建立以α-突觸核蛋白損傷為靶點(diǎn)的細(xì)胞篩選模型

閆文芬, 衡 洋，邵千航，陳乃宏，苑玉和

(天然藥物活性物質(zhì)與功能國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)中心，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院、北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，北京 100050)

建立以α-突觸核蛋白損傷為靶點(diǎn)的細(xì)胞篩選模型

閆文芬, 衡 洋，邵千航，陳乃宏，苑玉和

(天然藥物活性物質(zhì)與功能國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)中心，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院、北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，北京 100050)

目的 建立以α-突觸核蛋白損傷為靶點(diǎn)篩選抗帕金森病創(chuàng)新藥物的細(xì)胞模型。方法 通過(guò)PCR方法擴(kuò)增目的基因，分子克隆技術(shù)構(gòu)建原核表達(dá)載體。融合載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌誘導(dǎo)后表達(dá)重組α-突觸核蛋白，親和層析法純化目的蛋白并通過(guò)蛋白免疫印跡和質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行鑒定，MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率。結(jié)果 α-突觸核蛋白基因的cDNA片段與理論分子量大小一致，并成功克隆至載體pET30a； 測(cè)序正確的融合載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.Coli.BL21(DE3)。轉(zhuǎn)化子經(jīng)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)α-突觸核蛋白，通過(guò)改變溫度、IPTG濃度及宿主菌的增殖狀態(tài)等條件，獲得高表達(dá)菌株；宿主菌的裂解液通過(guò)親和層析方法獲得純化的α-突觸核蛋白，純化蛋白通過(guò)與不同抗體免疫印跡結(jié)果證明為α-突觸核蛋白，質(zhì)譜結(jié)果顯示其分子質(zhì)量為15.3 ku，與理論分子質(zhì)量15.5 ku基本一致。純化的α-突觸核蛋白刺激PC12細(xì)胞及原代神經(jīng)元細(xì)胞后，細(xì)胞存活率明顯下降，存活率的降低程度與α-突觸核蛋白刺激濃度呈正相關(guān)性。結(jié)論 成功建立了以α-突觸核蛋白損傷為靶點(diǎn)的細(xì)胞篩選模型，可用于篩選具有抗帕金森病功能的創(chuàng)新化合物。

α-突觸核蛋白; 毒性作用；帕金森??；篩選模型；蛋白表達(dá)；藥物靶點(diǎn)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是常見的以運(yùn)動(dòng)功能障礙為主要特征的神經(jīng)退行性疾病，臨床常以補(bǔ)充左旋多巴為主的治療，雖然能夠改善PD的臨床癥狀，但無(wú)法遏制其病理性改變。因此，研制能夠延緩病理進(jìn)展的抗PD創(chuàng)新藥物對(duì)于提高人口健康水平具有重要意義。

PD缺乏有效治療藥物的主要原因是缺乏能夠貼切模擬PD臨床與病理變化的模型。因此，針對(duì)PD的病因及發(fā)病機(jī)制建立藥物篩選模型，對(duì)于抗PD創(chuàng)新藥物的研制具有重要意義。PD是多因素綜合作用導(dǎo)致的疾病，除了衰老因素外，環(huán)境因素和遺傳因素共同影響該病的發(fā)生與發(fā)展[1]，而且環(huán)境因素可通過(guò)影響遺傳因素加劇PD的病理過(guò)程及病理改變。因此針對(duì)PD相關(guān)的遺傳因素進(jìn)行抗PD藥物研究更具理論和實(shí)際意義。導(dǎo)致PD發(fā)病的遺傳因素與多種基因的突變、異常表達(dá)等有關(guān)，其中α-突觸核蛋白(α-synuclein,α-syn)基因做為常染色體顯性基因，其基因多倍體、突變后都能夠?qū)е录易逍訮D的發(fā)生[2]，但具體的機(jī)制仍不清楚。鑒于α-突觸核蛋白的異常改變能夠影響PD的發(fā)生與發(fā)展，因此有學(xué)者提出“以α-突觸核蛋白為靶點(diǎn)治療PD”的學(xué)說(shuō)[3]，該學(xué)說(shuō)已得到許多學(xué)者的認(rèn)同，而且也發(fā)現(xiàn)某些具有神經(jīng)保護(hù)功能的化合物能夠?qū)功?突觸核蛋白的毒性作用[4]。因此以α-突觸核蛋白損傷為靶點(diǎn)篩選具有抗PD作用的化合物更具特異性。

最初的研究認(rèn)為α-突觸核蛋白主要存在細(xì)胞內(nèi)，近幾年的研究發(fā)現(xiàn)：α-突觸核蛋白可釋放到細(xì)胞外，而胞外的α-突觸核蛋白具有類似朊蛋白的功能，能夠在神經(jīng)細(xì)胞之間傳遞信息[5]，促進(jìn)神經(jīng)元中路易小體的形成及神經(jīng)元的死亡[6]。目前，有研究發(fā)現(xiàn)外源的α-突觸核蛋白刺激神經(jīng)細(xì)胞后，能夠?qū)ι窠?jīng)細(xì)胞構(gòu)成損傷[7]，提示可建立相應(yīng)的模型進(jìn)行化合物的篩選，但目前應(yīng)用這種模型還很少，其主要原因是α-突觸核蛋白的來(lái)源和獲取受到限制。

當(dāng)前市場(chǎng)上已有商品化的α-突觸核蛋白，但其價(jià)格昂貴，如果應(yīng)用商品化的α-突觸核蛋白建立模型進(jìn)行大規(guī)模藥物篩選將會(huì)造成很大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。本研究旨在通過(guò)建立α-突觸核蛋白原核表達(dá)體系，優(yōu)化表達(dá)和純化條件并完成其科學(xué)鑒定，利用純化的α-突觸核蛋白作用神經(jīng)細(xì)胞，建立以α-突觸核蛋白損傷為靶點(diǎn)的細(xì)胞篩選模型，用于抗PD創(chuàng)新藥物的研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及試劑NdeI和XhoI限制性內(nèi)切酶及Taq酶購(gòu)自TaKaRa，TRIzal購(gòu)自Invitrogen；異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)，咪唑，考馬斯亮藍(lán)R250，SDS，丙烯酰胺，N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺，Agrose購(gòu)自Amersoco；His TrapTMFF 親和層析柱購(gòu)自BD公司；α-突觸核蛋白標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Sigma公司；所有細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；胎牛血清購(gòu)自Invitrogen公司；細(xì)胞培養(yǎng)耗材購(gòu)自Corning， anti-α-synuclein購(gòu)自Santa Cruz，anti-His購(gòu)自Clontech，酵母粉、蛋白胨和瓊脂購(gòu)自O(shè)xoid， PVDF膜購(gòu)自Millipore。化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑購(gòu)自普利萊公司，其他試劑為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純?cè)噭?/p>

1.2 儀器ECL檢測(cè)系統(tǒng)型號(hào)-Molecular Device, Lmax， 離心機(jī) Sigma 16KP，基質(zhì)輔助激光解吸附/飛行時(shí)間質(zhì)譜儀-4800 plus， 美國(guó)ABI，酶標(biāo)儀-Spectra Max190美國(guó) MD，超聲破碎儀-美國(guó)SONIC VCX 500。

1.3 細(xì)胞株和質(zhì)粒PC12細(xì)胞購(gòu)自醫(yī)科院基礎(chǔ)所細(xì)胞中心，載體pET30a來(lái)自Novagen。

1.4 目的基因獲得與載體的構(gòu)建根據(jù)GenBank中的α-突觸核蛋白基因序列[gi:6806897]，設(shè)計(jì)特異性引物，以pEGFP-N1-syn質(zhì)粒為模板[8]，PCR擴(kuò)增目的基因，將擴(kuò)增產(chǎn)物用NdeI和XhoI雙酶切，回收酶切后的片段，與經(jīng)過(guò)同樣雙酶切的載體pET30a按3 ∶1摩爾比混合，在T4DNA連接酶作用下于16℃連接過(guò)夜。過(guò)夜連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1-T1 Phage Resistant感受態(tài)細(xì)胞,涂布到含有質(zhì)量濃度為50 g·L-1卡那霉素的LB平板上，于37℃培養(yǎng)過(guò)夜，次日，從LB平板上隨機(jī)挑取菌落，接種于含有同樣濃度卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)16 h，提取質(zhì)粒，然后用NdeI/XhoI進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切鑒定為陽(yáng)性的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。

1.5 目的基因在原核系統(tǒng)的表達(dá)用測(cè)序正確的質(zhì)粒以及空載體pET30a轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans BL21(DE3) pLysS化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，隨機(jī)挑取1個(gè)菌落，接種于含有質(zhì)量濃度為50 g·L-1卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)過(guò)夜，次日按照1 ∶100的比例將過(guò)夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到5 mL含同樣濃度卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)液OD600值達(dá)到0.2-0.8時(shí)，加入不同濃度IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)一段時(shí)間，10 000×g離心15 min收集菌體，取適量菌體加入PBS重懸，超聲裂解，取上清作為樣品，SDS-PAGE電泳分析蛋白表達(dá)情況。

1.6 蛋白的純化將誘導(dǎo)表達(dá)的菌體超聲破碎，離心收集上清，緩慢加到已用5倍柱體積去離子水及10倍柱體積Binding Buffer (20 mmol·L-1sodium phosphate，0.5 M NaCl, pH 7.4)平衡的His TrapTMFF 親和層析柱上，流速控制在0.5～1.0 mL，然后用15倍柱體積的Binding Buffer 沖洗柱子，洗去雜蛋白。再分別用濃度10、20、30、40、50、60、70、80、100、250、500 mmol·L-1咪唑洗脫液競(jìng)爭(zhēng)性梯度洗脫目的蛋白，并收集洗脫液。上述各個(gè)收集液取樣處理，SDS-PAGE電泳檢測(cè)蛋白的純化情況。將含目的蛋白而不含雜蛋白的洗脫液進(jìn)行濃縮，并用PBS置換Buffer后，凍存于-80℃。

1.7 SDS-PAGE電泳后染色及Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)BCA試劑盒蛋白定量，樣品蛋白加入上樣緩沖液煮沸變性。然后經(jīng)15%的SDS-PAGE分離，電泳結(jié)束后加入考馬斯亮藍(lán)R250染色液，固定染色1-2 h后脫色，觀察蛋白的表達(dá)。樣品蛋白經(jīng)SDS-PAGE膠分離后轉(zhuǎn)移到PVDF膜，質(zhì)量濃度為30 g·L-1的BSA室溫封閉2 h，加入一抗4℃過(guò)夜，TBS-Tween洗膜后加HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h，加入ECL發(fā)光液，進(jìn)行檢測(cè)。

1.8 質(zhì)譜法鑒定表達(dá)蛋白配置體積分?jǐn)?shù)為0.3甲醇/0.7乙腈的溶液，用上述溶液配置體積分?jǐn)?shù)為0.001的三氟乙酸，取上述三氟乙酸配置飽和芥子酸溶液為質(zhì)譜用基質(zhì)。去離子水配置目的蛋白，濃度為1 g·L-1，將目的蛋白和基質(zhì)按照1 ∶1的體積比混勻，點(diǎn)樣，上機(jī)檢測(cè)。

1.9 細(xì)胞活力的檢測(cè)細(xì)胞按5×107·L-1濃度接種于96孔版中，每孔100 μL(5 000細(xì)胞/孔)，培養(yǎng)24 h，加入含有濃度為5、10、20、40 μmol·L-1α-突觸核蛋白的培養(yǎng)基處理，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL MTT(質(zhì)量濃度為50 mg·L-1，細(xì)胞孵育箱中培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)基，加入100 μL DMSO，震蕩至晶體顆粒溶解，10 min后在酶標(biāo)儀上測(cè)定570 nm的吸光度(A)值。MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率/%=(實(shí)驗(yàn)組平均A值/對(duì)照組平均A值)×100%。

1.10原代神經(jīng)元的培養(yǎng) 多聚賴氨酸包被培養(yǎng)板過(guò)夜，PBS洗兩遍，將出生24 h的Sprague Dawley新生鼠，浸泡于體積分?jǐn)?shù)為0.7乙醇浸泡10 s消毒，取出全腦，用手術(shù)剪將組織切成(1×1×1) mm3大小，以利于酶消化溶液的滲透，將組織塊轉(zhuǎn)移到50 mL離心管中，并加入適量的胰酶和DNA酶，置于37℃水浴中消化10 min，胎牛血清終止消化，用DMEM/F12培養(yǎng)基漂洗兩次，即加入DMEM/F12培養(yǎng)基，混勻，4℃ 200g×5 min離心，倒去上清，再加入10～15 mL DMEM/F12，混勻，4℃ 200g×5 min離心，倒去上清，加入適量Neurbasal-A培養(yǎng)基，吹勻，細(xì)胞懸液過(guò)200目篩，然后過(guò)300目篩，顯微鏡下觀察收集的細(xì)胞形態(tài)并進(jìn)行計(jì)數(shù)和接種，加入質(zhì)量濃度為5 mg·L-1的阿糖胞苷，培養(yǎng)5～6 d后開始實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 pET-30a-syn融合載體的成功構(gòu)建PCR擴(kuò)增獲得的目的基因片段經(jīng)凝膠電泳分離后，在500 bp附近有特異性條帶，與α-突觸核蛋白基因片段的理論分子量基本一致。連接后獲得的轉(zhuǎn)化子提取的質(zhì)粒，經(jīng)酶切得到分子量小于500 bp的特異條帶，與PCR產(chǎn)物大小一致(Fig 1)，表明目的基因已成功克隆至載體。酶切陽(yáng)性的克隆測(cè)序顯示序列正確，可進(jìn)行表達(dá)。

Fig 1 The gel picture of α-synuclein cDNA fragment digested by NdeI and XhoI endonucleases

M: Molecular weight marker DL2000; 1: cDNA fragment of α-synuclein; 2: pET30a; 3: pET30a-synuclein.

2.2 α-突觸核蛋白在原核體系中的表達(dá)及鑒定將空載體pET30a與重組載體的菌體裂解提取蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后固定、染色及脫色，結(jié)果顯示與空載體組相比，在分子量約為20 ku時(shí)可見特異性蛋白條帶，大小與標(biāo)準(zhǔn)品基本一致，如Fig 2A所示。為了進(jìn)一步驗(yàn)證表達(dá)的蛋白是否為目的蛋白，利用pET30a的標(biāo)簽抗體anti-his以及目的蛋白特異性抗體anti-α-synuclein，通過(guò)免疫印跡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在20 ku左右有特異性的條帶，如Fig 2B,C。上述結(jié)果表明，位于20 ku附近的特異性條帶是目的蛋白α-突觸核蛋白。

Fig 2 Expression and identification of recombinant α-synuclein

A:The recombination protein of α-synuclein expressed in E.Coli. BL21 (DE3) was separated by SDS-PAGE electrophesis and stained by Coomassie brilliant blue; B: The recombination protein of α-synuclein was separated by SDS-PAGE and immblotted with anti-His antibody; C: The recombination protein of α-synuclein was separated by SDS-PAGE and immblotted with anti-synuclein antibody. (S: standard substance obtained from Sigma; M: sample of mock vecter pET30a; R: sample of recombinant vecter pET30a-synuclein.)

2.3 表達(dá)條件的優(yōu)化溫度、IPTG終濃度、宿主菌的增殖狀態(tài)(用OD600表示)及不同表達(dá)時(shí)間能夠影響外源蛋白在原核宿主菌的表達(dá)。根據(jù)不同的培養(yǎng)條件，觀察宿主菌中目的蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果(Fig 3)發(fā)現(xiàn)：當(dāng)溫度為30℃、培養(yǎng)菌液OD600值為0.2、IPTG終濃度為0.4 mmol·L-1時(shí)、誘導(dǎo)時(shí)間為7 h、目的蛋白的表達(dá)量最多，因此將此優(yōu)化條件確定為α-突觸核蛋白的表達(dá)條件。

2.4 純化條件的優(yōu)化將誘導(dǎo)表達(dá)的菌體超聲裂解破碎，離心收集上清，加到已用磷酸鹽緩沖液平衡的HisTrapTMFF上，讓其自然通過(guò)柱子，然后用含不同濃度咪唑的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，收集各洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，如Fig 4 A，采用20及40 mmol·L-1咪唑分階段洗滌，250 mmol·L-1咪唑洗脫目的蛋白；大量樣品經(jīng)電泳分離后染色，并未發(fā)現(xiàn)更多的雜蛋白，如Fig 4 B，圖片經(jīng)灰度掃描后顯示，目的蛋白純度約為86%。

2.5 質(zhì)譜進(jìn)一步鑒定重組蛋白為了進(jìn)一步明確純化蛋白是否為α-突觸核蛋白，將純化蛋白進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果Fig 5 A顯示商品化標(biāo)準(zhǔn)品的分子量為16.408 ku，F(xiàn)ig 5B顯示目的蛋白分子量為15.34 ku，與理論分子質(zhì)量15.52 ku基本一致，由此表明，該目的蛋白為α-突觸核蛋白。

Fig 3 Optimization of expression condition about recombinant α-synuclein

A: Expression of recombinant α-synuclein was induced by different concentrations of IPTG. M: Protein marker,1: Before induction, 2: 0, 3: 1×10-4mol·L-1IPTG; 4: 2×10-4mol·L-1IPTG[5: 3×10-4mol·L-1IPTG; 6: 4×10-4mol·L-1IPTG; 7: 5×10-4mol·L-1IPTG; 8: 6×10-4mol·L-1IPTG; 9: 7×10-4mol·L-1; 10: 8×10-4mol·L-1IPTG; 11: 9×10-4mol·L-1; 12: 10×10-4mol·L-1IPTG; B: Recombinant α-synuclein was expressed in E.Coli. BL21 (DE3) of different propagating state evaluated by their optical density (OD600). M: Protein marker; 1:before induction; 2: α-synuclein from Sigma 3:OD600=0.1; 4：OD600=0.2; 5：OD600=0.4; 6：OD600=0.6; 7：OD600=0.8; 8：OD600=1.0. C: Recombinant α-synuclein was expressed in E.Coli. BL21 (DE3) at differents temperature induced by 4×10-4mol·L-1IPTG. M:Protein marker; 1:before induction; 2：16 ℃；3: 20 ℃；4: 25 ℃；5: 28 ℃；6: 30 ℃；7: 37℃. D: Recombinant α-synuclein was induced by 4×10-4mol·L-1IPTG for different times. M: Protein marker; 1:berore induction; 2: 0 h; 3: 1 h; 4: 3 h; 5: 5 h; 6: 7 h; 7: 9 h; 8: 11 h; 9: 20 h.

Fig 4 Optimization of purification condition eluting the recombinant α-synuclein with different imidazole by His TrapTM FF column

A: The recombinant α-synuclein was eluted from different concentration of imidazole. M: Protein marker; 1: 0; 2: 10 mmol·L-13: 20 mmol·L-14: 30 mmol·L-15: 40 mmol·L-16: 50 mmol·L-17: 60 mmol·L-18: 70 mmol·L-19: 80 mmol·L-110: 100 mmol·L-111: 250 mmol·L-112: 500 mmol·L-1. B: The purified α-synuclein was separated by SDS-PAGE gel. M: Protein marker; 1：0.5 μg; 2: 1 μg；3: 2μg; 4: 4μg; 5: 6μg; 6: 8μg; 7: 10 μg; 8:12 μg; 9: 14 μg; 10: 16 μg; 11: 18 μg; 12: 20 μg; 13: 40μg. Arrowhead points to the protein strand of α-synuclein.

Fig 5 Mass spectrum of α-synuclein

A: α-synuclein from Sigma; B: The purified α-synuclein.

2.6 α-突觸核蛋白抑制細(xì)胞存活率α-突觸核蛋白可直接對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生損傷，因此本研究將不同濃度的α-突觸核蛋白與PC12細(xì)胞或原代神經(jīng)元共同孵育，通過(guò)MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力。結(jié)果Fig 6A顯示，α-突觸核蛋白濃度為5 μmol·L-1時(shí)，PC12細(xì)胞存活率已經(jīng)開始減弱，濃度為10、20、40 μmol·L-1時(shí)，隨著濃度的增加，α-突觸核蛋白對(duì)PC12的損傷也越來(lái)越明顯，呈一定的劑量依賴性。Fig 6B顯示，α-突觸核蛋白與原代神經(jīng)元共孵育時(shí)，對(duì)原代神經(jīng)元的損傷也具有劑量依賴性，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

α-突觸核蛋白是由140個(gè)氨基酸組成的小分子蛋白，目前生理功能仍不清楚。有研究表明，在生理狀態(tài)下，α-突觸核蛋白能夠參與神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，并與囊泡的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。研究表明，α-突觸核蛋白無(wú)論是過(guò)表達(dá)、突變還是發(fā)生異常修飾，都能夠造成神經(jīng)元的損傷或神經(jīng)退行性改變[9]，但具體的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞外異常的α-突觸核蛋白能夠影響神經(jīng)元的功能[6]或毒性作用[10]。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外的α-突觸核蛋白不僅能夠促進(jìn)路易小體的形成[11]，同時(shí)也能夠誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞的激活，促進(jìn)神經(jīng)炎癥的發(fā)生[12]，從而進(jìn)一步加劇神經(jīng)元的損傷。胞外的α-突觸核蛋白能夠通過(guò)多種方式發(fā)揮毒性作用，如自身形成離子通道激活鉀離子通道；降低胞質(zhì)膜中膽固醇的含量，改變脂筏中離子通道的分布，從而影響多巴胺的釋放[13]；其最終的其毒性機(jī)制都可能與促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)氧化和硝基化應(yīng)激有關(guān)[14]。

Fig 6 Toxic effect of recombinant α-synuclein

A: Effects of purified α-synuclein decreased the viability of PC12 cells. B: Effects of purified α-synuclein decreased the viability of primary cells. Results were repeated 3 times.**P<0.01vscontrol.

研究證明，胞外的α-突觸核蛋白與神經(jīng)細(xì)胞的功能相互影響，在神經(jīng)元功能紊亂時(shí)促進(jìn)α-突觸核蛋白釋放到胞外[15]，因此胞外的α-突觸核蛋白可做為疾病進(jìn)展的標(biāo)志物，而研究細(xì)胞外α-突觸核蛋白的作用能夠?yàn)殛U明PD的發(fā)病機(jī)制提供更多的理論線索。本研究將α-突觸核蛋白與神經(jīng)細(xì)胞共孵育，模擬中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞外的α-突觸核蛋白對(duì)神經(jīng)元的作用模式，在某種程度上可模擬PD發(fā)病過(guò)程的某一環(huán)節(jié)，有利于研究胞外的α-突觸核蛋白對(duì)神經(jīng)元的毒性機(jī)制?；诖私ⅵ?突觸核蛋白損傷神經(jīng)元的細(xì)胞模型，可進(jìn)行抗PD創(chuàng)新藥物的研究，對(duì)抗帕金森創(chuàng)新藥物的篩選以及作用機(jī)制的研究具有重要意義。

模型的建立，需要大量的α-突觸核蛋白。為了獲得大量的人源性α-突觸核蛋白，研究中首先通過(guò)分子克隆技術(shù)成功構(gòu)建了α-突觸核蛋白原核表達(dá)載體，鑒定成功后進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并優(yōu)化表達(dá)和純化條件，可為后續(xù)標(biāo)準(zhǔn)操作程序的建立提供依據(jù)。獲得的蛋白結(jié)果通過(guò)電泳、蛋白免疫印跡和質(zhì)譜技術(shù)，確認(rèn)α-突觸核蛋白的正確表達(dá)并且純度超過(guò)86%，為模型的建立提供了物質(zhì)保障。目前體外篩選抗PD化合物還主要是通過(guò)評(píng)價(jià)細(xì)胞存活率的方法進(jìn)行篩選，通過(guò)將α-突觸核蛋白與類神經(jīng)細(xì)胞PC12及原代神經(jīng)元共孵育，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，α-突觸核蛋白能夠直接導(dǎo)致上述細(xì)胞存活率明顯下降，由此可根據(jù)細(xì)胞存活率的改變篩選到具有抗α-突觸核蛋白損傷的活性化合物，這些活性化合物將對(duì)治療PD更具有特異性。

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Construction of cell model targeted on the damage by α-synuclein

YAN Wen-fen, HENG Yang, SHAO Qian-hang, CHEN Nai-hong, YUAN Yu-he

(StateKeyLaboratoryofBioactiveSubstancesandFunctionsofNaturalMedicines,InstituteofMateriaMedica,NeuroscienceCenter,ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege,Beijing100050,China)

Aim To construct the cell model targeted on the damage by α-synuclein for screening anti-Parkinson’s Disease (PD) compounds. Methods The cDNA fragment of α-synuclein gene was obtained by PCR methods and inserted into the recombinant prokaryotic plasmid by molecular cloning technique. The recombinant plasmid was transformed into Escherichia coli, and subsequently induced to express α-synuclein protein. The recombinant α-synuclein was purified and identified by affinity chromatography, immunoblotting and mass spectrometry. The cells damage by α-synuclein was evaluated through cell viability measured by 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide. Results The obtained cDNA fragment of α-synuclein in accordance with its theoretic molecular weight was cloned into pET30a plasmid and verified by sequencing. The recombinant plasmid was transformed into bacteria E.Coli.BL21 (DE3) and induced to express α-synuclein by isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). The expression condition was optimized according to the culture temperature, the concentration of IPTG and the proliferation state of bacteria. The purified α-synuclein was proved to be a 15.3 ku molecule weight protein, and could be immunoblotted with anti-α-synuclein antibody. The purified α-synuclein could decrease the viability of PC12 cells and primary neurons significantly, and its effect was in a concentration-dependent manner. Conclusion We have succeeded in constructing the cell model targeted on the damage by α-synuclein.

α-synuclein; toxic damage; Parkinson’s Disease; screen model; protein expression; drug target

時(shí)間：2015-3-16 15:41 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150316.1541.029.html

2014-11-03,

2015-02-15

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81274122，81102831, 81373997)；北京市自然科學(xué)基金(No 7131013)；教育部博士點(diǎn)基金(No 20121106130001)

閆文芬(1990-)，女，碩士生，研究方向：神經(jīng)藥理學(xué)，Tel: 010-63165182, Fax：010-63165177, E-mail: yanwenfen@imm.ac.cn; 苑玉和(1971-)，女，博士，副研究員，研究方向：神經(jīng)藥理學(xué)，通訊作者,Tel: 010-63165182, Fax：010-63165177, E-mail: yuanyuhe@imm.ac.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.04.029

A

1001-1978(2015)04-0586-05

R341；R329.25；R394.2；R745.702；R965.1；R977.6