李 艾

(唐山學院 環(huán)境與化學工程系，河北 唐山 063000)

耐高溫酒精酵母的篩選及26SrDNA序列鑒定

李 艾

(唐山學院 環(huán)境與化學工程系，河北 唐山 063000)

將從不同地點采集到的樣品分離后得到127株酵母菌，再經(jīng)過四級篩選得到1株耐高溫酒精酵母，將其命名為A27，利用26SrDNA的D1/D2區(qū)域序列分析法對其進行分子鑒定，結果顯示與報道的釀酒酵母26SrDNA同源性為99%，由此在分子水平上驗證了A27菌株為酵母屬的釀酒酵母。

高溫；酒精酵母菌；分離篩選；鑒定

隨著社會的發(fā)展，人們的環(huán)保意識和能源危機意識逐步增強，用燃料酒精替代汽油逐漸受到重視，發(fā)酵生產(chǎn)燃料酒精也日益受到關注[1]。但是，燃料酒精生產(chǎn)行業(yè)在我國存在耗能大、發(fā)酵生產(chǎn)強度低等問題，導致生產(chǎn)成本過高。若能通過選育耐高溫酒精酵母菌株，利用其發(fā)酵生產(chǎn)酒精，實現(xiàn)濃醪酒精發(fā)酵，則發(fā)酵強度將會大大提高，能耗隨之降低，污染也會減少，綜合經(jīng)濟效益增加[2-4]。

菌株的初篩工作以量為主，質量結合，既要求有大的處理量，又要求有一定的準確性，準確性越高越可以節(jié)省以后的復篩工作量。多數(shù)情況下，酵母菌和細菌或霉菌混合在一起，因此，必須用富集培養(yǎng)法收集酵母菌，并且抑制細菌和霉菌的生長。通常在培養(yǎng)基中加入一些氯霉素或者青霉素抑制細菌，加入適量去氧膽酸鈉[5]或者孟加拉紅抑制真菌，這樣則可從發(fā)酵基質中直接分離酒精酵母，這是一種簡便易行且成本低的育種方法。馬立安從高溫玉米醪酒精發(fā)酵液中取樣，通過富集培養(yǎng)，高溫馴化與篩選，得到2株優(yōu)良菌株，發(fā)酵率分別為73.6%和74.2%[6]。曹俊峰從甜高粱汁中分離到1株高產(chǎn)酒精酵母菌株，適用于甜高粱汁酒精發(fā)酵，酒精產(chǎn)量最高達12.8%(v/v)。由于高溫可增加酒精對酵母的毒性，所以選擇耐高溫酵母菌來提高酵母的酒精耐性[7]。

觀察形態(tài)和生理特征是酵母菌的常規(guī)鑒定方法。但是酵母菌主要的存在形式為單細胞，對其形態(tài)特征的觀察有限，主要以生理學特征對酵母菌進行種級水平上的分類。然而，生理學特征表現(xiàn)的都是表型性狀，不能夠反映種屬間的親緣關系。隨著DNA序列分析技術的日益成熟和簡易化，分析酵母菌的rDNA及其ITS序列愈來愈多地應用于酵母菌的分子系統(tǒng)學和分子分類學的研究中。

酵母菌的鑒定目前國際上通常用26SrDNA的D1/D2區(qū)域進行序列分析。趙麗麗等人利用26SrDNA的D1/D2區(qū)域序列分析法，對從葡萄、蘋果、梨、棗、黃豆醬、酸菜、荔枝、橙子、干酵母、自發(fā)粉中分離得到的l8株酵母進行鑒定，并與基因庫中基因序列進行了同源性比較[8]。白逢彥、陸惠中等人從陜西秦嶺地區(qū)的葉和果實等不同基物上分離得到子囊菌酵母262株，并利用26SrDNA的D1/D2區(qū)域序列分析法同時結合形態(tài)學特征對這些菌株進行了分類學研究[9]。白逢彥、賈建華等人對根據(jù)常規(guī)形態(tài)和生理生化性狀難以確定分類學地位的8株假絲酵母菌，進行了以大亞基26SrDNA中D1/D2區(qū)域堿基序列分析為依據(jù)的分子分類學研究，確定了各個菌株的歸屬[10]。楊艷艷等人通過26SrDNA的D1/D2區(qū)域基因序列分析鑒定了1株分離于堿性工業(yè)污水池的耐堿酵母[11]。

因此，本文擬對從不同地點采集到的樣品進行酵母的分離、篩選，并利用26SrDNA的D1/D2區(qū)域序列分析法對最終得到的酵母進行分子鑒定，由此來實現(xiàn)耐高溫酒精酵母的選育研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：含酒精(10%)麥芽汁(10°Brix)；一級篩選培養(yǎng)基：YPD固體培養(yǎng)基；二級篩選培養(yǎng)基：TTC上層培養(yǎng)基、TTC下層培養(yǎng)基(YPD固體培養(yǎng)基)；三級篩選培養(yǎng)基：麥芽汁培養(yǎng)基添加杜氏小管；四級篩選培養(yǎng)基：麥芽汁培養(yǎng)基。

1.1.2 生化試劑

山梨醇、醋酸鉀、鹽酸、無水異丙醇、Na2EDTA、Tris、SDS、RNaseA、消解酶100T、Taq DNA聚合酶(上海生工)、Agarose Gel DNA Purification Kit Ver2.0回收試盒、DNA Marker(大連寶生物TaKaRa公司)、DNA測序(上海生工完成)、PCR引物(上海生工合成)。

1.1.3 實驗儀器

Whatman T Gradient基因擴增儀(PCR儀)、DXY-33A型電泳儀、UVIpro凝膠成像系統(tǒng)。

1.2 實驗方法

1.2.1 酵母菌的分離

將樣品加入到麥芽汁中增菌2 h，再分別加入到富集培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)24～72 h，鏡檢觀察是否有活菌存在，若有，則取1 mL接入一級篩選培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)24～72 h，選擇具有典型酵母菌菌落特征的單菌落。

1.2.2 酵母菌篩選

(1)酵母菌一級篩選

在YPD液體培養(yǎng)基中依次接入分離得到的各菌株，45 ℃培養(yǎng)24 h，觀察其生長情況，篩選出在高溫條件下能快速生長的菌株。

(2)酵母菌二級篩選

TTC法：TTC(2，3，5-氯化苯基四氮唑)是一種常用的顯色劑，它通過發(fā)生呈色反應反映出酵母的代謝產(chǎn)物，可以通過它判斷酵母中呼吸酶活力的大小，即酵母產(chǎn)酒精能力的高低[12]。在TTC下層培養(yǎng)基的平板中接入經(jīng)過一級篩選得到的各菌株，36 ℃培養(yǎng)48 h，當菌落長出后再倒上TTC上層培養(yǎng)基，在陰暗處保溫2～3 h。對各菌株產(chǎn)酒精能力進行比較。初篩出性狀優(yōu)良的酵母菌株。

(3)酵母菌三級篩選

在帶有杜氏小管的麥芽汁液體試管中分別接入二級篩選出的酵母菌，不同溫度下培養(yǎng)，分別觀察杜氏小管中在12 h，24 h和48 h產(chǎn)氣情況。

(4)酵母菌四級篩選

麥芽汁發(fā)酵法：將三級篩選出的菌株活化，在40 ℃條件下麥芽汁發(fā)酵，記錄每日失重情況，待發(fā)酵結束時計算總失重。復篩得到性狀最為優(yōu)良的菌株。

1.2.3 酵母菌分子生物學鑒定

酵母總DNA提?。簠⒄铡斗肿涌寺嶒炛改稀?第三版)[13]提取總DNA。

引物設計：參照Kurtzman和Robnett[14]的方法，用引物NL1(5′-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3′)和NL4(5′-GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-3′)通過PCR儀擴增供試菌株26SrDNA近5′端的D1/D2區(qū)域。

PCR擴增條件：36循環(huán)，94 ℃，1 min；53 ℃，1 min；72 ℃，1 min 20 s；72 ℃，5 min。PCR產(chǎn)物4 ℃保存，將2%瓊脂糖凝膠(含EB0.5 μg/mL)于3 V/cm電壓下電泳，記錄凝膠成像結果。

產(chǎn)物鑒定：對PCR擴增產(chǎn)物進行膠回收，由上海生工測序，測序結果輸入Genebank中比對同源性。

2 結果與分析

2.1 酵母菌分離結果

來自不同地區(qū)不同地點的20份采集樣品，共分離得到127株酵母菌，結果見表1。

從分離到的酵母菌數(shù)量可看出，果園土壤和腐敗水果中分離得到的數(shù)量較多。這是因為土壤中微生物資源豐富，腐敗水果的環(huán)境適宜酵母的生長，但因其周圍環(huán)境溫度偏低，所以分離到的能耐高溫的菌株可能較少。米曲霉、黑曲霉發(fā)酵基質，米酒、黃酒發(fā)酵醪和白酒廠高溫大曲、酒糟中菌相復雜，含有的微生物種類較多，分離到的酵母菌株較少，但因發(fā)酵過程中環(huán)境溫度偏高，所以有可能分離到能耐高溫的菌株。

2.2 酵母菌的篩選結果

2.2.1 一級篩選結果

將127株酵母分別制成菌懸液，在45 ℃下培養(yǎng)24 h，篩選出35株生長較快的菌株，作為二級篩選的出發(fā)菌株。

2.2.2 二級篩選結果

將一級篩選得到的35株酵母分別制成菌懸液，用接種針接種到TTC下層平板上，每個平板接酵母4-8株，待36℃培養(yǎng)48 h菌落長出后，倒入10 mL上層培養(yǎng)基，將菌落覆蓋，避光保溫2～3 h之后，比較各菌株間顏色的深淺。菌株顏色深表明呼吸酶活力強，具有較強的產(chǎn)酒精能力。記下每一平板中顏色較深的菌株1-2株，共得到18株酵母菌作為三級篩選的出發(fā)菌株。

表1 酵母菌分離結果

2.2.3 三級篩選結果

將二級篩選得到的18株性狀較好的菌株進行三級篩選。將酵母菌接入麥芽汁中，分別在36 ℃，38 ℃，40 ℃，42 ℃，44 ℃下培養(yǎng)，并且在12 h，24 h和48 h觀察杜氏小管中產(chǎn)氣情況，實驗重復3次，其產(chǎn)氣結果見表2。

表2 酵母菌三級篩選的產(chǎn)氣結果

2712+++++++--24++++++++++++48+++++++++++++7812+----24+++---48++++++--8912+++---24+++++---48+++++++--9712++++--24++++++++-48++++++++++-11512+++---24++++++++-48+++++++++-9912+++---24+++++---48+++++++--10512+++++--24+++++++++-48++++++++++-10212+++++--24+++++++++48+++++++++++++4212++----24++++---48++++---

注：根據(jù)杜氏小管中產(chǎn)氣多少分為5個等級：“++++”表示杜氏小管中充滿氣體；“+++”表示杜氏小管中充滿3/4氣體；“++”表示杜氏小管中充滿1/2氣體；“+”表示杜氏小管中充滿1/4氣體；“-”表示杜氏小管中沒有氣體。

其中編號為7，13，27，29，59，71，86，97，102，105，115的菌株在42 ℃的高溫條件下產(chǎn)氣較多，可以作為四級篩選的出發(fā)菌株。從菌株來源分析，7，13，27來自白酒廠的高溫大曲、酒糟；105，115來自酒精廠、啤酒廠發(fā)酵醪；29，71，102來自米酒、黃酒發(fā)酵醪；97，59來自米曲霉、黑曲霉發(fā)酵基質；86來自蘋果園和葡萄園的土壤。菌株中的90%來自酒曲，自然環(huán)境的占到總數(shù)的10%。說明從自然環(huán)境中不宜篩選到耐高溫酵母，這可能與自然環(huán)境溫度偏低有關。而高溫大曲、酒糟由于發(fā)酵過程中溫度高，同時周圍環(huán)境溫度也偏高，所以從中分離耐高溫酵母菌株的可能性更大。

2.2.4 四級篩選結果

將三級篩選得到的11株酵母菌活化后接入200 mL麥芽汁進行發(fā)酵實驗，使活菌濃度達到1×107個/mL，40 ℃培養(yǎng)72 h。結果見表3。

表3 四級篩選的發(fā)酵結果

發(fā)酵結果顯示，27號酵母的酒精體積分數(shù)比較高，達到6.1%(v/v)，殘?zhí)禽^低，僅殘留0.451%，且發(fā)酵力72 h失重為14.58 g。綜合考慮，最終發(fā)酵用菌株采用27號菌株，編號為A27。

2.3 分子鑒定實驗

2.3.1 26SrDNA的D1/D2區(qū)域擴增

利用NL1和NL4一對引物對A27酵母26SrDNA近5′端的D1/D2區(qū)域進行PCR擴增，得到約600 bp的目的片段，片斷大小與已報道的片斷大小(500～600 bp)相符，結果見圖1。

圖1 擴增26SrDNA的D1/D2區(qū)域電泳圖

2.3.2 測序結果與同源性比對

將擴增出的PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA純化試劑盒純化，由上海生工測序，將測序結果在Genebank的BLAST上進行比對。結果顯示，該序列與報道的釀酒酵母26SrDNA近5′端的D1/D2區(qū)域的同源性達到99%，因此在分子水平上進一步驗證了A27菌株為酵母屬的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

3 結論

(1)本實驗是在含有合適酒精濃度的培養(yǎng)基中培養(yǎng)酵母細胞，待酵母菌長出后，再在高溫的條件下培養(yǎng)，通過三級篩選得到在高溫下生長快速且良好的菌株，此過程中酒精起到了抑制或減緩霉菌和細菌生長的作用，使酵母菌呈現(xiàn)優(yōu)勢生長。說明利用一定濃度的酒精既可分離得到酵母又可以篩選出耐高溫的酵母，并且初篩工作量大幅度減輕，能夠滿足篩選要求。

(2)從不同的環(huán)境中都可以分離得到酵母菌，普通酵母隨處可得，但極端酵母則只生活在特殊的環(huán)境中。高溫大曲的溫度可高達60 ℃，為篩選到耐高溫菌株提供了條件。因此，本實驗最終從高溫大曲中選育出的酒精酵母A27，具有一定的耐高溫能力，在54 ℃的高溫下仍可生長。

(3)利用PCR技術擴增A27菌株26SrDNA近5′端的D1/D2區(qū)域，將測序結果進行BLAST比對，結果表明，該序列與Genbank報道的釀酒酵母26SrDNA近5′端的D1/D2區(qū)域有99%的同源性，因此鑒定A27菌株為釀酒酵母。該鑒定方法快速準確，重復性好，在酵母分類學上具有重要的應用價值。

[1] 黃宇彤，杜連祥，趙繼湘.世界燃料酒精生產(chǎn)形勢[J].釀酒，2001，28(5)：24-26.

[2] Peberdy J. Use of the spheroplast fusion technique on ethanol tolerance yeasts[J]. Enzyme Microb Technol，1980(2)：23-29.

[3] 李磊，劉來亭，秦永林.美國DDGS在飼料中的應用[J].飼料研究，2006(11)：59-61.

[4] 董永勝，張德中，王立言，等.固態(tài)發(fā)酵耐高溫酒精酵母的選育及生產(chǎn)應用[J].釀酒，2005，32(5)：30-33.

[5] 陳葉福，王正祥，王晨霞，等.耐高溫酵母菌株的分離鑒定及其酒精發(fā)酵初步研究[J].微生物學報，2003，30(5)：24-27.

[6] 馬立安.耐高溫酒精酵母馴化與篩選[J].湖北農(nóng)學院學報，2000，20(1)：73-74.

[7] 曹俊峰，姚培鑫，馬小魁.發(fā)酵甜高粱汁耐高濃度酒精酵母菌的選育[J].西北植物學報，2001，21(5)：1009-1012.

[8] 趙麗麗，陳存社，郭鳳蓮.26SrDNA序列分析法鑒定酵母菌[J].中國釀造，2008(15)：49-51.

[9] 白逢彥，陸惠中，王啟明，等.秦嶺地區(qū)子囊菌酵母物種多樣性研究[J].菌物學報，2004，23(2)：183-187.

[10] 白逢彥，賈建華，梁慧燕.假絲酵母屬疑難菌株大亞基rDNA D1/D2區(qū)域序列分析及其分類學意義[J].菌物系統(tǒng)，2002，21(1)：27-32.

[11] 楊艷艷，易霞，木合塔爾·阿不都克力木，等.一株分離于工業(yè)污水池的耐堿酵母[J].生物技術，2006，16(4)：25-27.

[12] 王梅，張澎湃，帥桂蘭，等.TTC在黃酒酵母選育中的應用[J].釀酒，2001，28(5)：62-64.

[13] 薩姆布魯克J，拉塞爾D W.分子克隆實驗指南[M].3版.北京：科學出版社，2002.

[14] Kurtzman C P，Robnett C J. Identification of clinically important ascomycetous yeasts based on nucleotide divergence in 5′ end of the large-subunit (26S) ribosomal DNA gene[J]. J Clin Microbiol，1997，35(5)：1216-1223.

(責任編校：李秀榮)

Isolation of High Temperature Resistant Alcohol Yeast and Its Identification of 26SrDNA Sequence

LI Ai

(Department of Environmental and Chemical Engineering， Tangshan College， Tangshan 063000， China)

The author of this paper separated the samples collected from different locations， got 127 yeast strains， then obtained 1 high-temperature alcohol yeast strain after 4 screenings， which was named A27， and finally made a molecular identification of it by using 26 srdna D1/D2 area sequence analysis method. The results reveal that it has 99% homology of Saccharomyces cerevisiae 26SrDNA， thus proving that the strain A27 is saccharomyces cerevisiae at the molecular level.

high temperature； alcohol yeast； screening； identification

Q935

A

1672-349X(2015)03-0076-04

10.16160/j.cnki.tsxyxb.2015.03.025