楊永長，肖代雯，喻 華，姜 偉，陳 亮，胡洪華，周 薇，黃文芳(四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院檢驗科，四川 成都 610072)

攜帶psm-mec基因耐甲氧西林表皮葡萄球菌的耐藥譜研究

楊永長，肖代雯，喻 華，姜 偉，陳 亮，胡洪華，周 薇，黃文芳
(四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院檢驗科，四川 成都 610072)

目的 比較攜帶與未攜帶psm-mec基因耐甲氧西林表皮葡萄球菌(MRSE)的耐藥譜，為治療MRSE引起的感染提供理論依據(jù)。方法 收集臨床分離并經(jīng)過全自動微生物奠定系統(tǒng)準確鑒定的表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis，S.epidermidis)165株，通過PCR擴增esp和mecA基因，準確鑒定和區(qū)分甲氧西林敏感表皮葡萄球菌(MSSE)和MRSE。擴增psm-mec，fudoh和p221片段確認攜帶psm-mec基因的MRSE菌株，比較分析攜帶與未攜帶psm-mec 基因MRSE的耐藥譜。結(jié)果 83.64%的臨床分離S.epidermidis為MRSE，其中29株攜帶psm-mec基因，攜帶率為17.58%，且僅分布于MRSE中。臨床分離MRSE易對苯唑西林、青霉素、紅霉素、復方新諾明和克林霉素耐藥，未發(fā)現(xiàn)對利奈唑胺、呋喃妥因、普丁/達福、萬古霉素和替加環(huán)素耐藥菌株。攜帶psm-mec基因MRSE對環(huán)丙沙星、慶大霉素、利福平和復方新諾明的耐藥率明顯高于未攜帶psm-mec基因MRSE。結(jié)論 攜帶psm-mec基因MRSE易對苯唑西林、青霉素、紅霉素、克林霉素、環(huán)丙沙星、慶大霉素、利福平和復方新諾明耐藥。

耐甲氧西林表皮葡萄球菌；psm-mec；耐藥譜

表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis，S.epidermidis)是人體皮膚正常菌，可引起慢性感染和導管相關(guān)性感染，難以治愈，已引起醫(yī)學界廣泛關(guān)注[1～6]。甲氧西林耐藥是院內(nèi)感染S.epidermidis的主要特征之一，從全球范圍來看，臨床分離耐甲氧西林表皮葡萄球菌(MRSE)占75%～90%[7]。國外研究發(fā)現(xiàn)，引起院內(nèi)感染的S.epidermidis常對氨基糖苷類和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素、四環(huán)素、氯霉素和克林霉素耐藥，但對新出現(xiàn)的抗生素均敏感[2]。雖然出現(xiàn)了萬古霉素中介菌株，但高水平萬古霉素耐藥菌株的傳播尚未見報道[8]。近年來，研究者發(fā)現(xiàn)SCCmec III型和IV型與抗生素耐藥譜之間存在一定關(guān)系[9]。前期預實驗研究提示，攜帶psm-mec基因MRSE的SCCmec型別主要為以II型和/或III型為主要結(jié)構(gòu)的混合型。我們猜想，攜帶psm-mec基因的MRSE可能表現(xiàn)出特有的抗生素敏感性。因此，本研究收集臨床分離S.epidermidis，采用分子生物學方法區(qū)分和鑒定攜帶psm-mec基因MRSE，通過藥敏結(jié)果分析攜帶psm-mec基因MRSE的耐藥譜，為臨床治療MRSE引起的感染提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 菌株來源 2012年3月至2014年3月四川省人民醫(yī)院住院患者分離的165株S.epidermidis，所有菌株采用全自動微生物鑒定系統(tǒng)鑒定，其中血液分離128株，痰液分離15株，中段尿液分離5株，傷口分泌物分離7株。

1.2 試劑和儀器 細菌DNA提取試劑(廣州達安)；2×Taq Master Mix(北京康為世紀)；100 bp DNA Ladder (北京天根)；血平板(鄭州安圖生物)；瓊脂糖(Biowest)，Tris堿(Novon)；PCR擴增儀PTC-200、凝膠成像儀(Bio-Rad)；生物安全柜、細胞培養(yǎng)箱(Heal Force)；電泳儀(Sanvant)；紫外分光光度計、高速低溫離心機(Eppendorf)；esp、mecA、psm-mec、fudoh和p221片段擴增的引物由上海Invitrogen公司合成。

1.3 細菌培養(yǎng)與基因組DNA提取 接種單個菌落至3 ml LB液體培養(yǎng)基，37 ℃ 220rpm培養(yǎng)過夜。取1 ml菌液，離心收集細菌，棄上清。沉淀加入100 μl DNA提取液，100 ℃ 10 min，10000 rpm離心5 min，上清即為S.epidermidisDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR擴增esp和mecA區(qū)分MRSE和MSSE

采用PCR擴增esp和mecA進一步區(qū)分MRSE和MSSE。esp基因的引物序列為esp F：5'-CCAGGGTAACCAGTAACAGT-3'，esp R：5'-GAGCTAAGGGTAA TCCAAGA-3'，PCR產(chǎn)物長度為244 bp；反應體系：2×Taq Master Mix 10 μl，10 μM上下游引物各1 μl，模板DNA 2 μl，ddH2O 6 μl。反應條件：93 ℃預變性2 min，93 ℃變性30 s，42 ℃退火30s，72 ℃延伸30 s，進行30個循環(huán)，最后72 ℃延伸2mim。mecA基因的引物序列為mecAF：5'-GGGATCATAGCGTCATTA TTC-3'，mecAR：5'-AACGATTGTGACACGATAGCC-3'，PCR產(chǎn)物長度為527bp。反應體系：2×Taq Master Mix 10 μl，10 μM上下游引物各1 μl，模板DNA 2 μl，ddH2O 6 μl。反應條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，44 ℃退火30 s，72 ℃延伸30s，進行30個循環(huán)；最后72 ℃延伸3 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后Bio-Rad凝膠成像儀檢測。

1.5 擴增psm-mec，fudoh和p221基因片段 MRSE psm-mec引物序列為：psm-mec F 5′-CGAAAGCCTGAA TGCAAGTCT-3′，psm-mec R5′-GGATTTCACTGGTGTTATTACAAGC-3′，產(chǎn)物大小為130 bp。反應體系：2×Taq Master Mix 5 μl，上下游引物各0.25 μl，DNA 1.5 μl，ddH2O 3 μl。反應條件：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性30 s，42 ℃退火30 s，72 ℃延伸30s，進行30個循環(huán)，最后72 ℃延伸5mim。fudoh基因位于SCCmec上，序列包含psm-mec全長及其上下游區(qū)域，fudoh基因擴增引物序列F：5′-CAATTCACTTGTCTTAA ACTTTGTAGAAAA AGAAG-3，R：5′-TATTTTATTTTCCATAATTGCCTACCC CATAAG-3′，產(chǎn)物大小為530bp。反應體系：2×Taq Master Mix 10 μl，上下游引物各1 μl，DNA 2 μl，ddH2O 6 μl。反應條件：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性30 s，48 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后Bio-Rad凝膠成像儀檢測。

1.6 抗生素敏感試驗 采用BioMerieux藥敏分析系統(tǒng)進行藥敏實驗，比較攜帶與未攜帶psm-mec MRSE耐藥譜的差異。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。計數(shù)資料比較采用卡方檢驗。P< 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床分離細菌 PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示，165株臨床分離細菌均可擴增出esp基因片段，說明這些菌株均為S.epidermidis，與臨床微生物學鑒定相符。mecA陽性138株，mecA陰性27株。提示MRSE占臨床分離S.epidermidis的83.64%。其中血液、痰液、尿液和傷口分泌物分離MRSE分別占65.45%、6.06%、3.03%和3.03%，提示不同來源分離的S.epidermidis均以MRSE為主(圖1)。

圖1 不同標本來源MRSE和MSSE分布情況

2.2 攜帶psm-mec基因MRSE的篩選和驗證 PCR擴增psm-mec、fudoh基因和p221片段的凝膠電泳結(jié)果如圖2所示，165株臨床分離S.epidermidis中有29株均可擴增出psm-mec、fudoh基因和p221片段，攜帶率為17.58%。進一步分析發(fā)現(xiàn)，所有psm-mec陽性標本均存在MRSE中，而27株MSSE未擴增出psm-mec，提示psm-mec基因僅存在MRSE中。

圖2 psm-mec fudoh、p221 PCR擴增凝膠電泳結(jié)果 1：MSSE菌株；2：攜帶psm-mec 的MRSE菌株；3：攜帶psm-mec 的MRSE菌株；4：100bp DNA Ladder；5：fudoh 陽性菌株；6：p221 陽性菌株；7：psm-mec 陽性菌株

2.3 MRSE的耐藥譜 藥敏試驗結(jié)果顯示，59株MRSE中，未發(fā)現(xiàn)對利奈唑胺、呋喃妥因、普丁/達福、萬古霉素、替加環(huán)素耐藥菌株，苯唑西林(100%)、青霉素(100%)、紅霉素(89.83%)、復方新諾明(72.88%)與克林霉素(71.19%)最易耐藥，而對環(huán)丙沙星、慶大霉素、左氧氟沙星、莫西沙星、四環(huán)素的耐藥率分別為45.76%、35.60%、11.86%、5.08%、27.12%和22.03%。同時發(fā)現(xiàn)15.25%環(huán)丙沙星和54.24%左氧氟沙星中介菌株(圖3)。

2.4 攜帶psm-mec基因MRSE的耐藥譜 29株攜帶psm-mec基因MRSE對環(huán)丙沙星、慶大霉素、利福平和復方新諾明的耐藥率分別為68.97%、58.62%、51.72%和86.21%。30株未攜帶psm-mec 基因MRSE對環(huán)丙沙星、慶大霉素、利福平和復方新諾明的耐藥率分別為23.33%、13.33%、3.33%和60.00%(表1)。攜帶psm-mec基因MRSE對環(huán)丙沙星、慶大霉素、利福平以及復方新諾明的耐藥性明顯高于未攜帶psm-mec 基因MRSE。

圖3 不同菌株藥物敏感性結(jié)果

表1 攜帶與未攜帶psm-mec 基因MRSE的耐藥譜分析

3 討論

定植人體皮膚表面的S.epidermidis是一種重要的院內(nèi)感染條件致病菌，免疫抑制患者中大部分慢性感染和導管相關(guān)感染均由S.epidermidis引起[1]。在美國，22% ICU患者的血流感染和13%人造瓣膜心內(nèi)膜炎歸咎于S.epidermidis。據(jù)估計，每年用于治療S.epidermidis感染的費用大約需要20億美元[2]。我國一項涉及15個城市、17家醫(yī)院的調(diào)查顯示，80%以上臨床分離S.epidermidis為MRSE[3]。近年來，MRSE的檢出率越來越高，已成為全球院內(nèi)感染的重要病原菌[4，5]。

甲氧西林耐藥由可移動遺傳元件SCCmec介導，2009年Queck等[12]在院內(nèi)感染甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌(MRSA)中發(fā)現(xiàn)一種新基因psm-mec，同時攜帶該基因的菌株主要為SCCmec II型與III型。預實驗結(jié)果顯示，該基因也存在院內(nèi)感染MRSE中，且主要以SCCmecII和/或III型結(jié)構(gòu)為主。研究發(fā)現(xiàn)，某些型別的SCCmec具有獨特的抗生素耐藥譜[11]。我們推測攜帶psm-mec基因的MRSE在抗生素敏感性上具有一定的特征。

本研究通過PCR擴增psm-mec、fudoh基因和p221片段證實165株臨床分離S.epidermidis中，攜帶psm-mec基因的菌株為29株，在MRSE中占21%。為了探討攜帶psm-mec基因MRSE的耐藥譜，本文首先分析了臨床分離MRSE的耐藥情況，結(jié)果顯示，除利奈唑胺、萬古霉素和替加環(huán)素等敏感外，其它抗生素均有不同程度耐藥，與國內(nèi)研究結(jié)果一致[13～15]。接下來比較了攜帶和未攜帶psm-mec基因MRSE在抗生素敏感性上的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，攜帶psm-mec基因MRSE易對環(huán)丙沙星、慶大霉素、利福平和復方新諾明耐藥。但其具體的機制仍需進一步研究。

綜上所述，臨床分離攜帶psm-mec基因的MRSE在抗生素敏感性上具有明顯特征，易對苯唑西林、青霉素、紅霉素、克林霉素、環(huán)丙沙星、慶大霉素、利福平和復方新諾明耐藥，本研究為治療MRSE引起的感染提供了理論依據(jù)。

[1] Otto M.Staphylococcus epidermidis--the 'accidental' pathogen [J].Nat Rev Microbiol，2009，7(8)：555-567.

[2] Rogers KL，F(xiàn)ey PD，Rupp ME.Coagulase-negative staphylococcal infections [J].Infect Dis Clin North Am，2009，23(1)：73-98.

[3] Xiao YH，Wang J，Li Y.Bacterial resistance surveillance in China：a report from Mohnarin 2004-2005 [J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis，2008，27(8)：697-708.

[4] Raad I，Hanna H，Maki D.Intravascular catheter-related infections：advances in diagnosis，prevention，and management [J].Lancet Infect Dis，2007，7(10)：645-657.

[5] Xu ZB，Shi L，Alam MJ，et al.Integron-bearing methicillin-resistant coagulase-negative staphylococci in South China，2001-2004[J].FEMS Microbiol Lett，2008，278(2)：223-230.

[6] Otto M.Molecular basis of Staphylococcus epidermidis infections[J].Semin Immunopathol，2012，34(2)：201-214.

[7] 張淵，毛敏，張亞玲，等.血液透析患者股靜脈置管導管感染病原菌及治療效果分析[J].實用醫(yī)院臨床雜志，2012，9(3)：87-88.

[8] 劉祥琴，喻華，喬寧，等.2011年四川省人民醫(yī)院分離致病菌的分布特點和耐藥分析[J].實用醫(yī)院臨床雜志，2012，9(6)：105-109.

[9] Diekema DJ，Pfaller MA，Schmitz FJ，et al.Survey of infections due to Staphylococcus species：frequency of occurrence and antimicrobial susceptibility of isolates collected in the United States，Canada，Latin America，Europe，and the Western Pacific region for the SENTRY Antimicrobial Surveillance Program，1997-1999[J].Clin Infect Dis，2001，32(Suppl 2)：S114-132.

[10]Jones RN.Microbiological features of vancomycin in the 21st century：minimum inhibitory concentration creep，bactericidal/static activity，and applied breakpoints to predict clinical outcomes or detect resistant strains [J].Clin Infect Dis，2006，42(Suppl 1)：S13-24.

[11]Iorio NL，Caboclo RF，Azevedo MB，et al.Characteristics related to antimicrobial resistance and biofilm formation of widespread methicillin-resistant Staphylococcus epidermidis ST2 and ST23 lineages in Rio de Janeiro hospitals，Brazil[J].Diagn Microbiol Infect Dis，2012，72(1)：32-40.

[12]Queck SY，Khan BA，Wang R，et al.Mobile genetic element-encoded cytolysin connects virulence to methicillin resistance in MRSA [J].PLoS Pathog，2009，5(7)：e1000533.

[13]趙艷豐，趙水娣，焦梅，等.2007-2010年表皮葡萄球菌的分布及耐藥性分析[J].檢驗醫(yī)學與臨床，2011，8(22)：2767-2768.

[14]蔣景華，王宗欣.2006～2007年表皮葡萄球菌的科室分布及耐藥性分析[J].中華醫(yī)院感染學雜志，2009，19(18)：2505.

[15]吳銘，田梅，張杰，等.218例表皮葡萄球菌的耐藥性分析[J].中國微生態(tài)學雜志，2011，23(5)：456.

R446.5

A

1672-6170(2015)06-0031-04

2015-09-07；

2015-09-10)