曹建雄， 姚 菲， 何迎春， 畢四麗， 王文美， 何 丹， 柳景紅

論 著

壯骨鎮(zhèn)痛膠囊對裸鼠乳腺癌移植瘤細胞磷脂酰肌醇3-激酶的影響

曹建雄， 姚 菲， 何迎春， 畢四麗， 王文美， 何 丹， 柳景紅

目的 探討壯骨鎮(zhèn)痛膠囊對裸鼠乳腺癌轉(zhuǎn)移瘤細胞磷脂酰肌醇3-激酶的作用。方法 32只裸鼠隨機等分為壯骨鎮(zhèn)痛膠囊預(yù)防組、壯骨鎮(zhèn)痛膠囊治療組、參一膠囊陽性藥物對照組和模型組，每組8只，接種乳腺癌細胞MDA-MB-231制備移植瘤，藥物干預(yù)后，采用免疫組織化學(xué)染色法檢測各組裸鼠移植瘤細胞磷脂酰肌醇3-激酶(PI3-K)的表達水平。結(jié)果 與模型組比較，各藥物組瘤重均顯著減輕(均P<0.05)，且預(yù)防組瘤重顯著低于治療組和參一膠囊陽性對照組(均P<0.05)；各藥物組PI3-K表達水平均顯著低于模型組(均P<0.05)，并且預(yù)防組PI3-K表達水平顯著低于參一膠囊陽性對照組和壯骨鎮(zhèn)痛膠囊治療組(均P<0.05)。結(jié)論 壯骨鎮(zhèn)痛膠囊能夠抑制裸鼠乳腺癌移植瘤的生長，其作用可能與抑制磷脂酰肌醇3-激酶表達水平相關(guān)，預(yù)防組較治療組療效更佳。

壯骨鎮(zhèn)痛膠囊； 乳腺癌； 磷脂酰肌醇3-激酶； PI3-K

乳腺癌作為女性最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅婦女健康和生命。整合素是重要的細胞表面受體，通過胞內(nèi)域?qū)⑿盘杺鹘o細胞骨架蛋白來介導(dǎo)細胞與細胞以及細胞與細胞外基質(zhì)間的黏附，并接受和傳導(dǎo)級聯(lián)信號調(diào)節(jié)細胞的存活、增殖、運動等生物學(xué)行為[1]。目前，研究已表明，整合素與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展以及晚期轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，其作用機制是現(xiàn)今腫瘤領(lǐng)域研究的熱點之一。

調(diào)節(jié)整合素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)指標(biāo)的表達可以改變細胞間的跨膜糖蛋白，改變細胞跨膜膜受體，控制級聯(lián)信號傳導(dǎo)，影響細胞黏附遷徙。采用相應(yīng)的干預(yù)措施影響乳腺癌細胞跨膜糖蛋白，可使級聯(lián)信號傳導(dǎo)受到影響，相應(yīng)的生物學(xué)表型特征發(fā)生變化，從而影響瘤細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移潛能[2]。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidyl inositol-3-kinase，PI3-K)可引起細胞壁肌動蛋白絲結(jié)構(gòu)重組，從而增強細胞的遷移及侵襲能力，是整合素依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的基礎(chǔ)，在整合素介導(dǎo)的相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起著關(guān)鍵作用。

我院長期運用壯骨鎮(zhèn)痛膠囊改善乳腺癌患者的預(yù)后，前期臨床研究表明，復(fù)方壯骨鎮(zhèn)痛膠囊對乳腺癌轉(zhuǎn)移性骨疼痛具有較好的止痛作用，并且能夠縮小轉(zhuǎn)移病灶[3]。本研究擬通過觀察壯骨鎮(zhèn)痛膠囊對裸鼠乳腺癌移植瘤PI3-K的影響，探討壯骨鎮(zhèn)痛膠囊對乳腺癌轉(zhuǎn)移的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 32只BALB/c裸小鼠，體重18～22 g，SPF級，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物合格證號為SCXK(湘)2009-0004。裸鼠喂養(yǎng)于SPF三級動物實驗室，飼料及實驗室均由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。

1.1.2 細胞株 高轉(zhuǎn)移人乳腺癌細胞MDA-MB-231，購自中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院現(xiàn)代實驗中心細胞庫。

1.1.3 藥物 壯骨鎮(zhèn)痛膠囊由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科制備，生產(chǎn)批號20101018，規(guī)格0.45 g×24粒/瓶。取壯骨鎮(zhèn)痛膠囊0.45 g，先將膠囊去殼，內(nèi)容物用10 ml無菌生理鹽水溶解搖勻，制成0.045 g/ml藥液，供裸鼠灌胃用。參一膠囊由吉林亞泰制藥股份有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號Z20030044，規(guī)格0.01 g×16粒/盒。取0.04 g 溶于10 ml生理鹽水中，制成0.004 g/ml藥液，供裸鼠灌胃用。

1.1.4 試劑 二甲基亞砜(DMSO)由北京鼎國公司生產(chǎn)；RPMI-1640培養(yǎng)基胰蛋白酶粉由北京中杉生物技術(shù)公司生產(chǎn)；新生小牛血清由杭州四季青公司生產(chǎn)；青霉素、鏈霉素由大連美羅制藥廠生產(chǎn)；即用型SABC免疫組化試劑盒、兔抗人FAK多克隆抗體、DAB顯色試劑盒均由武漢博士德公司生產(chǎn)。

1.1.5 主要儀器 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、電熱恒溫培養(yǎng)箱、超聲波清洗器均由上海新苗醫(yī)療器械公司生產(chǎn)；80-2型離心機由上海手術(shù)器械廠生產(chǎn)；AE31型倒置顯微鏡由Motic公司生產(chǎn)；電熱恒溫水浴箱由津泰斯特公司生產(chǎn)；高壓蒸汽消毒器由山東新華醫(yī)用器械廠生產(chǎn)；GB204型電子天平由瑞士特勒公司生產(chǎn)；Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)由Motic公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 造模與分組 將購買并培養(yǎng)高轉(zhuǎn)移人乳腺癌細胞株MDA-MB-231及BALB/c裸小鼠32只于三級SPF動物室檢疫1周。將新購買的乳腺癌細胞加入含10%新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液后放于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，并進行細胞傳代。待乳腺癌細胞長滿培養(yǎng)瓶，將其用D-Hank’s液洗滌后，用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液消化，取少許RPMI-1640培養(yǎng)液吹打成細胞懸液，并將乳腺癌細胞株MDA-MB-231細胞制成細胞懸液于裸小鼠前腋皮下接種，建立人乳腺癌皮下移植瘤模型。32只裸小鼠根據(jù)EXCEL軟件生成的隨機數(shù)字，隨機分為4組：壯骨鎮(zhèn)痛膠囊預(yù)防組、壯骨鎮(zhèn)痛膠囊治療組、參一膠囊陽性藥物對照組和模型組，每組8只。接種后，每天觀察裸鼠的一般情況及移植瘤的生長情況。

1.2.2 藥物處理 灌胃用藥干預(yù)前，各組裸鼠均在SPF三級動物房適應(yīng)環(huán)境1周。1周后各組裸鼠接種乳腺癌細胞，預(yù)防組裸鼠于接種后第1天開始即用壯骨鎮(zhèn)痛膠囊藥液灌胃，模型組予以等體積生理鹽水灌胃，該兩組灌胃一直持續(xù)到壯骨鎮(zhèn)痛膠囊治療組及參一膠囊陽性對照組灌胃結(jié)束，前后共灌胃28天。壯骨鎮(zhèn)痛膠囊治療組及參一膠囊陽性對照組裸鼠則暫不作處理。根據(jù)人和動物的體重，折算出等效計量給藥，壯骨鎮(zhèn)痛膠囊預(yù)防組和治療組的劑量標(biāo)準(zhǔn)約為0.5 g·kg-1·d-1，參一膠囊陽性藥物對照組用量為0.3 g·kg-1·d-1，7天后壯骨鎮(zhèn)痛膠囊治療組和參一膠囊組開始給藥，此時這兩組裸鼠均已長瘤。治療組和參一膠囊陽性對照組裸鼠每天灌胃1次，持續(xù)21天；21天后處死各組動物，分離移植瘤，分別切取標(biāo)本制片。

1.2.3 指標(biāo)檢測 抑瘤率計算：處死裸鼠后，分離移植瘤，稱量瘤體重量，將所得數(shù)據(jù)輸入統(tǒng)計軟件，計算抑瘤率。抑瘤率=(1-給藥組平均瘤重/對照組平均瘤重)×100%。腫瘤細胞PI3-K測定：裸鼠處死后將移植瘤取下，用10%甲醛溶液浸泡，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，進行常規(guī)的HE染色和免疫組化染色，觀察乳腺癌移植瘤組織鏡下表現(xiàn)，并計算腫瘤細胞PI3-K的表達情況。其中PI-3K顯色在細胞質(zhì)或細胞膜上，觀察免疫組化處理后組織照片的棕黃色顆粒的數(shù)量，并用陽性細胞表示，通過Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)計算各指標(biāo)的光密度值，并分別比較各組的表達差異。

2 結(jié)果

2.1 各組裸鼠瘤重比較

經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)，參一膠囊組(0.5793±0.0340)g、壯骨鎮(zhèn)痛膠囊預(yù)防組(0.3873±0.0464)g、壯骨鎮(zhèn)痛膠囊治療組(0.5700±0.0440)g，瘤重均顯著輕于模型組(0.8975±0.0462)g(均P<0.05)，說明各用藥組對裸鼠移植瘤生長起到一定的抑制作用。預(yù)防組瘤重輕于治療組(P<0.05)。

2.2 各組移植瘤常規(guī)病理組織學(xué)HE染色變化比較

空白模型組細胞排列密集甚至重疊，呈鋪路石樣排列，細胞質(zhì)少，細胞核呈圓形或橢圓形的泡狀，大核仁位于中央，間質(zhì)間淋巴細胞浸潤，可見癌巢。各給藥組可見癌細胞形態(tài)不規(guī)則，排列松散，多核，可見散在核固縮瘤細胞，有包膜完整的細胞碎片，瘤體中可見凝固性壞死，大量膠原纖維增生，可見凋亡小體。見圖1。

圖1 病理組織學(xué)變化比較(HE染色 ×400)(a空白模型組；b參一膠囊陽性對照組；c壯骨鎮(zhèn)痛膠囊治療組；d壯骨鎮(zhèn)痛膠囊預(yù)防組)

2.3 各組移植瘤組織整合素黏附移植信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路PI3-K表達活性免疫組化比較

免疫組化法測定PI3-K表達水平(光密度值表示)，比較各組表達活性及差異性。各組PI3-K表達水平存在顯著差異(F=14.56，P=0.000)，與模型組比較，各用藥組PI3-K表達水平顯著降低(均P<0.05)。見表1及圖2。

組別光密度值模型組30.75±4.58參一膠囊對照組11.56±1.98★壯骨鎮(zhèn)痛膠囊治療組23.57±5.76★☆壯骨鎮(zhèn)痛膠囊預(yù)防組7.72±1.02★☆△

與空白模型組比較★P<0.05；與參一膠囊對照組比較☆P<0.05；與壯骨鎮(zhèn)痛膠囊治療組比較△P<0.05。

圖2 PI3-K表達活性差異比較 (×400)(a空白模型組；b參一膠囊陽性對照組；c壯骨鎮(zhèn)痛膠囊治療組；d壯骨鎮(zhèn)痛膠囊預(yù)防組)

3 討論

壯骨鎮(zhèn)痛膠囊是筆者治療癌癥多發(fā)轉(zhuǎn)移的經(jīng)驗方，在湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科已應(yīng)用十余年，并已由本院制成了院內(nèi)制劑使用至今，療效反饋較好，對各種癌癥轉(zhuǎn)移特別是對晚期乳腺癌的骨轉(zhuǎn)移效果顯著[4]。

壯骨鎮(zhèn)痛膠囊組方為骨碎補、仙靈脾、補骨脂、桑寄生、三七粉、莪術(shù)、延胡索、威靈仙、穿山甲、制南星、陳皮、芍藥、甘草、制地龍、全蝎、蜈蚣。該方以骨碎補、補骨脂、仙靈脾、桑寄生為君藥，補骨脂苦溫入肝腎，補益肝腎同時能活血定痛；仙靈脾、桑寄生、補骨脂歸腎經(jīng)能增強君藥補腎生髓之力；三七、莪術(shù)、延胡索、威靈仙及穿山甲共為臣藥行氣活血、散結(jié)通絡(luò)、消腫定痛。制南星善消風(fēng)痰、開結(jié)閉、止骨痛；地龍成能軟堅而制約諸藥之溫?zé)崽^，并能通經(jīng)活絡(luò)引諸藥至病所，故用其為使藥；頑痹邪氣久羈，深入經(jīng)髓骨骱，氣血凝滯不行，濕痰瘀濁膠固，經(jīng)絡(luò)閉塞不通，非草木之品所能宣達，必借蟲蟻之類搜剔竄透，方能使?jié)崛ツ_，經(jīng)行絡(luò)暢，邪除正復(fù)，故方中義加用全蝎、蜈蚣以破瘀通絡(luò)、搜剔定痛，以增強散結(jié)通絡(luò)止痛、抗癌抑癌之效。佐以陳皮、白芍、甘草為佐藥化痰行氣、緩急止痛抗癌；壯骨鎮(zhèn)痛膠囊全方體現(xiàn)了標(biāo)本兼顧，補泄同用，扶正祛邪，抗癌抑癌的指導(dǎo)思想基礎(chǔ)上，運用滋補肝腎、活血化瘀、消腫散結(jié)、行氣止痛、以毒攻毒諸法合用以達到治療腫瘤及其轉(zhuǎn)移，是治療腫瘤及抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的有效藥物之一。

壯骨鎮(zhèn)痛膠囊的研究包括臨床研究和實驗室研究，前期臨床研究應(yīng)用壯骨鎮(zhèn)痛膠囊治療乳腺癌晚期轉(zhuǎn)移，研究結(jié)果表明，中藥復(fù)方壯骨鎮(zhèn)痛膠囊對乳腺癌轉(zhuǎn)移性骨疼痛具有較好的止痛作用；且具有縮小轉(zhuǎn)移病灶的作用[3，5-6]。

本實驗研究證實，壯骨鎮(zhèn)痛膠囊預(yù)防組、壯骨鎮(zhèn)痛膠囊治療組及參一膠囊陽性對照組對人乳腺癌細胞裸鼠移植瘤的生長均有抑制作用，但以壯骨鎮(zhèn)痛膠囊預(yù)防組更為明顯。在抑制PI3-K的表達方面，壯骨鎮(zhèn)痛膠囊預(yù)防組療效最好，壯骨鎮(zhèn)痛膠囊中藥治療組及參一膠囊陽性對照組均起到明顯抑制PI3-K表達的作用。說明壯骨鎮(zhèn)痛膠囊可抑制裸鼠移植瘤組織中PI3-K的表達。

綜上所述，壯骨鎮(zhèn)痛膠囊在促進腫瘤細胞凋亡及抑制腫瘤細胞黏附遷移方面效果確切，值得進一步推廣應(yīng)用。

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Effects of zhuanggu zhentong capsule on the role of phosphatidyl inositol 3-kinase (PI3K) of nude mouse breast cancer metastatic tumor cells

CAOJianxiong,YAOFei,HEYingchun,BISili,WANGWenmei,HEdan,LIUJinghong

(1.DepartmentofOncology,theFirstAffiliatedHospitalofHunanUniversityofChineseMedicine，Changsha410007,China;2.HunanUniversityofChineseMedicine,Changsha410007,China;3.DepartmentofOrthopaedicandTraumatology,theFirstAffiliatedHospitalofHunanUniversityofChineseMedicine，Changsha410007,China)

LIUJinghong,E-mail: 2274674521@qq.com

Objective To discuss zhuanggu zhentong capsule on the role of phosphatidyl inositol 3-kinase of nude mouse breast cancer metastatic tumor cells.Methods 32 nude mice were randomly divided into four groups, named as the prevention group of zhuanggu zhentong capsule; the treatment group of zhuanggu zhentong capsule; the positive drug control group of shenyi capsule and the blank model group. Each group was consisted of eight nude mice. After the nude mice implanted breast cancer cells and drug intervention, we would calculate and contrast the inhibition rate of tumor and phosphatidyl inositol 3-kinase of tumor cells for each group of nude mice.Results Among the positive drug control group, the prevention group and the treatment，it was found that the inhibition to the growth and the expression of PI3-K in human breast cancer cells in nude mice transplanted tumor. But the effect of the prevention group of zhuanggu zhentong capsule was more apparent.Conclusions Zhuanggu zhentong capsule can restrain the activity of phosphatidyl inositol 3-kinase expressed in nude mouse.The effect of the prevention group is better than that of the treatment group.

zhuanggu zhentong capsule; breast cancer; phosphatidyl inositol 3-kinase; PI3-K

湖南省科技廳資助項目(2007TP4021)；湖南省科技廳資助項目(2010TT2020)；湖南省教育廳 基金項目(09C724)；湖南省自然科學(xué)基金項目(13JJ3103)

410007 湖南 長沙，湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 腫瘤科(曹建雄)； 410208 湖南 長沙， 湖南中醫(yī)藥大學(xué)(姚 菲，何迎春，畢四麗，王文美，何 丹)；410007 湖南 長沙，湖南中醫(yī)藥 大學(xué)第一附屬醫(yī)院 骨傷科(柳景紅)

曹建雄，男，教授，主要從事腫瘤防治研究，E-mail： 857676480@qq.com

柳景紅，男，主任醫(yī)師，教授，主要從事骨病防治研究，E-mail: 2274674521@qq.com

10.3969/j.issn.1674-4136.2015.03.007

1674-4136(2015)03-0167-04

2015-02-04][本文編輯：李 慶]