扇棘單睪吸蟲Real－time PCR 與常規(guī)PCR 檢測方法的建立

李樹清，梅雪芳，林穎崢，石云良，黃騰飛，王巧全，張 強，陳志飛，宋 青，唐智芳，黃維義＊

（1.上海出入境檢驗檢疫局，上海200135；2.廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧530005；3.廣西大學(xué)食品質(zhì)量與安全研究中心，廣西南寧530005；4.羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司，上海200335）

扇棘單睪吸蟲（Haplorchis taichui，Ht）隸屬于異形科（Heterophyidae）單睪屬（Haplorchis），是重要的人獸共患寄生蟲。異形科吸蟲被聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）及世界衛(wèi)生組織（WHO）列為全球最重要的24種食源性寄生蟲之一［1］。成蟲主要寄生于人、鼠、狗、貓等的宿主腸道內(nèi)，囊蚴寄生于淡水魚以及一些海水魚，人和動物因食入帶有囊蚴的魚類而感染［2］。該蟲近年來在東南亞國家和地區(qū)頻繁被報道，感染十分嚴(yán)重。菲律賓和老撾所調(diào)查區(qū)域蟲卵陽性感染率為36%～69.9%，且驅(qū)蟲后均獲得扇棘單睪吸蟲［3－5］。泰國北部所調(diào)查人群中有63.11%感染扇棘單睪吸蟲［6］。我國也有人感染扇棘單睪吸蟲的報道［2，7］。但是目前對該寄生蟲的了解甚少，臨床診斷仍是以糞便蟲卵檢測作為判斷依據(jù)［8］，而成蟲的區(qū)分則要經(jīng)固定壓片和染色鑒定，這都對鑒定者的經(jīng)驗和技術(shù)要求較高，且需花費大量的時間［9］。在過去的治療過程中，有相當(dāng)一部分“扇棘單睪吸蟲患者”被誤當(dāng)做“肝吸蟲患者”進行治療，這可能會加重藥物對病人的毒副作用，也造成了不必要的經(jīng)濟損失［2］?；贒NA 的分子檢測方法的高效性和準(zhǔn)確性，已被用于鑒定各種各樣的蟲種［9－10］，在異形吸蟲的鑒定和區(qū)分方面，許多學(xué)者對分子檢測方法進行過探索［11－12］。本文在前人研究的基礎(chǔ)上，建立real－time PCR 及 常 規(guī)PCR 方 法，以 期 尋 求 可 以 用 于不同實驗室條件的快速可靠的鑒別扇棘單睪吸蟲感染的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用蟲種 扇棘單睪吸蟲、橫川后殖吸蟲（Metagonimus yokogawai）、鉤棘單睪吸蟲（H.pumilio）、華支睪吸蟲（Clonorchis sinensis）、瓦氏瓦特松吸蟲（Watsonius watsoni）、棘口屬吸蟲（Echinostomasp.）、背孔屬吸蟲（Notocotylus sp.）、心形咽口吸蟲（Pharyngostomum cordatum）、野牛平腹盤吸蟲（Homalogasterpaloniae sp.）由廣西大學(xué)寄生蟲實驗室保存。東方次睪吸蟲（Metorchisorientalis tanabe）、衛(wèi) 氏 并 殖 吸 蟲（Paragonimus westermani）；異尖線蟲（Anisakis sp.）、宮脂線蟲（Hysterothylaciumsp.）由上海出入境檢驗檢疫局保存。蟲體均保存于700mL／L的酒精中。

1.1.2 臨床樣品 2012年6月至2013年11月從廣西南寧北湖、白蒼嶺等農(nóng)貿(mào)市場搜集貓犬內(nèi)臟中的吸蟲17條。

1.1.3 主要試劑及儀器 SYBR Premix Ex TaqⅡ（2x），ROX Reference DyeⅡ（50x），Taq 酶、dNTP等均購自大連TaKaRa工程有限公司，DNA 提取試劑購自Quangen公司。

ABI ViiA7 Real－time PCR 儀，Eppendorf AG 22331Hamburg常規(guī)PCR 儀，PowerPac BIO－RAD電泳儀及G：BOX 凝膠成像系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 蟲體DNA 的提取 從700mL／L的酒精保存液中取出單個蟲體，放入去離子水中洗滌2次～3次，每次間隔30min。按照Quangen DNA 提取試劑盒使用說明書提取蟲體基因組DNA，置－20℃［13］保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計 應(yīng)用Premier 5.0 軟件，針對ITS1目標(biāo)片段，設(shè)計特異性引物，上游引物（ht1－F）：5′－ATATTGTTGCCTCCATGGCTGAC－3′；下游引 物（ht6－R）：5′－CTGTACGTAGGTACACGTGTG－3′，可擴增出279bp的片段。引物交由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2.3 陽性克隆質(zhì)粒制備 使用廣西大學(xué)寄生蟲實驗室設(shè)計的18S～28S通用引物HTF1F／HTF1R（上 游 序 列：5′－CTT GAT CAT TTA GAG GAA GT－3′；下 游 序 列：5′－GCT TAA GTT CAG CGG GT－3′）對扇棘單睪吸蟲的蟲種DNA 進行PCR 擴增，其產(chǎn)物（包含18S部分序列，ITS1全序列，5.8S全序列，ITS2全序列，28S部分序列，共4 203bp）序列分析驗證后，通過常規(guī)基因克隆制備技術(shù)得到陽性質(zhì)粒，以此作為陽性核酸對照。基因序列上傳至GenBank（登錄號為：KC999100）。

1.2.4 引物退火溫度的優(yōu)化及PCR 反應(yīng)體系的優(yōu)化 退火溫度（Tm）從30℃～75℃，間隔5℃為一個反應(yīng)，選擇出一個條帶比較亮的溫度區(qū)段，這個區(qū)段再以2℃為一個間隔進行反應(yīng)，根據(jù)條帶亮度選取最佳的退火溫度（圖1）為60℃，從而確定反應(yīng)程序為：

Real－time PCR 擴增條件：50℃2min；95℃10 min；95℃15s，60℃1 min，40 個循環(huán)；熔解曲線：95℃15s，60℃1min，95℃15min。

常規(guī)PCR 擴增條件：95℃5 min；95℃30s，60℃30s，72℃45s，共40個循環(huán)；72℃7min。

Real－time PCR和常規(guī)PCR 分別采用25μL和30μL 反應(yīng)體系，適當(dāng)調(diào)整引物量、模板量等，從而確定最佳反應(yīng)體系為：

常規(guī)PCR 反應(yīng)體系：2×Premix 15μL；上、下游引物各1μL，模板2μL，補滅菌蒸餾水至30μL。

Real－time PCR 反 應(yīng) 體 系：SYBR Premix Ex TaqⅡ（2×）12.5μL，ROX Reference DyeⅡ（50×）0.5μL，上、下游引物各0.5μL，模板1μL，補滅菌蒸餾水至25μL。

圖1 引物退火溫度梯度PCRFig.1 Gradient annealing temperature of conventional PCR

1.2.5 PCR 特異性驗證 利用建立的反應(yīng)體系和條件對1.1.1 中的蟲體樣本進行引物的特異性檢測，結(jié)果顯示為陽性的DNA 樣本進行測序比對。

1.2.6 PCR 敏感性測定 經(jīng)分光光度計測得扇棘單睪吸蟲質(zhì)粒DNA 濃度，然后將其進行10倍系列稀釋，用優(yōu)化好的條件進行PCR 擴增。按照拷貝換算公式，即：每微升樣品中拷貝數(shù)＝樣品濃度（ng／μL）×6.02×1023（阿伏伽德羅常數(shù)）×10－9／（660×重組質(zhì)粒堿基數(shù)）換算成拷貝，得出real－time PCR 和常規(guī)PCR 反應(yīng)的敏感性。

1.2.7 Real－time PCR 的重復(fù)性及標(biāo)準(zhǔn)曲線 將扇棘單睪吸蟲陽性質(zhì)粒進行10－2～10－6系列稀釋，每個稀釋度重復(fù)3次進行real－time PCR 檢測。對結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析，計算每個稀釋度Ct值的標(biāo)準(zhǔn)偏差（S）和變異系數(shù)（CV），并建立檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.8 臨床樣品檢測 根據(jù)形態(tài)學(xué)特征對1.1.2中獲得的蟲體樣本進行初步鑒定后，提取DNA，用本 文 建 立 的real－time PCR 和 常 規(guī)PCR 方 法 分 別 進行檢測鑒定。同時，使用ITS2通用引物3S／A28［14］及自行設(shè)計的18S～28S通用引物HTF1F／HTF1R（上 游 序 列：5′－CTT GAT CAT TTA GAG GAA GT－3′；下 游 序 列：5′－GCT TAA GTT CAG CGG GT－3′）擴增，并將測序結(jié)果與GenBank中序列進行比對，驗證所建立的方法。

2 結(jié)果

2.1 PCR 特異性測定

常規(guī)PCR 結(jié)果（圖2）顯示，除了扇棘單睪吸蟲陽性質(zhì)粒外，引物只能特異擴增扇棘單睪吸蟲DNA，將此樣本PCR 產(chǎn)物測序比對，結(jié)果與陽性質(zhì)粒的序列一致，證明引物能特異擴增扇棘單睪吸蟲。

Real－time PCR 與 常 規(guī)PCR 檢 測 結(jié) 果 一 致，只有扇棘單睪吸蟲質(zhì)粒或DNA 有擴增，熔解溫度分別為85.62℃和85.23℃，其他對照蟲體DNA 無擴增（圖3）。

圖2 常規(guī)PCR 特異性檢測Fig.2 The specificity of conventional PCR

圖3 Real－time PCR特異性檢測Fig.3 The specificity of real－time PCR

2.2 PCR 敏感性測定

扇棘單睪吸蟲質(zhì)粒DNA 經(jīng)分光光度計測得其濃度為20ng／μL，經(jīng)10 倍系列稀釋后，常規(guī)PCR和real－time PCR 均可檢測到108稀釋倍數(shù)的質(zhì)粒DNA（圖4、圖5）。其中常規(guī)PCR 使用2μL 模板，即可檢測到4×10－4pg，86 拷貝；real－time PCR 使用1μL模板，即可檢測到2×10－4pg，43拷貝。陽性質(zhì)粒的熔解溫度介于85.58℃～85.39℃之間。

2.3 Real－time PCR的重復(fù)性及標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4 常規(guī)PCR 敏感性檢測Fig.4 Sensitivity of conventional PCR

對10－2～10－6陽性質(zhì)粒（即4.3×107～4.3×103拷貝／μL）共5各濃度梯度的質(zhì)粒進行擴增，每個濃度重復(fù)3次。分別得到5個梯度的Ct值，計算標(biāo)準(zhǔn)差與變異系數(shù)。5 個梯度的變異系數(shù)均小于0.6%，表明該體系具有較好的重復(fù)性（圖6）。根據(jù)陽性質(zhì)粒5個梯度（10－2～10－6）擴增的Ct值，系統(tǒng)自動生成標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖7），圖中顯示，標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為－0.350 4，截距為37.092，相關(guān)系數(shù)為0.998，擴增效率為92.914%，標(biāo)準(zhǔn)誤差為0.039。初始模板拷貝數(shù)（X）與Ct值之間的線性關(guān)系表達(dá)式為：Ct＝－3.504×logx ＋37.092。表明質(zhì)粒的濃度與Ct值具有很好的相關(guān)性，擴增效率滿足要求。

圖5 Real－time PCR敏感性檢測Fig.5 Sensitivity of real－time PCR

圖6 Real－time PCR的重復(fù)性Fig.6 The repetitiveness of real－time PCR

圖7 Real－time PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.7 The standard curve of real－time PCR

2.4 臨床樣品檢測及驗證結(jié)果

從犬貓內(nèi)臟收集的17條成蟲樣本經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定、real－time PCR和常 規(guī)PCR 擴 增、及 通 用 引 物 擴增產(chǎn)物測序結(jié)果完全一致。檢測結(jié)果經(jīng)測序比對發(fā)現(xiàn)，能得到目的條帶的樣品為扇棘單睪吸蟲（Gen－Bank登錄號：KJ631741），沒有目的條帶的蟲體經(jīng)通用引物擴增并測序比對，分別鑒定為鉤棘單睪吸蟲 （GenBank 登 錄 號：KJ137221，KJ137222，KJ137223，KP165437，KP165438，KP165439），橫川后殖吸蟲（Genebank登錄號：KJ631734，KJ631735，KJ631736， KJ631737， KJ631738， KJ631739，KJ631740），華 支 睪 吸 蟲（KJ137224，KJ137225，KJ137226），心形咽口吸蟲（KJ137229，KJ137230，KJ137231）等。

3 討論

分子生物學(xué)檢測法具有準(zhǔn)確、快速、高效和便于操作的特點，且對操作者的形態(tài)學(xué)鑒定的經(jīng)驗和技術(shù)要求較低，不需要花費大量的人力和時間。Wongsawad C等［12］認(rèn)為，PCR 方法能夠提高糞便中蟲卵檢測的準(zhǔn)確性。在扇棘單睪吸蟲的分子方法研究中已經(jīng)有學(xué)者對其進行了研究和報道，Sato M等［8］利用糞便蟲卵檢查與PCR 檢測相結(jié)合，增加了檢測的靈敏性。Van V K 等［15］采用基于ITS2序列的PCR 方法對扇棘單睪吸蟲不同發(fā)育階段進行研究，這對阻斷疾病傳播有重要意義。

通過設(shè)計特異性引物來進行分子生物學(xué)鑒定還可以省去測序的過程，達(dá)到更方便快捷的目的，很多蟲種的鑒定都采用過這種方法［16］。目前為止，國內(nèi)外還沒有針對扇棘單睪吸蟲的特異性鑒別方法的報道。本研究選擇序列長度較長且和多種吸蟲區(qū)分度較大、進化和變異較快、適合蟲種的種間區(qū)分的ITS1序列作為特異性引物設(shè)計的靶序列，自行設(shè)計了可以特異擴增ITS1序列的引物。該引物不僅能特異擴增扇棘單睪吸蟲ITS1的序列，而且還兼顧了 常 規(guī)PCR 和real－time PCR 對 引 物 的 要 求，可 以同時應(yīng)用于兩種方法。通過對反應(yīng)條件的優(yōu)化，使常規(guī)PCR 的敏感性達(dá)到與real－time PCR 同一數(shù)量級，為不同條件的實驗室的應(yīng)用提供了可能。

本研究所建立的兩種方法經(jīng)GenBank比對未發(fā)現(xiàn)能擴增出其他的相近蟲種，在特異性檢測結(jié)果中顯示扇棘單睪吸蟲與后睪科、次睪科、棘口科等12種寄生蟲成蟲及囊蚴很好的區(qū)分，并且特異性檢測所選蟲種是與所研究目標(biāo)吸蟲同一科屬，或者寄生蟲的成蟲或囊蚴階段能夠混合感染同一宿主進而可干擾檢測的蟲種，初步證明具有較好的特異性。本試驗構(gòu)建的檢測方法運用于犬、貓腸道吸蟲成蟲臨床檢查，經(jīng)驗證可以特異、敏感、快速地檢測到扇棘單睪吸蟲?？山Y(jié)合形態(tài)學(xué)更快速準(zhǔn)確地應(yīng)用于寄生蟲的區(qū)系調(diào)查。

2010年數(shù)據(jù)顯示，亞洲是世界水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量的主體，所占份額高達(dá)89%。亞洲的泰國、越南、菲律賓等東南亞國家為世界領(lǐng)先的魚類生產(chǎn)國，其產(chǎn)品多以外銷為主，而這些國家淡水魚中扇棘單睪吸蟲囊蚴高的感染率對世界人民的健康都是一個不容忽視的威脅。但是目前對扇棘單睪吸蟲的快速、準(zhǔn)確地檢測的研究報道還很少。本研究所建立的方法為扇棘單睪吸蟲成蟲的鑒別提供一種快速、準(zhǔn)確的鑒別方法，為下一步淡水魚中囊蚴的檢疫和鑒定奠定了基礎(chǔ)。

［1］ Joint FAO／WHO Expert Meeting on Foodborne Parasites.Preliminary report：multicriteria－based ranking for risk management of food－borne parasites［R／OL］.［2014－02－23］http：／／apps.who.int／iris／handle／10665／112672.

［2］ 楊益超，李樹林，譚裕光，等.廣西肝吸蟲流行區(qū)人群及淡水魚扇棘單睪吸蟲感染調(diào)查［J］.應(yīng)用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2012，18（2）：75－77.

［3］ Belizario V Y，de Leon W U，Bersabe M J，et al.A focus of human infection by Haplorchis taichui（Trematoda：Heterophyidae）in the southern Philippines［J］.J Parasitol，2004，90（5）：1165－1169.

［4］ Rim H J，Sohn W M，Yong T S，et al.Fishborne trematode metacercariae in Luang Prabang，Khammouane，and Saravane Province，Lao PDR［J］.Korean J Parasitol，2013，51（1）：107－114.

［5］ Chai J Y，Yong T S，Eom K S，et al.Hyperendemicity of Haplorchis taichui infection among riparian people in Saravane and Champasak province，Lao PDR［J］.Korean J Parasitol，2013，51（3）：305－311.

［6］ Radomyos B，Wongsaroj T，Wilairatana P，et al.Opisthorchiasis and intestinal fluke infections in northern Thailand［J］.Southeast Asian J Trop Med Public Health，1998，47（1）：103－103.

［7］ 黎學(xué)銘，楊益超，藍(lán)春庚，等.廣西發(fā)現(xiàn)扇棘單睪吸蟲［J］.中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志，2004，22（1）：61－62.

［8］ Sato M，Pongvongsa T，Sanguankiat S，et al.Copro－DNA diagnosis of Opisthorchis viverrini and Haplorchis taichui infection in an endemic area of Lao PDR［J］.Southeast Asian J Trop Med Public Health，2010，41（1）：28－35.

［9］ 李樹清，李雯雯，陳志飛，等.入境黃鱔顎口線蟲檢疫及蟲種鑒定［J］.中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志，2012，29（5）：358－362.

［10］ 李雯雯，李樹清，張子群，等.黑龍江與廣州顎口線蟲幼蟲分離株的形態(tài)學(xué)觀察及其分子鑒定［J］.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2012，34（2）：104－107.

［11］ Thaenkham U，Phuphisut O，Pakdee W，et al.Rapid and simple identification of human pathogenic heterophyid intestinal fluke metacercariae by PCR－RFLP［J］.Parasitol Int，2011，60（4）：503－506.

［12］ Wongsawad C，Wongsawad P，Chuboon S，et al.Copro－diagnosis of Haplorchis taichui infection using sedimentation and PCR－based methods［J］.Southeast Asian J Trop Med Public Health，2009，40（5）：924－928.

［13］ 彭武麗，鄧明俊，季新成，等.牛新孢子蟲病和弓形蟲病雙重PCR 檢測方法的建立與應(yīng)用［J］.動物醫(yī)學(xué)進展，2013，34（6）：58－62.

［14］ Sugiyama H，Morishima Y，KameokaY，et a1.Polymerase chain reaction（PCR）based molecular discrimination between Paragonimus westermani and P.miyazakii at the metacercarial stage［J］.Mol Cell Probes，2002，16（3）：231－236.

［15］ Van V K，Dalsgaard A，Blair D，et al.Haplorchis pumilio and H.taichui in Vietnam discriminated using ITS－2 DNA sequence data from adults and larvae［J］.Exp Parasitol，2009，123（2）：146－151.

［16］ 劉志剛，吳 彥，孫青松.糞便中華支睪吸蟲蟲卵DNA 的提取及PCR 檢測方法的優(yōu)化［J］.動物醫(yī)學(xué)進展，2013，34（4）：87－89.