陳崢等

摘 要 為考察酸堿條件對枯草芽胞桿菌FJAT-14254代謝物產(chǎn)生的影響，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析枯草芽胞桿菌FJAT-14254菌株的胞內(nèi)成分。結(jié)果表明：通過譜庫掃描得到32種高匹配率代謝物的初步鑒定結(jié)果，主要包括氨基酸類、酸類、烷烴類等，其中含量相對較高的有7種；枯草芽胞桿菌FJAT-14254代謝物的種類和含量與其培養(yǎng)環(huán)境的酸堿度變化呈一定的相關(guān)性，強酸性（pH=3）條件下培養(yǎng)的胞內(nèi)代謝物具有特異性，而接近中性（pH=5、7）條件及堿性（pH=9、11）條件下培養(yǎng)胞內(nèi)代謝物則相似。由此推斷，不同pH條件影響發(fā)酵終點的pH，進而影響枯草芽胞桿菌FJAT-14254代謝物的產(chǎn)生。

關(guān)鍵詞 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用 ；枯草芽胞桿菌 ；pH ；代謝物

分類號 S646

枯草芽胞桿菌是革蘭氏陽性菌，在營養(yǎng)匱乏環(huán)境下，能產(chǎn)生具有強抗逆性的芽胞[1]?？莶菅堪麠U菌在工業(yè)、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有重要的應(yīng)用。在工業(yè)中，枯草芽胞桿菌作為飼料添加劑得到一定程度的應(yīng)用[2]。在農(nóng)業(yè)中，枯草芽胞桿菌能分泌特異的殺蟲蛋白，對防治農(nóng)業(yè)病蟲害具有積極的意義[3]；某些芽胞桿菌胞外代謝物還具有抑制很多植物病原微生物生長的能力，增強植物的免疫能力[4]，促進植物增產(chǎn)等。而這些應(yīng)用與枯草芽胞桿菌的抗逆能力有關(guān)。芽孢作為休眠體對各種逆境具有很強的抵抗能力，如具有耐高溫、耐擠壓、耐氧化、耐酸堿等特點[5]，對枯草芽胞桿菌渡過惡劣環(huán)境具有重要意義。

枯草芽胞桿菌能產(chǎn)生多種功能物質(zhì)，如表面活性素[6]、芬薺素（fengycin）[7]、抗生素[8]等。表面活性素具有潛在的工業(yè)應(yīng)用價值，如提高石油開采率、植物病害控制等。抗生素在人類防止各種動植物真菌性病原菌中發(fā)揮重要作用，如芬薺素類抗生素對多種植物病原真菌具有較強的拮抗作用。

pH條件對枯草芽胞桿菌的應(yīng)用具有很大的影響。林寶英等[9]對枯草芽胞桿菌B25的抗菌物質(zhì)在酸性、中性及微堿性條件下相對穩(wěn)定，而在強堿性條件下不穩(wěn)定。孔建等[10]的研究結(jié)果表明，培養(yǎng)液的初始pH值直接影響枯草芽胞桿菌B-903菌株的生長繁殖和抗菌物質(zhì)的產(chǎn)生與積累。蔡全信等[11]研究不同液體培養(yǎng)基起始pH值對球形芽胞桿菌C3-41的毒力影響，證明了pH 7下培養(yǎng)的發(fā)酵液毒力最強。因此，不同pH條件影響了枯草芽胞桿菌代謝物的產(chǎn)生和含量。

本研究選用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）對枯草芽胞桿菌FJAT-14254菌株胞內(nèi)物質(zhì)進行初步鑒定，通過比較不同初始pH的芽胞桿菌發(fā)酵液中的代謝物差異，探討酸堿條件對該菌發(fā)酵液代謝物產(chǎn)生的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：枯草芽胞桿菌枯草亞種（Bacillus subtilis subsp.subtilis FJAT-14254），由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所提供。菌株種子培養(yǎng)基：胰酶大豆肉湯（TSB）培養(yǎng)基。菌株發(fā)酵培養(yǎng)基：TSB培養(yǎng)基。實驗試劑：TSB培養(yǎng)基（美國BD公司），BSTFA（美國SUPELCO公司），氯仿（AR，衡陽市凱信化工試劑有限公司），甲醇（AR，衡陽市凱信化工試劑有限公司），去離子水。實驗儀器：Agilent7890/5975C氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國安捷倫公司）；JY92-2D超聲波細胞粉碎機；METTLER TOLEDO電子天平AL104（梅特勒·托利多儀器有限公司）；智城恒溫培養(yǎng)震蕩器ZHWY-2102C（上海智城分析儀器有限公司）；Sartorius pH計PB-10（德國賽托利斯公司）。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵液的制備

用TSB培養(yǎng)基平板將枯草芽胞桿菌FJAT-14254菌株劃線活化并培養(yǎng)24 h。取活化的菌株接入20 mL TSB種子培養(yǎng)基中，以30℃、170 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，成為種子液。取該種子液以1%接種量接入預(yù)先裝入50 mL的TSB液體培養(yǎng)基中，液體培養(yǎng)基設(shè)置不同的酸堿梯度，pH=3、5、7、9、11。繼續(xù)以30℃、170 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，成為枯草芽胞桿菌FJAT-14254發(fā)酵液。用pH計測定發(fā)酵后發(fā)酵液的pH值。

1.2.2 樣品制備

取不同初始pH的枯草芽胞桿菌FJAT-14254發(fā)酵液置于10 mL離心管中，6 000 r/min離心10 min，倒掉上清得菌體沉淀；向離心管中加入2 mL、4℃預(yù)冷的去離子水和等體積的-20℃預(yù)冷的甲醇液，用漩渦震蕩儀重新懸浮菌體；然后用超聲波細胞粉碎機進行菌體細胞粉碎，向破碎后的菌液中加入2 mL、-20℃預(yù)冷的氯仿液，充分震蕩混勻；在6 000 r/min條件下離心10 min，取上層甲醇水相2 mL及下層氯仿相1 mL至新的10 mL離心管中，4℃保存；取甲醇水相400 μL、氯仿相200 μL至EP管中，用氮吹儀溫和的吹干；向裝有樣品的EP管中加入甲氧胺吡啶80 μL，37℃反應(yīng)90 min；之后加入80 μL的BSTFA，混勻，70℃反應(yīng)60 min；最后置于4℃冰箱中保存，等待進樣。

1.2.3 色譜條件

采用HP5-MS色譜柱，進樣口溫度為250℃，壓力為4.534 kPa，總流量為54 mL/min，隔墊吹掃流量為3 mL/min，不分流進樣。升溫程序為：70℃保持2 min，以10℃/min上升到140℃，保持2 min；以4℃/min上升到240℃，保持2 min；以10℃/min上升到280℃，保持8 min。

1.2.4 質(zhì)譜條件

采集模式：全掃描、EMV模式、相對值。全掃描參數(shù)：開始時的質(zhì)量數(shù)為50.0 amu，結(jié)束時的質(zhì)量數(shù)為550.00 amu；MS溫度：離子源為230℃，MS四級桿為150℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽胞桿菌FJAT-14254在發(fā)酵前后發(fā)酵液pH的變化

研究結(jié)果表明，初始pH對枯草芽胞桿菌FJAT-14254發(fā)酵終點pH的影響包括3種類型，類型Ⅰ：發(fā)酵初始pH為酸性，而發(fā)酵終點仍保持為酸性，如初始pH為3.00和5.00，其終點pH為3.25和6.43，保持為酸性；類型Ⅱ：發(fā)酵初始pH為中性，而發(fā)酵終點為弱堿性，如初始pH為7.00，終點pH變?yōu)?.51，呈弱堿性；類型Ⅲ：發(fā)酵初始pH為堿性，而發(fā)酵終點保持為堿性，如初始pH為9.00和11.00，終點pH為7.83和8.21，保持為堿性。

2.2 不同初始pH條件下枯草芽胞桿菌FJAT-14254高匹配胞內(nèi)代謝物的分析

不同初始pH條件下枯草芽胞桿菌FJAT-14254高匹配代謝物（匹配度在80以下的代謝物不做報道）的情況見表1。在32種高匹配代謝物中，包含烷烴類16種，氨基酸5種，酸類6種，其他成分5種。

2.3 枯草芽胞桿菌FJAT-14254高含量胞內(nèi)代謝物在不同初始pH條件下的變化規(guī)律

由表1可知，將相對含量高于1%的成分定義為高含量代謝物?？莶菅堪麠U菌FJAT-14254高含量胞內(nèi)代謝物在不同初始pH條件下的變化規(guī)律見圖1-A～1-G。高含量胞內(nèi)代謝物的變化規(guī)律依據(jù)波動形態(tài)可分為3種類型，（1）前峰型，是指在培養(yǎng)基初始pH3～11的變化過程中，此類代謝物含量最高峰大體居前，在酸性（pH=3、5）較強的條件下達到峰值；這類代謝物包括L-酪氨酸、棕櫚酸、L-賴氨酸、硬脂酸。（2）中峰型，代謝物最高峰的位置大體居中，在中性（pH=7）條件下時此類代謝物達到最高值，低谷與高峰之間有一個適當(dāng)?shù)倪^度。這類代謝物包括十四酸、2-吡咯烷酮羧酸。（3）后峰型，代謝物最高峰的位置大體居后，在堿性（pH=9、11）較強的條件下達到峰值。這類代謝物包括二十七烷烴。

以上各種代謝物在不同pH條件下，其含量呈現(xiàn)一定的變化，甚至消失。由此推斷不同pH條件影響發(fā)酵終點的pH，進而影響枯草芽胞桿菌FJAT-14254代謝物的產(chǎn)生。

2.4 不同初始pH條件對代謝物產(chǎn)生的影響及不同代謝物產(chǎn)生的特性

2.4.1 FJAT-14254發(fā)酵液產(chǎn)生代謝物的聚類分析

對不同初始pH條件下的胞內(nèi)代謝物進行聚類分析，結(jié)果見圖2。當(dāng)相關(guān)系數(shù)為25時，可將不同初始pH下的胞內(nèi)代謝物分為3大類群。類群Ⅰ主要為酸類和氨基酸，包括棕櫚酸、硬脂酸、琥珀酸、十四烷酸、2-吡咯烷酮羧酸、L-賴氨酸、L-丙氨酸、L-異亮氨酸、尿素、肌醇、十九烷、二十八烷、二十一烷、十五烷、單硬脂酸甘油酯；類群Ⅱ主要為烷烴類，包括二十四烷、二十七烷、十二烷、二十五烷、二十二烷、乙胺、正十四烷、十七烷、萘、亞硫酸；類群Ⅲ主要為烷烴類和氨基酸，包括丁烷、十三烷、十六烷、二十烷、L-色氨酸、L-酪氨酸。

2.4.2 枯草芽胞桿菌FJAT-14254不同代謝物產(chǎn)生的初始pH條件的聚類分析

對不同初始pH條件下的胞內(nèi)代謝物進行聚類分析，結(jié)果見圖3。當(dāng)相關(guān)系數(shù)為25時，可將不同初始pH下的胞內(nèi)代謝物分為3大類群。類群Ⅰ包括初始pH為3的代謝物，其特點為：發(fā)酵終點pH為3.25，呈較強酸性，且含有L-色氨酸、丁烷、十三烷、二十烷，而其他類群中沒有。類群Ⅱ包括初始pH為5、7的代謝物，其特點為：發(fā)酵終點pH值為6.45～7.51，呈弱酸性到弱堿性之間，只在該類群中出現(xiàn)的代謝物有L-賴氨酸、十九烷、二十八烷、2-吡咯烷酮羧酸、琥珀酸、十四酸、尿素、肌醇。類群Ⅲ為初始pH為9、11的代謝物，其特點為：發(fā)酵終點pH值為7.83～8.21，且含有正十四烷、二十二烷、亞硫酸、乙胺，而其他類群中沒有。綜上所述，初步推斷酸堿度相近的發(fā)酵液中成分相對接近，而發(fā)酵液的pH在一定程度上影響了其代謝物的種類和含量。

2.5 不同初始pH條件下枯草芽胞桿菌FJAT-14254代謝物的主成分分析

以各樣品代謝標(biāo)志物及相對豐度為指標(biāo)，構(gòu)建數(shù)據(jù)矩陣，并進行主成分分析。以不同的初始pH為變量，進行主成分分析，結(jié)果見圖4。結(jié)果表明，初始pH值為5和7的樣品聚為一類；初始pH值為9和11的樣品聚為一類；而pH為3的樣品單獨聚為一類。說明初始pH3的樣品中代謝物種類或含量與其他樣品差別較大，僅在pH 3樣品中被檢測到的代謝物有L-色氨酸、丁烷、十三烷、二十烷。

3 討論與結(jié)論

從枯草芽胞桿菌FJAT-14254胞內(nèi)代謝物中分離到高匹配率物質(zhì)32種，包括氨基酸、烷烴類、有機酸等，這些物質(zhì)在微生物生命活動中扮演著重要作用，以下對這幾類物質(zhì)的活性分別進行闡述。（1）氨基酸類：色氨酸在醫(yī)藥、食品和飼料添加劑方面具有廣泛的用途，鄭蕾等[12]研究了谷氨酸棒狀桿菌發(fā)酵色氨酸的工藝；丙氨酸是血液中氮的有效運輸工具，還是一種重要的生糖氨基酸；異亮氨酸作為一種重要的氨基酸，白郁山等[13]研究了異亮氨酸在微生物抗酸逆境中的作用；酪氨酸作為一種重要的合成前體，其生物合成得到深入研究[14]；趙凱等[15]通過對賴氨酸合成菌株篩選得到高產(chǎn)菌株，對賴氨酸的應(yīng)用具有促進意義。（2）有機酸類：棕櫚酸和硬脂酸是生物界常見的有機酸類，一般在工業(yè)中用于物質(zhì)的合成。亞硫酸因其還原性而具有一些特殊的生物活性[16]。丁二酸不僅是TCA循環(huán)中的重要物質(zhì)，還是很多工業(yè)合成的原料。（3）其他物質(zhì)：尿素在生物體氮代謝中扮演著重要作用，是生物體內(nèi)具有重要生理作用的一類化合物。對這些高匹配物質(zhì)的深入分析對于分析代謝物與芽胞桿菌抗逆之間關(guān)系具有積極意義。

枯草芽胞桿菌FJAT-14254的代謝物種類和含量與其培養(yǎng)環(huán)境的酸堿度變化呈一定的相關(guān)性。分析該菌胞內(nèi)代謝物的聚類結(jié)果，發(fā)現(xiàn)較強酸性（pH=3）條件下培養(yǎng)的胞內(nèi)代謝物具有特異性；而接近中性（pH=5、7）條件下培養(yǎng)胞內(nèi)代謝物則相似，堿性（pH=9、11）條件下培養(yǎng)的胞內(nèi)代謝物相似。芽胞桿菌代謝物與生長環(huán)境之間存在明顯的相關(guān)性，當(dāng)生長環(huán)境發(fā)生改變后，枯草芽胞桿菌FJAT-14254會及時對代謝物做出相應(yīng)調(diào)整，以適應(yīng)環(huán)境的變化?？莶菅堪麠U菌FJAT-14254發(fā)酵終點pH朝著中性或弱堿性（pH=7.5）靠近。這是生物體與環(huán)境之間相互作用的結(jié)果，是生物體對不斷變化的復(fù)雜環(huán)境的適應(yīng)。初步判斷，枯草芽胞桿菌FJAT-14254代謝物質(zhì)隨培養(yǎng)酸堿度的變化而做出復(fù)雜的變化，并不只是單純的線性關(guān)系。

在枯草芽胞桿菌FJAT-14254的高含量代謝物中，二十七烷在pH 11時含量最高，酪氨酸在pH 3時含量最高。二十七烷對于菌株應(yīng)對堿性環(huán)境可能具有作用，酪氨酸除作為蛋白合成必需氨基酸外，在菌株適應(yīng)酸性環(huán)境中也可能發(fā)揮作用。在中性和弱酸性條件下FJAT具有更多的物質(zhì)種類和更高的物質(zhì)含量，初步推測在中性和弱酸性環(huán)境中菌株具有較高的代謝活力，激活代謝通路多具有更復(fù)雜的代謝網(wǎng)絡(luò)。

此外，發(fā)酵液中與質(zhì)譜譜庫無匹配或者匹配率較低的成分有很多，說明該微生物主要的次生代謝成分有待深入研究。隨著未知成分的深入研究，將有助于進一步揭示枯草芽胞桿菌FJAT-14254的抗逆機制。

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