement of apoptosis; B: HE stain results.

2.3 Mel對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響根據(jù)螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒結(jié)果(Fig 3)，TCF/LEF轉(zhuǎn)錄活性數(shù)值：與對(duì)照組比較，20 μmol·L-1組降至(91.23±4.78)%(t=1.87，P=0.141)；40 μmol·L-1組降至(62.79±3.05)%(t=9.074，P=0.003)；60 μmol·L-1組降至(40.05±2.79)%(t=14.864,P=0.001)。Myc/Max轉(zhuǎn)錄活性數(shù)值：與對(duì)照組比較，20 μmol·L-1組降至(88.64±4.91)%(t=2.45，P=0.074)；40 μmol·L-1組降至(55.28±3.35)%(t=11.044，P=0.001)；60 μmol·L-1組降至(35.9±2.38)%(t=16.904,P=0.001)。Mel作用后，LoVo細(xì)胞中LEF/TCF4與c-Myc/Max的轉(zhuǎn)錄活性明顯降低，且呈濃度依賴性。Mel能明顯下調(diào)細(xì)胞Wnt /β-catenin通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。

Fig 3 Effects of meloxicam on Wnt/β-catenin pathway signaling transduction of LoVo cells

pTOP-luc and p-SEB-Myc/Max-luc plasmids were employed to transfect LoVo cells. Then，cells were treated with different concentrations of meloxicam for 24 h, followed with luciferase activity quantitative.**P<0. 01vscontrol group.

2.4 Mel對(duì)細(xì)胞β-catenin蛋白水平的影響Western blot試驗(yàn)結(jié)果顯示(Fig 4)，在24 h時(shí)間點(diǎn)，與對(duì)照組相比，20 μmol·L-1組的β-catenin蛋白水平降至(92.1±4.56)%(t=1.900，P=0.134)；40 μmol·L-1組降至(71.05±3.78)%(t=7.353，P=0.003)。在48 h 時(shí)間點(diǎn)，與對(duì)照組相比，20 μmol·L-1組的β-catenin蛋白水平降至(88.08±3.34)%(t=2.801，P=0.054)；40 μmol·L-1組降至(52.66±3.57)%(t=11.724，P=0.001)。Mel能明顯下調(diào)LoVo細(xì)胞中β-catenin蛋白表達(dá)水平，且呈時(shí)間和濃度依賴性。

3 討論

結(jié)腸癌是一種發(fā)病率和致死率均較高的惡性腫瘤。因此，探討結(jié)腸癌細(xì)胞增殖凋亡的相關(guān)因素及其分子機(jī)制，將有利于尋找新的治療途徑。目前認(rèn)為，Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活可能是結(jié)腸癌的病理機(jī)制之一，多數(shù)結(jié)腸癌細(xì)胞均有β-catenin突變[7-10]。已有的證據(jù)表明，Mel可降低結(jié)腸癌、乳腺癌、食管癌和胃癌等的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，提高抗癌治療的效果[11]。然而，Mel的抗癌作用機(jī)制尚不十分清楚。

Fig 4 Effects of meloxicam on protein level of β-catenin in LoVo cells

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Mel能抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo的增殖，促進(jìn)LoVo細(xì)胞凋亡，而且這種抑制增殖或促進(jìn)凋亡作用均具有時(shí)間和濃度依賴性。此外，Mel可降低LoVo細(xì)胞中β-catenin蛋白水平；β-catenin的下調(diào)可抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和促進(jìn)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而下調(diào)或抑制結(jié)腸癌細(xì)胞中過(guò)度激活的Wnt/β-catenin信號(hào)通路?？梢?jiàn)，Mel對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo的抑制增殖或促進(jìn)凋亡作用可能與干擾Wnt/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)。然而，Mel是如何調(diào)節(jié)β-catenin蛋白表達(dá)的？如何抑制Wnt信號(hào)通路的？其詳細(xì)機(jī)制還有待于進(jìn)一步的深入研究?？傊狙芯拷Y(jié)果給Mel的抗腫瘤新用途提供初步的理論依據(jù)與實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，對(duì)結(jié)腸癌的臨床防治具有一定的參考價(jià)值，對(duì)研究其它類(lèi)似藥物的臨床新用途具有借鑒意義。

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Anti-proliferative effect of meloxicam and Wnt/β-catenin signal in colon cancer cells

ZHOU Mi1, HE Bai-cheng1, YANG Mao-sheng1,2

(1.ChongqingKeyLaboratoryofBiochemistryandMolecularPharmacology,Chongqing400016,China；2.DeptofPharmacology,SchoolofMedicine,JishouUniversity,JishouHunan416000,China)

Aim To investigate the inhibitory effect of meloxicam (Mel) on human colon cancer LoVo cells and its mechanism. Methods Crystal violet staining assay and flow cytometry assay were performed to determine the anti-proliferative effect of Mel. Flow cytometry assay and H&E assay were used to evaluate the apoptotic effect of Mel. Luciferase reporter plasmid ISRE-Luc was employed to measure the effect of Mel on the activation of Wnt/β-catenin signaling transduction. Western blot assay was used to detect effect of Mel on the expression level of β-catenin protein. Results Compared with the control group, the inhibitory rate of cell proliferation at 72 h and 100 μmol·L-1Mel was (57.635±3.86)% (t=10.044，P=0.001); the cell apoptotic rate at 24 h and 60 μmol·L-1Mel was (33.6±1.7)% (t=30.166，P=0.001); the transcriptional activities of TCF/LEF and Myc/Max at 24 h and 60 μmol·L-1were (40.05±2.79)% (t=14.864,P=0.001) and (35.9±2.38)% (t=16.904,P=0.001) respectively; the levels of intracellular β-catenin protein at 24 h or 48 h and 40 μmol·L-1were (71±3.78)%(t=7.353，P=0.003)or (52.66±3.57)%(t=11.724，P=0.001)respectively. Conclusion Mel may inhibit proliferation and promote apoptosis of LoVo cells by inhibiting Wnt/β-catenin pathway signaling transduction and decreasing intracellular β-catenin protein level.

meloxicam; human colon cancer LoVo cells; anti-proliferation; apoptosis; Wnt /β-catenin signal; β-catenin protein

時(shí)間：2015-3-3 11:08 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150303.1108.020.html

2014-12-02,

2015-01-28

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81071462，81372120)

周 密(1987-)，女，碩士生，研究方向：分子藥理學(xué)，E-mail:137127220@qq.com; 秧茂盛(1965-)，男，博士，教授，研究方向：藥理學(xué)，通訊作者,Tel: 0743-8759168， E-mail:1724041576@qq.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.03.020

A

1001-1978(2015)03-0396-05

R329.24；R329.25；R735.350.22；R979.1