小鼠和奶牛乳腺上皮細(xì)胞的分離及培養(yǎng)特性比較

劉玉輝，賴金倫，寇明明，鄧明亮，劉瑞寧，陳穎鈺，2，胡長敏，2＊，郭愛珍，2＊

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖北武漢430070；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢430070）

乳腺炎是嚴(yán)重危害人類及動(dòng)物健康的常見疾病。奶牛乳腺炎被列為“奶牛三大疾病”之首，造成了奶牛業(yè)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，全世界約有2.2億頭奶牛，其中約有三分之一的奶?；加懈鞣N類型乳腺炎［1－2］。

建立小鼠原代乳腺上皮細(xì)胞（mouse mammary epithelial cells，MMECs）和奶牛原代乳腺上皮細(xì)胞（bovine mammary epithelial cells，BMECs）體外分離培養(yǎng)體系是開展乳腺炎致病機(jī)制研究工作的基礎(chǔ)。Wang W 等［3］建立MMECs培養(yǎng)體系，研究中藥厚樸酚調(diào)控脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)MMECs炎癥反應(yīng)的機(jī)制。Olga W 等［4］也建立了BMECs培養(yǎng)體系研究病原菌與BMECs的相互作用。通過建立MMECs和BMECs體外培養(yǎng)體系模擬體內(nèi)試驗(yàn)過程，既增加了試驗(yàn)的便利性，也減少了試驗(yàn)成本；同時(shí)可為乳腺生長發(fā)育、泌乳機(jī)制及乳腺生物反應(yīng)器的研究提供參考。

1957年Lasfargues等首次實(shí)現(xiàn)了MMECs的直接培養(yǎng)，成功建立了BMECs 細(xì)胞系BMGE＋HM、BMGE＋H 及EMGE－H［5］。張以濤等［6－7］分別研究了MMECs和BMECs體外培養(yǎng)特性，但有關(guān)MMECs及BMECs的分離培養(yǎng)、生長特性的比較研究尚未見報(bào)道。在本研究中，采用改良混合酶消化結(jié)合差速貼壁法分別從小鼠和奶牛乳腺中提取出高純度的MMECs及BMECs，進(jìn)行兩種細(xì)胞的體外培養(yǎng)傳代和凍存復(fù)蘇試驗(yàn)，對比了MMECs和BMECs的分離、培養(yǎng)方法、生長特性、細(xì)胞傳代和復(fù)蘇性狀，為選擇及建立合適的MMECs和BMECs體外模型，以及開展乳腺相關(guān)功能研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 妊娠后期SPF 昆明鼠購自湖北省疾病控制中心，泌乳中期荷斯坦奶牛乳腺組織采自湖北省某獸醫(yī)站。

1.1.2 主要試劑及耗材 膠原酶（Collagenase）Ⅰ和Ⅱ?yàn)镾olarbio公司產(chǎn)品；2.5g／L 胰蛋白酶－0.2 g／L乙二胺四乙酸（Trypsin－EDTA）、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）為Gibico產(chǎn)品；胰島素（Insulin）、轉(zhuǎn)鐵蛋白（Transferrin）、二甲基亞砜（DMSO）、兩性霉素B 和慶大霉素為Sigma公司產(chǎn)品；DMEM／F12、青鏈霉素雙抗（Penicilin－Streptomycin Solution）為Hyclone公司產(chǎn)品；表皮生長因子（EGF）為SinoBiological公司產(chǎn)品；兔源的角蛋白18多克隆抗體（Rabbit Anti－Cytokeratin18）為Bioss公司生產(chǎn)；FITC 標(biāo)記的羊抗兔二抗為Southern Biotech公司 產(chǎn) 品；T25、T75 細(xì) 胞 培 養(yǎng) 瓶12 孔、24孔細(xì)胞培養(yǎng)板為Lab Serv公司產(chǎn)品。

1.1.3 細(xì)胞消化液、培養(yǎng)液及凍存液 提取細(xì)胞時(shí)所用的消化液為2.5g／L Trypsin－0.2g／L EDTA與膠原酶Ⅰ、Ⅱ型等比例混合液，Ⅰ、Ⅱ型膠原酶均配制為2mg／mL 的工作液（100 mg膠原酶添加5 mL胎牛血清和45mL DMEM／F12）。細(xì) 胞生長培養(yǎng)液：基礎(chǔ)培養(yǎng)液為DMEM／F12 添加100 mL／L FBS 10 mL／L Penicilin－Streptomycin Solution，5 ng／mL EGF，5μg／mL Insulin，5μg／mL Transferrin；凍存培養(yǎng)液：900 mL／L FBS＋100 mL／L DMSO。

1.2 方法

1.2.1 MMECs的分離與純化 取健康妊娠后期SPF昆明鼠，斷頸處死后在750 mL／L 酒精中浸泡60s，無菌采集小鼠倒數(shù)第2對乳腺，避開血管且去除淋巴結(jié)后稱重；將采集到的乳腺組織放入含20 mL／L雙抗的PBS中，清洗干凈后置小燒杯中剪碎至糊狀，隨后轉(zhuǎn)入錐形瓶中密封，37℃、110r／min恒溫振蕩培養(yǎng)消化約2h～3h至無成塊組織（每克組織加入4mL Trypsin－EDTA 及4mL 膠原酶Ⅰ、Ⅱ等比例混合液，消化時(shí)間根據(jù)消化組織量而異）；將消化后的勻漿液轉(zhuǎn)入15 mL 無菌離心管中25℃、250r／min離心5min。收集離心后的沉淀，加入適量含100mL／L FBS的DMEM／F12，用200目細(xì)胞篩過濾去除未消化組織塊。收集濾液，經(jīng)相同條件離心后棄上清，加入適當(dāng)2.5g／L Trypsin－0.2g／L EDTA 混合液重懸，作用2 min使細(xì)胞分散為單個(gè)細(xì)胞，隨后加入5mL含100mL／L FBS的DMEM／F12終止反應(yīng)。反復(fù)離心3次清洗沉淀后加入適當(dāng)培養(yǎng)液重懸，用400目細(xì)胞篩過濾后離心。沉淀中加入適量細(xì)胞生長液重懸后接種到細(xì)胞培養(yǎng)皿中差速貼壁1h，去除成纖維細(xì)胞，此操作重復(fù)2次，最后將細(xì)胞計(jì)數(shù)后接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2 BMECs的分離與純化 健康泌乳中期荷斯坦奶牛屠宰時(shí)，乳腺皮膚經(jīng)酒精消毒后用無菌手術(shù)刀切開，避開血管、脂肪及淋巴組織，剪取約5g腺泡處乳腺組織放入含2.5μg／mL兩性霉素B及50 μg／mL慶大霉素的PBS中，置冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室，提取步驟與1.2.1 MMECs相同，但奶牛乳腺組織振蕩消化時(shí)間約4h～4.5h。

1.2.3 MMECs及BMECs的免疫熒光鑒定 將分離的MMECs接種于加有爬片的12孔板中培養(yǎng)至單層，以小鼠乳腺成纖維細(xì)胞作陰性對照；吸棄細(xì)胞生長液，PBS清洗3次后用40mL／L 多聚甲醛固定30min；同上清洗后取50 mL／L BSA 溶液封閉30 min；封閉完成后吸干封閉液，并將細(xì)胞充分浸泡于兔源角蛋白18多克隆抗體（稀釋倍數(shù)為1∶200）中，4℃孵育過夜；PBS清洗細(xì)胞后加入FITC 標(biāo)記的羊抗兔二抗（稀釋倍數(shù)為1∶100），室溫避光孵育1h；PBS清洗除去二抗，Hoechst 33342 室溫避光染色10min；抗熒光猝滅劑封片后在激光共聚焦顯微鏡下拍照。

BMECs的固定、染色步驟及免疫熒光鑒定方法與MMECs的鑒定方法相同，同時(shí)設(shè)定奶牛乳腺成纖維細(xì)胞作陰性對照。

1.2.4 MMECs及BMECs的傳代 MMECs及BMECs生長匯合至單層時(shí)，用適量2.5g／L Trypsin－EDTA，37℃消化10min～15min，以1∶2的比例進(jìn)行細(xì)胞傳代，補(bǔ)加生長培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.5 細(xì)胞生長曲線的繪制 將分離純化的MMECs和BMECs以1×104個(gè)／mL的密度接種于24孔板中，然后放入二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2d換液1次，采用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀連續(xù)8d進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)繪圖，細(xì)胞數(shù)取3個(gè)孔的平均值。

1.2.6 MMECs 及BMECs 的 凍 存 與 復(fù) 蘇MMECs及BMECs 凍存前同細(xì)胞傳代方法，見

1.2.4 。取消化后細(xì)胞，25℃、1 000r／min 離心5 min，收集細(xì)胞；用1.1.3所示細(xì)胞凍存液將細(xì)胞分裝至1.5mL凍存管中，每管1mL，液氮中保存。解凍時(shí)，從液氮中取出MMECs及BMECs凍存管，37℃水浴快速解凍細(xì)胞，而后加入細(xì)胞生長培養(yǎng)液，25℃、1 000r／min離心5min，收集細(xì)胞并接種到培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

2 結(jié)果

2.1 MMECs與BMECs分離、純化結(jié)果

分別應(yīng)用改良的混合酶消化結(jié)合差速貼壁法成功提取了高純度的MMECs和BMECs。盡管兩種細(xì)胞培養(yǎng)體系的建立步驟類似，但在取材部位、清洗液的選擇、清洗次數(shù)及消化時(shí)間等方面仍存在明顯差異（表1）。

2.2 原代MMECs與BMECs培養(yǎng)特性

2.2.1 原代MMECs培養(yǎng)特性 根據(jù)MMECs與小鼠乳腺成纖維細(xì)胞貼壁速度的差異，經(jīng)兩次差速貼壁法將MMECs與小鼠乳腺成纖維細(xì)胞分離。分離后的細(xì)胞培養(yǎng)3d左右，分別得到單一的MMECs與小鼠乳腺成纖維細(xì)胞。倒置顯微鏡下觀察，MMECs呈現(xiàn)典型的鋪路石樣外觀，且細(xì)胞連接緊密，間隙清晰（圖1a）；當(dāng)MMECs長滿后繼續(xù)培養(yǎng)會(huì)出現(xiàn)典型的穹頂狀結(jié)構(gòu)，穹頂內(nèi)仍有一層MMECs（圖1b）。分離出的小鼠乳腺成纖維細(xì)胞呈典型的梭形（圖1c）。

表1 MMECs與BMECs分離方法比較Table 1 Comparison of separation methods between MMECs and BMECs

圖1 MMECs及小鼠乳腺成纖維細(xì)胞培養(yǎng)形態(tài)觀察（10×）Fig.1 Morphology of MMECs and mouse mammary fibroblasts（10×）

2.2.2 原代BMECs培養(yǎng)特性 通過改良混合酶消化結(jié)合差速貼壁法，分別獲得BMECs和奶牛成纖維細(xì)胞。倒置顯微鏡下觀察，BMECs輪廓清晰，排列緊密，呈現(xiàn)典型的鵝卵石樣外觀。對BMECs進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)跟蹤觀察評價(jià)，原代BMECs呈島嶼狀生長，由中間向四周擴(kuò)散，細(xì)胞生長6d匯合成單層（圖2A）。奶牛乳腺成纖維細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞形態(tài)為梭形（圖2B）。

2.3 傳代MMECs與BMECs培養(yǎng)特性

2.3.1 MMECs傳代觀察 將MMECs以1∶2的比例進(jìn)行傳代，傳代細(xì)胞并未像原代MMECs出現(xiàn)鋪路石樣外觀，細(xì)胞間隙變大，排列不規(guī)則且不能匯合成單層（圖3）。

2.3.2 BMECs傳代觀察 將BMECs以1∶2進(jìn)行傳代，傳代后2d細(xì)胞即匯合成單層，且傳代細(xì)胞與原代BMECs形態(tài)一致，細(xì)胞生長狀態(tài)良好（圖4a、圖4b）。當(dāng)BMECs傳至第9代時(shí)，細(xì)胞出現(xiàn)了空泡與老化現(xiàn)象（圖4c、圖4d），死細(xì)胞增多。

2.3.3 細(xì)胞生長曲線 以1×104個(gè)／mL 的細(xì)胞數(shù)將純化后的MMECs和BMECs（第2代）接種于24孔板中，通過細(xì)胞計(jì)數(shù)得出的生長曲線見圖5。MMECs在接種到24 孔板中后，細(xì)胞出現(xiàn)生長緩慢，不能匯合成單層細(xì)胞狀態(tài)，剛開始貼壁的細(xì)胞在隨后的生長過程中逐漸死亡，這與上述MMECs不能傳代相符；BMECs的生長曲線顯示：0～3d為細(xì)胞生長的滯留期，細(xì)胞處在適應(yīng)環(huán)境的過程，從第4天開始細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期，直至第7天，之后細(xì)胞生長步入平臺(tái)期。

2.4 MMECs與BMECs的凍存與復(fù)蘇

使用相同的凍存液凍存MMECs和BMECs，復(fù)蘇后的細(xì)胞均能匯合為單層，且生長狀態(tài)良好。但MMECs只能凍存原代細(xì)胞，而BMECs可對傳代細(xì)胞進(jìn)行凍存（圖6）。

2.5 MMECs與BMECs免疫熒光鑒定

MMECs與BMECs經(jīng)兔源角蛋白18多克隆抗體孵育后加入FITC 標(biāo)記的熒光二抗，同時(shí)用Hoechst33342標(biāo)記細(xì)胞核，置激光顯微鏡下觀察。角蛋白18特異性存在于MMECs與BMECs的胞質(zhì)中，經(jīng)免疫熒光染色后胞質(zhì)呈現(xiàn)綠色，細(xì)胞核呈藍(lán)色（圖7a、圖7c）。小鼠及奶牛乳腺成纖維細(xì)胞缺乏角蛋白18，僅細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色熒光（圖7b、圖7d）。

3 討論

3.1 MMECs和BMECs的分離鑒定

圖2 BMECs及奶牛乳腺成纖維細(xì)胞培養(yǎng)形態(tài)觀察（10×）Fig.2 Morphology of BMECs and bovine mammary fibroblasts（10×）

圖3 傳代后的MMECs形態(tài)觀察（10×）Fig.3 Morphology of passaged MMECs（10×）

在原代乳腺上皮細(xì)胞提取方法上，人們大多采用先胰酶粗消化后再用膠原酶消化的方法［8－9］，由于乳腺組織中含有多種細(xì)胞，酶消化法提取出來的細(xì)胞多為乳腺上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的混合物，因此仍需對提取所得細(xì)胞混合物進(jìn)一步純化。多項(xiàng)研究表明，成纖維細(xì)胞較乳腺上皮細(xì)胞對胰酶的敏感性高，在貼壁培養(yǎng)時(shí)不僅貼壁時(shí)間短，且貼壁后更易被胰酶消化。因此可根據(jù)成纖維細(xì)胞和乳腺上皮細(xì)胞特性的差異，采用差時(shí)消化和差速貼壁的方法對乳腺上皮細(xì)胞進(jìn)行純化［10］。大多數(shù)人在純化方法上選擇根據(jù)兩種細(xì)胞對胰酶的敏感性差異開展純化［11］，由于該方法是在培養(yǎng)細(xì)胞的過程中進(jìn)行的，直接獲得的乳腺上皮細(xì)胞純度不高，且胰酶消化時(shí)間的不確定性也增加了純化的難度。

圖4 傳代BMECs形態(tài)觀察Fig.4 Morphology of passaged BMECs

圖5 小鼠和奶牛乳腺上皮細(xì)胞的生長曲線Fig.5 Growth culture of MMECs and BMECs

圖6 經(jīng)凍存復(fù)蘇后的細(xì)胞形態(tài)（10×）Fig.6 Cell morphology after cryopreservation and resuscitation

圖7 角蛋白18免疫熒光鑒定MMECs與BMECsFig.7 Cytokeratin18expression in MMECs and BMECs by immunofluorescence staining analysis

本研究中，初始我們采用胰酶與膠原酶分段消化的方法分離MMECs，得到細(xì)胞成纖維細(xì)胞與乳腺上皮細(xì)胞的混合物，然后根據(jù)其對胰酶敏感性不同進(jìn)行純化，考慮到純化時(shí)胰酶量差異、消化時(shí)間的不確定性，以及胰酶反復(fù)作用造成乳腺上皮細(xì)胞損傷，隨后我們對乳腺上皮細(xì)胞的提取方法做了一些改良，一是在酶消化時(shí)采用胰酶與膠原酶Ⅰ、Ⅱ等量混合的方法進(jìn)行消化，直至將乳腺組織消化成無明顯可見大顆粒為止。改進(jìn)后的消化方法不僅減少了試驗(yàn)步驟，增加了試驗(yàn)的便捷性，而且混合酶同時(shí)消化乳腺組織，可以使乳腺組織消化更徹底充分，更容易獲得目的細(xì)胞。二是直接采用差速貼壁法，將混合酶消化后的兩種細(xì)胞混合物直接培養(yǎng)，根據(jù)成纖維細(xì)胞先貼壁的特性將其去除，從而得到高純度的乳腺上皮細(xì)胞。

角蛋白是乳腺上皮細(xì)胞重要的標(biāo)志性蛋白，乳腺上皮細(xì)胞中的細(xì)胞骨架蛋白主要以角蛋白－7、8和18為主，而成纖維細(xì)胞中缺少角蛋白－18［12］。本研究通過角蛋白18 免疫熒光染色成功鑒定MMECs和BMECs。

3.2 MMECs和BMECs生長特性

MMECs和BMECs的形態(tài)存在差異，MMECs偏大，細(xì)胞趨向于多角形，細(xì)胞間排列緊密，細(xì)胞間隙小，呈鋪路石樣外觀；BMECs體積稍小，呈現(xiàn)鵝卵石樣外觀（圖1、圖2）。另外，BMECs培養(yǎng)初期細(xì)胞量少，后期細(xì)胞增殖快（圖2），可見BMECs分裂增殖能力較MMECs強(qiáng)。

3.3 MMECs和BMECs的傳代特性

在本研究中，MMECs傳代后老化，且不能長滿（圖3），這與易瓊等描述的MMECs 可以傳代不符［13］，分析原因可能是乳腺上皮細(xì)胞的生長特性為形成乳腺細(xì)胞團(tuán)并以團(tuán)塊擴(kuò)張的形式生長［14］，MMECs傳代減少了細(xì)胞量，以1∶2傳代的細(xì)胞密度仍然較低，導(dǎo)致細(xì)胞團(tuán)塊不能形成；另外，推測MMECs傳代過程中缺失了上皮細(xì)胞的某些成分或是生長培養(yǎng)基不能滿足傳代細(xì)胞的營養(yǎng)供應(yīng)，從而影響其分化增殖［15］。奶牛BMECs可以傳至第9代，但后續(xù)傳代時(shí)細(xì)胞出現(xiàn)明顯的易老化特征，細(xì)胞間形成空泡，細(xì)胞不能匯合成單層（圖4c、4d），這符合原代細(xì)胞的生長特性。

同時(shí)純化后的MMECs和BMECs的生長曲線更進(jìn)一步說明了MMECs在細(xì)胞密度低的情況下不能生長，分裂增殖能力差；而BMECs的分裂增殖能力較強(qiáng)，細(xì)胞的生長曲線呈現(xiàn)典型的S型，這與李文清等［16］描述相符。

3.4 MMECs和BMECs的凍存與復(fù)蘇

本研究中，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)到的凍存液（900 mL／L FBS＋100mL／L DMSO）進(jìn)行MMECs和BMECs的凍存［17］，復(fù)蘇凍存后的細(xì)胞生長良好。張以濤等以DMEM／F12∶FBS∶DMSO＝7∶2∶1的凍存液成功凍存了MMECs，Danowski K 等［18］也以同樣比例的凍存液有效凍存了BMECs。由于MMECs不能傳代，因此直接對原代MMECs進(jìn)行凍存，所需細(xì)胞量大。而BMECs可用傳代細(xì)胞進(jìn)行凍存。

4 小結(jié)

本研究成功建立原代MMECs與BMECs細(xì)胞培養(yǎng)體系，同時(shí)比較了MMECs與BMECs的分離方法、體外生長培養(yǎng)、傳代及凍存與復(fù)蘇特性，但對于MMECs不能傳代的原因仍需作進(jìn)一步研究。開展培養(yǎng)原代乳腺上皮細(xì)胞及建立乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)體系的研究，不僅有助于建立乳腺生物反應(yīng)器及體外乳腺疾病研究模型，同時(shí)也為體外研究乳腺功能奠定了理論基礎(chǔ)。

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