劉平安，莫 陽，張國民*，吳東升，張 彧，張晨陽，彭旭秀（湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208）

紅景天對細(xì)顆粒物PM2.5所致急性肺損傷大鼠干預(yù)作用的研究

劉平安，莫 陽，張國民*，吳東升，張 彧，張晨陽，彭旭秀
（湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208）

目的 研究紅景天對大氣細(xì)顆粒物PM2.5所致急性肺損傷大鼠的干預(yù)作用。方法 健康成年Wistar大鼠40只隨機(jī)分為空白對照組、假手術(shù)組、模型組、紅景天組。采集空氣中細(xì)顆粒物制成所需濃度的生理鹽水混懸液對模型組和紅景天組進(jìn)行氣管滴注，并在染塵前進(jìn)行灌胃給藥。最后一次染毒24 h后，用PBSl灌洗肺部，收集支氣管肺泡灌洗液，并檢測肺灌洗液中ACP、AKP、LDH、MDA、SOD的含量。結(jié)果 （1）PM2.5染塵后肺灌洗液中ACP、AKP、LDH均升高，模型組與假手術(shù)組比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；給予紅景天煎液灌胃給藥后，肺灌洗液中ACP、AKP、LDH均明顯下降；（2）PM2.5染塵后肺灌洗液中的MDA含量明顯增加，SOD活性降低；與模型組相比，紅景天組的MDA量降低，而SOD活性增加（P＜0.05）。結(jié)論 紅景天能抑制PM2.5對肺組織所產(chǎn)生的炎癥損傷，抑制其對肺組織的損傷與氧化應(yīng)激效應(yīng)有關(guān)。

紅景天；細(xì)顆粒物PM2.5；急性肺損傷；氧化應(yīng)激

細(xì)顆粒物（PM2.5）通過損傷呼吸道黏膜上皮細(xì)胞，部分沉積在肺泡內(nèi)或肺間質(zhì)內(nèi)，激活肺內(nèi)的免疫細(xì)胞，引起氣道炎性反應(yīng)，造成呼吸系統(tǒng)疾病[1-2]。急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是各種直接或間接致傷因素導(dǎo)致的肺泡上皮細(xì)胞及毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，ALI的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，迄今尚無有效的防治藥物，各種途徑產(chǎn)生的自由基可能是ALI的發(fā)病基礎(chǔ)[3]。紅景天為景天科植物大花紅景天Rhadiola crenulata（Hr.f.et Thoms.）H.Ohba的干燥根和根莖，功能益氣活血，通脈平喘?！侗静菥V目》：“紅景天，祛邪惡氣，補(bǔ)諸不足”。紅景天是良好的天然抗氧化劑，可以通過清除超氧陰離子自由基(·O2)、羥基自由基(·OH)、脂氧自由基、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH·)等，螯合金屬離子，抑制脂質(zhì)過氧化，提高內(nèi)源性自由基清除系統(tǒng)中關(guān)鍵酶類(超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSHPX)等活性，從而降低細(xì)胞脂質(zhì)過氧化程度，減少多余自由基造成的傷害。本實(shí)驗(yàn)采用高劑量的PM2.5染毒處理大鼠建立急性肺損傷模型，觀察紅景天對PM2.5所致急性肺損傷大鼠的保護(hù)作用及其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

紅景天原藥材購自山西千鶴藥業(yè)有限公司，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科采用JY-13實(shí)驗(yàn)用煎藥機(jī)（吉首市中誠制藥機(jī)械廠）煎煮紅景天粉末90 min，濃縮至生藥量0.086 5 g/mL；ACP試劑盒 （批號：20140119），AKP試劑盒 （批號：20140115），LDH試劑盒 （批號：20140117），MDA試劑盒 （批號：20140117))和SOD試劑盒 （批號：20140115)，均為南京建成生物公司；TH-150C型大容量大氣總顆粒物智能采樣器（北京地質(zhì)儀器廠）；玻璃纖維濾膜(美國PALL公司)。

1.2 PM2.5的采集及懸浮液的制作

用TH-150C型大容量大氣總顆粒物智能采樣器采集建筑工地附近空氣中的大氣顆粒物，并通過20 cm×20 cm的超細(xì)玻璃纖維濾膜 （孔徑為0.3 μm）篩選出粒徑極小的PM2.5顆粒物，連續(xù)24 h采樣，連續(xù)采集1個月，剪短吸附有PM2.5的纖維濾紙對折后侵入超純水，超聲低溫震蕩30 min，紗布過濾洗脫液后，濾液用4℃、10 000 r／min、20 min離心3次，棄上清液，稱質(zhì)量后 -20℃冰箱保存，用生理鹽水配成造模染毒所需濃度37.5 mg/mL的顆粒物懸液，超聲震蕩15 min后混合均勻，4℃冰箱保存?zhèn)溆肹4]。

1.3 動物分組、給藥與染毒[5]

正常成年雄性wistar大鼠40只，體質(zhì)量（200± 20）g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證號：SCXK （湘）20140003，SPF實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。隨機(jī)分為4組，每組10只，分別為空白對照組、假手術(shù)組、模型組、紅景天組。空白對照組不作任何處理,假手術(shù)組為手術(shù)切開氣管但不進(jìn)行PM2.5毒液的染塵造模；另2組大鼠手術(shù)切開后氣管感染PM2.5毒液進(jìn)行造模，方法如下：大鼠麻醉暴露口咽部，PM2.5染塵造模（造模劑量為11.25 mg/只）采用氣管注入染塵的方法，經(jīng)氣管緩慢注入制備好的PM2.5懸浮液，滴注體積1.5 mL/kg，1次/周，共4次。紅景天組術(shù)后給予紅景天煎液灌胃給藥，濃度為0.086 5 g/mL，1 mL/100 g，1次/d（紅景天的臨床用量為6 g，根據(jù)體表面積換算公式換算大鼠等效臨床用量為0.173 g），其余3組給予同體積生理鹽水1 mL/100 g灌胃，1次/d；各組均給藥27 d。手術(shù)后的老鼠注射青霉素（100萬U/kg）預(yù)防術(shù)后感染。

1.4 指標(biāo)檢測

1.4.1 肺臟支氣管肺泡灌洗液制備 在最后一次染毒24 h后，用10%水合氯醛對大鼠進(jìn)行麻醉。在主支氣管處剪一小“V”形切口，插入16號的灌胃針頭，結(jié)扎固定，用 PBS 3.5 mL灌洗肺部，共灌洗 2次，收集支氣管肺泡灌洗液 (BALF）至5 mL，1 000 r/min離心15 min，留取上清液置-20℃保存。

1.4.2 肺灌洗液中生化指標(biāo)的測定 肺灌洗液中酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）、乳酸脫氫酶（LDH）、丙二醛（MDA）、過氧化物歧化酶（SOD）的測定，嚴(yán)格按試劑盒要求操作。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。對計(jì)量資料進(jìn)行正態(tài)性、方差齊性檢驗(yàn)。方差齊者用單因素方差分析（F檢驗(yàn)）。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺灌洗液中ACP、AKP、LDH的變化

和空白對照組比較假 手 術(shù) 組 的 ACP、AKP、LDH，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）；PM2.5染塵后肺灌洗液中ACP、AKP、LDH均升高，模型組與假手術(shù)組比較差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01）；給予紅景天煎液后，肺灌洗液中 ACP、AKP、LDH均明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）。結(jié)果如表1所示。

表1 肺灌洗液中生化指標(biāo)測定結(jié)果 （±s，n=10，U/L）

表1 肺灌洗液中生化指標(biāo)測定結(jié)果 （±s，n=10，U/L）

注：與假手術(shù)組相比△△P＜0.01；與模型組相比▲P＜0.05。下表同。

組別空白對照組假手術(shù)組模型組紅景天組ACP 0.49±0.19 0.50±0.21 1.42±0.32△△0.79±0.29▲AKP 1.74±0.34 1.75±0.51 6.39±1.52△△3.82±0.41▲LDH 872±162 871±123 1 636±87△△1 135±72▲

2.2 各組大鼠肺灌洗液中MDA和SOD量的變化

和空白對照組比較假手術(shù)組MDA和SOD差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）；PM2.5染塵后肺灌洗液中的MDA含量明顯增加 (P＜0.01)，SOD活性降低 (P＜0.01)；與模型組相比，紅景天組的MDA量降低，而SOD活性增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)果如表2所示。

表2 肺灌洗液中MDA和SOD活性的比較 （±s，n=10）

表2 肺灌洗液中MDA和SOD活性的比較 （±s，n=10）

組別正常組假手術(shù)組模型組紅景天組MDA/(nmol/mL) 0.28±0.10 0.29±0.09 2.73±0.49△△1.37±0.29▲SOD/(U/mL) 53.35±6.20. 54.04±5.91 33.07±3.78△△40.58±4.23▲

3 討論

近年來，大氣PM2.5污染受到廣泛的關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，大氣PM2.5濃度每增加10 μg/m3，我國居民每日死亡率上升0.31%，呼吸系統(tǒng)疾病每日死亡率上升1.00%[6]。有研究認(rèn)為，氧化應(yīng)激損傷和炎癥因子介導(dǎo)是PM2.5毒性作用的可能作用途徑[7-8]。急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是各種直接或間接致傷因素導(dǎo)致的肺泡上皮細(xì)胞及毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，主要特征為彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫，可導(dǎo)致急性低氧性呼吸功能不全，嚴(yán)重時(shí)為急性呼吸窘迫綜合征 (acute respiratorydistress syndrome，ARDs)，至今仍缺乏有效的治療方法。LDH屬胞漿酶，是常用于反映顆粒物細(xì)胞毒性的敏感指標(biāo)。I型上皮細(xì)胞損壞及吞噬細(xì)胞的破裂均可引起LDH增加，而ACP、AKP、及IL-1β、TNF-α含量的改變常是判斷炎癥反應(yīng)的重要參考指標(biāo)。LDH屬胞漿酶，ACP為溶酶體酶，當(dāng)細(xì)胞膜受損或細(xì)胞死亡溶解后會大量釋出；AKP主要由肺泡Ⅱ型細(xì)胞產(chǎn)生，部分由中性粒細(xì)胞產(chǎn)生，其活性提示了肺泡Ⅱ型細(xì)胞受損程度和中性粒細(xì)胞浸潤程度[9]。本實(shí)驗(yàn)中，大鼠感染PM2.5后，肺灌洗液中ACP、AKP、LDH含量均升高，表明PM2.5對肺組織細(xì)胞具有毒效應(yīng)。紅景天組能減少PM2.5對肺的損傷，使ACP、AKP、LDH含量降低。

PM2.5除顆粒物本身具有自由基活性外，還可以作用于上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，使它們釋放活性氧或活性氮[10]，這些顆粒物被吸入后，可激發(fā)體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，使體內(nèi)氧化和抗氧化系統(tǒng)失衡，一方面使得脂質(zhì)過氧化酶(LPO)增高，另一方面使得體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)耗竭，表現(xiàn)為谷胱甘肽過氧化物酶 (GSH-PX)下降和LPO/ GSH-PX增高，導(dǎo)致谷胱甘肽轉(zhuǎn)化為氧化型、上皮細(xì)胞受到損傷、細(xì)胞通透性增加，引起肺損傷和肺疾病，因此測定活性自由基產(chǎn)物、過氧化物酶及抗氧化物如MDA、SOD含量的變化，可以反映 PM2.5對機(jī)體的氧化損傷毒性作用[11]。SOD可以抵抗機(jī)體內(nèi)的超氧陰離子損傷，MDA是細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的代表性產(chǎn)物[12]，當(dāng)機(jī)體的抗氧化應(yīng)激水平增加后，會使體內(nèi)的氧自由基增多，脂質(zhì)過氧化物MDA的含量增加，而超氧化物歧化酶SOD是體內(nèi)阻止氧化自由基重要酶類且能防止脂質(zhì)過氧化保護(hù)機(jī)體及組織，脂質(zhì)過氧化物還能對細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能造成不可逆轉(zhuǎn)的損傷，所以體內(nèi)SOD酶活力和MDA的含量大致能反映機(jī)體的氧化應(yīng)激水平[13]。PM2.5所致急性肺損傷模型為國際通用的模型，具有成功率高、重復(fù)性好、穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[5]。本實(shí)驗(yàn)顯示，染毒后肺灌洗液中SOD下降，MDA升高，表明PM2.5的吸入使體內(nèi)特別是肺內(nèi)氧化負(fù)荷增加，進(jìn)一步激發(fā)體內(nèi)的脂、酮氧化反應(yīng)，肺組織的氧化和抗氧化狀態(tài)失衡，上皮細(xì)胞受到損傷，細(xì)胞膜通透增加，引起肺損傷，肺疾?。ū憩F(xiàn)如呼吸功能改變，肺纖維化，慢性氣管炎，肺氣腫）。紅景天可逆轉(zhuǎn)這種氧化應(yīng)激壓力，使SOD升高，MDA下降，因此推測紅景天是通過抑制機(jī)體的氧化應(yīng)激改善肺的功能，抑制肺損傷。

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（本文編輯 楊 瑛）

Study of Effects of Rhodiola rosea on Rats of Acute Lung Injury Induced by Fine Particles PM2.5

Ping-An Liu,Yang Mo,Guo-Min Zhang*,Dong-Sheng Wu,Yu Zhang,Chen-Yang Zhang,Xu-Xiu Peng
(Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China)

Objective To study of Rhodiola rosea on rats of acute lung injury induced by atmospheric fine particles PM 2.5. Methods 40 healthy adult Wistar rats were randomly divided into blank control group, sham operation group,model group,Rhodiola rosea group.The model group and Rhodiola rosea group were treated by intratracheal instillation ofnormalsaline suspension which was made by collecting the fine particulate matterinto the required concentration,and were given by gavage before the dye dust.Last 24 h after infected with PBSl lavage lungs,collecting bronchoalveolar lavage fluid,and detect the contents of ACP,AKP,LDH,MDA,SOD in lung lavage fluid.Results(1)The ACP,AKP,LDH in lung lavage fluid after PM2.5 dye dust were increased,the differences between model group and sham operation group had obvious statistical significance (P＜0.01); The ACP,AKP,LDH in lung lavage fluid were significantly decreased after giving Rhodiola rosea decoction by lavage; (2)After PM2.5 dye dust,the MDA content in lung lavage fluid was increased significantly,SOD activity was decreased;Compared with the model group,the MDA was decreased and SOD activity was increased in Rhodiola rosea group.Conclusion Rhodiola rosea can inhibit the inflammation of lung tissue damage induced by PM2.5,which was related with the oxidative stress effect.

Rhodiola rosea;fine particles PM2.5;acute lung injury;oxidative stress

R285.5

B

10.3969/j.issn.1674－070X.2015.07.002

2015－03－06

湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（14JJ7062）；2014年度湖南省大學(xué)生研究性學(xué)習(xí)和創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃資助項(xiàng)目（2014-212）。

劉平安，男，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，從事中藥制劑與教學(xué)管理研究。

*張國民，男，教授，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：834095773@qq.com。