王 艷,劉曉輝,張學智,彭清林,王國春
(中日友好醫(yī)院 風濕免疫科,北京 100029)
抗線粒體抗體(antimitochondrial antibody,AMA)由Maokey 等于1958 年首次于原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis,PBC)患者血清中發(fā)現(xiàn), 是人體內一種無種屬特異性和器官特異性的自身抗體。 目前臨床上常用的檢測抗線粒體抗體的方法為間接免疫熒光法(IIF),其檢測的是總的抗線粒體抗體;酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測的是與PBC 高度相關的AMA-M2 亞型。 理論上講,IIF 法和ELISA 法檢測的結果應該具有一致性,但臨床中經(jīng)常出現(xiàn)不一致的結果:ELISA 法測得AMA-M2 陽性,IIF 法測得AMA 陰性。 這常給臨床醫(yī)生對結締組織?。╟onnective tissue disease,CTD)的病情評估和診斷帶來一定的干擾。 因此,本文總結了2 種方法在實際臨床檢測中的相關性,以提高該抗體對臨床診斷的價值。
選取2011 年1 月~2013 年6 月在我院門診及住院患者中, 使用2 種檢測方法:IIF 檢測AMA和ELISA 法檢測AMA-M2 且診斷明確的患者共726 例。 記錄患者的AMA 檢測結果及臨床診斷。檢測標本均為血清標本。
1.2.1 間接免疫熒光法(IIF 法)
采用Euroimmun 試劑盒檢測AMA,嚴格按試劑盒說明書操作。①加樣品:用樣品緩沖液將待檢血清按1:100 比例稀釋混勻,加25μl 標準品及稀釋好的血清于倒扣板上,蓋片,溫育30min。 ②加熒光標記的抗體:加入熒光標記的二抗體液25μl于倒扣板,蓋片,置30min。③用封片劑封片。④使用Olympus BX-51 熒光顯微鏡讀片。
1.2.2 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA 法)
采用Euroimmun 試劑盒檢測血清AMA-M2水平并嚴格按試劑盒說明書操作。 ①加樣品:用樣品稀釋緩沖液將待檢血清按1:200 比例稀釋,分別將1~5 號標準品、 質控品及稀釋血清100pl加入用靶抗原包被的微孔中,溫育30min。②加酶標抗體:加入酶標二抗體液100ml,振蕩混勻后,置30min。③顯色反應:加入顯色劑各100ml,避光反應15min。④終止反應:加入終止液。⑤比色:將微孔板置于酶標儀上以450 nm 為主波長、630nm為副波長掃描測定各孔吸光度值。
采用Excel 2007 和SPSS16.0 軟件處理測定數(shù)據(jù)。 IIF 和ELISA 法檢測抗線粒體抗體結果的一致性采用Kappa 檢驗。
共計726 份標本,IIF 檢測AMA 陽性47 份,陽性率為6.5%;ELISA 檢測AMA-M2 陽性95份,陽性率為13.1% (表1)。 IIF 與ELISA 法檢測抗線粒體抗體結果的一致率為91.4%, 二者具有一致性(P<0.05)。 不一致時,以IIF 法AMA 陰性同時ELISA 法AMA-M2 陽性多見(7.6%)。
表1 IIF 與ELISA 檢測抗線粒體抗體結果 n
表2 PBC 組與非PBC 組抗線粒體抗體分布n(%)
表3 AMA/AMA-M2 陽性患者的診斷n
以PBC 的臨床診斷為金標準,726 份標本中37 份(5.1%)確診PBC。 其他診斷為干燥綜合征、類風濕關節(jié)炎、 肌炎、 硬皮病等多種疾病。 IIF、ELISA 檢測對PBC 的確診率分別為90% 、91.04%。 IIF 診斷PBC 的敏感性為78.4%,特異性為97.4%;ELISA 診斷PBC 的敏感性和特異性分別為100%和91.6%(表2)。
ELLISA 和IIF 檢測AMA 陽性 (AMA+/M2+)40 例:診斷PBC 29 例,占72.5%;其他CTD 7 例,占17.5%。 具體見表3。
圖1 AMA-/M2+組中,AMA-M2 抗體在其他CTD 和PBC 中的抗體滴度
表3 示,AMA-/M2+組診斷為其他CTD 的35例患者中,干燥綜合征(SS)12 例(34.3%),系統(tǒng)性紅斑狼瘡6 例 (17.1%)。 女性29 例, 發(fā)病率82.8%;男性6 例,發(fā)病率17.1%。
其他CTD 組和PBC 組的AMA-M2 抗體濃度分布見圖1。 2 組間(54.9RU/ml vs 64.8RU/ml)無統(tǒng)計學差異(P=0.055)。
正常人血清中無抗線粒體抗體存在。 一般多見于慢性肝炎、肝硬化患者和PBC 患者。 近年研究發(fā)現(xiàn),AMA 也見于自身免疫病患者的血清中,如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合征等[1,2]。 AMA 的靶抗原是線粒體膜上的多種蛋白,成分復雜,現(xiàn)知有M1~M99 種成分。 其中,M2 亞型在臨床輔助疾病的診斷及病情評估中意義最大,文獻報道,AMAM2 見于90%的PBC 患者。 其診斷的靶抗原是線粒體內膜上的丙酮酸脫氫酶和α-酮酸脫氫酶的復合體, 是PBC 患者血清中AMA 反應的主要成分[3,4]。 系統(tǒng)性紅斑狼瘡,類風濕關節(jié)炎中檢測的抗體滴度通常較低[4],以干燥綜合征(SS)最為常見,發(fā)生率高達47%~81%。有文獻報道,還在慢性丙型肝炎中發(fā)現(xiàn)AMA-M2 抗體[5]。本研究中,抗線粒體抗體陽性的患者CTD發(fā)病率很高,尤其是AMA-/M2+組患者, 診斷為CTD 比率最高,為63.6%。其AMA-M2 抗體滴度集中于28~89RU/ml之間。 因此,在無特征性臨床表現(xiàn)階段,如肝功能ALP、GGT 升高等,單獨的AMA-M2 陽性時,應結合其臨床癥狀和免疫學指標, 考慮是否為其他CTD 的可能性。CTD 中,以SS 常見,3 組診斷率分別為AMA-/M2+,21.8%;AMA+/M2+,12.5%;AMA+/M2-,14.3%。 PBC 的發(fā)病與自身免疫、病原微生物感染、接觸化學物品、遺傳、環(huán)境因素等有關[6],這與CTD 極為相似。
PBC 診斷的一個很重要的抗體是AMA,并且它和疾病的病理變化有很大關系, 和AST 及肺的纖維化高度相關[7],與PBC 的病期、疾病嚴重程度、治療效果均無相關性。 AMA-M2 亞型抗體見于90%的PBC 患者。 PBC 起病緩慢而隱匿,早期癥狀多不明顯或不典型,常伴有高強度的AMA[8]。然而當早期僅有ALP、GGP 升高, 且合并其他CTD 時,常常會用一源論多系統(tǒng)損害來解釋其肝損傷。 中晚期肝內及中等大小膽管的慢性淤膽性炎癥,膽管破壞和閉塞,纖維化,導致肝硬化甚至肝功能衰竭,最終死于各種并發(fā)癥[9]。
在很長一段時間被認為, 大約5%~10%被診斷為PBC 的患者,其AMA 是陰性的[8,10]。 本研究中,AMA-/M2+組,診斷為PBC 的患者多數(shù)歸類于AMA 陰性, 他們在肝臟B 超排除膽道阻塞情況下,行肝活檢病理檢查而確診。 雖然此種AMA 陰性的患者和抗體陽性的患者血清學指標有差異,但近年研究發(fā)現(xiàn),這些患者的疾病進展過程,血清生化指標及肝臟組織學檢查, 都和AMA 陽性患者沒有明顯差異[11,12]。 并且,此類患者的抗核抗體和抗平滑肌抗體更多的出現(xiàn)陽性[3,13,14]。
在本組AMA/AMA-A2 陽性診斷PBC 的37例患者中,AMA 陰性8 例;無M2 陰性患者。 由于樣本數(shù)量的局限性, 不排除有M2 陰性患者診斷為PBC[10]。本研究顯示,針對醫(yī)院就診人群,ELISA檢 測AMA-M2 的 陽 性 率(13.1% ) 高 于IIF(6.5%),但二者結果基本一致。2 種方法檢測結果存在8.5%的不一致, 其中以IIF 法陰性同時ELISA 法AMA-M2 陽性多見(7.6%)。 2 種檢測方法診斷PBC 的準確率均在90%以上,說明都能較好的用于PBC 診斷。IIF 檢測雖然特異性較高,但敏感度只有78.4%;ELISA 雖然敏感性較高,但是特異性不如IIF。 因此,我們認為IIF 和ELISA 應同時進行,以增加診斷的敏感度和特異性。
上述2 種檢測AMA 的方法,其結果不一致,原因可能有以下幾種:(1)抗原遞呈給抗體的載體不同。 (2)抗體親和力不同。 IIF 陽性而ELISA 陰性, 則是因為AMA 成分復雜,M2 型抗原是其近百種亞型抗原中的一種。
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