李馨筱

(四川大學(xué)華西醫(yī)院甲狀乳腺外科，四川 成都 610041)

PP4R1抑制甲狀腺癌SW579細(xì)胞增殖的研究

李馨筱

(四川大學(xué)華西醫(yī)院甲狀乳腺外科，四川 成都 610041)

目的 探討甲狀腺癌細(xì)胞株SW579中PP4R1對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響。方法 利用慢病毒完成甲狀腺癌細(xì)胞SW579/pCDH1-Con和SW579/pCDH1-PP4R1的建株，采用Western blot和qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)PP4R1表達(dá)變化；體外用CKK-8法檢測(cè)SW579細(xì)胞增殖的變化；流式細(xì)胞儀檢測(cè)SW579細(xì)胞周期的變化；克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩組克隆形成率的變化。結(jié)果 PP4R1過表達(dá)慢病毒感染甲狀腺癌SW579細(xì)胞系構(gòu)建成功；在體外實(shí)驗(yàn)中，過表達(dá)PP4R1可抑制細(xì)胞增殖，將細(xì)胞周期阻滯于S期，從而抑制甲狀腺腫瘤的生長。結(jié)論 PP4R1在甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，其是否能作為甲狀腺癌新的靶向分子仍有待進(jìn)一步的研究。

PP4R1；甲狀腺癌；增殖

甲狀腺癌占頭頸部癌癥的1/3，是內(nèi)分泌系統(tǒng)中發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤。近年來，甲狀腺癌的發(fā)病率顯著增高，已經(jīng)成為發(fā)病率增長最快的惡性腫瘤之一[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，美國2010年有33930例女性和10740例男性被診斷為甲狀腺癌，其中1690例患者死亡[2]。甲狀腺癌中分化較好的乳頭狀癌占80%，其10年生存率為90%，然而有超過10%的人會(huì)復(fù)發(fā)，且TNM分期III期和IV期的甲狀腺癌仍然有20%～30%的死亡率[3]。晚期或是復(fù)發(fā)的患者，再行治療預(yù)后較差，甚至有部分患者己不能通過手術(shù)治療。深入探討甲狀腺癌發(fā)生與發(fā)展的機(jī)制，尋找治療晚期及復(fù)發(fā)患者的新方法成為目前的迫切需求。PP4R1是絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶4(protein serine/threonine phosphatase 4，PP4)的一個(gè)亞基[4]。PP4全酶由催化亞基PP4C以及調(diào)節(jié)亞基PP4R1和PP4R2、PP4R3組成，是PP2A家族的一個(gè)重要成員，它參與調(diào)節(jié)許多重要的細(xì)胞進(jìn)程，如中心體成熟、DNA修復(fù)、細(xì)胞應(yīng)激以及包括NF-κB、JNK等信號(hào)通路的調(diào)節(jié)[5～7]。PP4R1作為PP4全酶的一部分，并不參與該酶的催化，而是作為另一個(gè)亞基，PP4c亞基的伴侶亞基，起調(diào)節(jié)作用。因此，雖然早在1999年就已發(fā)現(xiàn)了這個(gè)基因，但是并沒有引起學(xué)界的重視。本課題擬通過siRNA技術(shù)上調(diào)甲狀腺癌SW579細(xì)胞中PP4R1表達(dá)，體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞增殖能力變化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人甲狀腺癌細(xì)胞SW579購自于中國科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。PP4R1、β-actin的引物合成于上海生工生物工程有限公司。RNA Trizol購于Invitrogen公司。PrimerScript RT reagent Kit、SYBR Premix EX TagTM試劑購于TAKARA公司。小鼠抗人單克隆抗體PP4R1、β-actin以及羊抗鼠二抗購于Santa Cruz公司。Negative control ShRNA以及特異性過表達(dá)PP4R1的shRNA序列由上海吉?jiǎng)P公司合成。Matrigel膠購于BD公司。

1.2 方法

1.2.1 慢病毒完成甲狀腺癌細(xì)胞SW579/pCDH1-Con和SW579/pCDH1-PP4R1的建株 慢病毒表達(dá)載體與瞬間表達(dá)載體相比，其可以可用于感染依靠傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染試劑難于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞如原代細(xì)胞、懸浮細(xì)胞等，并且在感染后可以整合到受感染細(xì)胞的基因組，進(jìn)行長時(shí)間的穩(wěn)定表達(dá)，是制備穩(wěn)定表達(dá)目的基因細(xì)胞株和進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的有效手段。本項(xiàng)目中擬構(gòu)建對(duì)照重組空病毒pCDH1-Con和重組慢病毒pCDH1-PP4R1，感染SW579甲狀腺癌細(xì)胞，建立甲狀腺癌細(xì)胞SW579/pCDH1-Con和SW579/pCDH1-PP4R1細(xì)胞系。

1.2.2 定量實(shí)時(shí)熒光PCR(qRT-PCR)檢測(cè)PP4R1的mRNA表達(dá) 引物由上海生工生物公司合成。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)收集細(xì)胞，按Trizol試劑說明書提取總RNA，經(jīng)PrimeScript RT reagent Kit合成cDNA。然后使用SYBR Premix EXTaqTM試劑，進(jìn)行熒光PCR定量檢測(cè)。反應(yīng)條件為：預(yù)變性94 ℃ 3 s，變性94 ℃ 5 s，退火60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。Ct值為每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)，空白對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組及陰性對(duì)照組的比較以PP4R1熒光定量結(jié)果的Ct值減去β-actin的Ct值得△Ct，以空白對(duì)照組RNA的△Ct作為矯正數(shù)，計(jì)算2-ΔΔCt值，以2-ΔΔCt值為PP4R1基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡法(western blot)分析 用RIPA和PMSF提取轉(zhuǎn)染48 h的各組培養(yǎng)細(xì)胞總蛋白。BCA法測(cè)定蛋白濃度。經(jīng)12%SDS-PAGE膠電泳后轉(zhuǎn)膜，室溫下5%脫脂牛奶封閉1 h，加一抗4 ℃孵育過夜。次日加二抗37 ℃溫育1 h，ECL發(fā)光液顯色。以β-actin為內(nèi)參。

1.2.4 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 正常和感染了病毒的SW579細(xì)胞分別混懸，按5×103個(gè)/孔接種于96孔板。分別于培養(yǎng)后1、2、3、4、5天為檢測(cè)點(diǎn)。每次檢測(cè)前，在培液中每孔加入10 μl CCK-8試劑，37 ℃溫箱孵育2 h，然后用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處吸光度值。吸光度代表細(xì)胞增殖情況。

1.2.5 克隆形成實(shí)驗(yàn) 將上述穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞消化后以400個(gè)接種至6孔板搖勻培養(yǎng)，每3天換次培養(yǎng)基，培養(yǎng)2～3周，觀察克隆形成，當(dāng)細(xì)胞形成肉眼可見的細(xì)胞時(shí)停止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)基，進(jìn)行吉姆薩染色，染色后進(jìn)行計(jì)算克隆數(shù)。

1.2.6 細(xì)胞周期測(cè)定 把穩(wěn)定表達(dá)pCDH1-PP4R1和pCDH1-Con的甲狀腺癌細(xì)胞株種植在直徑6 cm培養(yǎng)皿上，待細(xì)胞長致70%時(shí)消化收集細(xì)胞，用70%酒精-20 ℃過夜固定，然后用碘化丙啶(Propidium Iodide)(Molecular Probes)和 1 mg/ml核糖核酸酶A 室溫 30分鐘處理。細(xì)胞周期通過FACS Caliber 系統(tǒng)(Becton Dickinson，Bedford，MA)來分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析。P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒制備與高效感染SW579甲狀腺癌細(xì)胞

感染了特異性干擾PP4R1質(zhì)粒的慢病毒后，成功地過表達(dá)了SW579細(xì)胞內(nèi)的PP4R1含量，穩(wěn)定過表達(dá)PP4R1的甲狀腺癌細(xì)胞株SW579的構(gòu)建成功(圖1)。

2.2 過表達(dá)PP4R1基因?qū)谞钕侔┘?xì)胞增殖和細(xì)胞周期影響 通過慢病毒感染甲狀腺癌細(xì)胞SW579來轉(zhuǎn)入PP4R1基因，比較上調(diào)PP4R1對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞增殖、周期的影響。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PP4R1基因上調(diào)后SW579細(xì)胞的增殖減慢，PI染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞周期發(fā)生明顯改變，G2/M期細(xì)胞降低，G0/G1、S期細(xì)胞增加(圖2)。

2.3 過表達(dá)PP4R1基因?qū)谞钕侔┘?xì)胞克隆的影響 過表達(dá)PP4R1基因表達(dá)可以顯著降低SW579細(xì)胞的克隆形成，克隆數(shù)明顯減少(圖3)。

3 討論

隨著分子生物學(xué)和甲狀腺癌研究的不斷深入，相關(guān)基因與甲狀腺癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸也逐漸成為研究執(zhí)點(diǎn)，也取得了一系列的進(jìn)展。目前甲狀腺癌的分子靶點(diǎn)主要涉及到酪氨酸激酶受體RET蛋白和NTRK1蛋白，G蛋白H-RAS、K-RAS和N-RAS，信號(hào)調(diào)節(jié)激酶絲/蘇氨酸特異性激酶B-RAF、磷脂酰肌醇3-激酶PI3K和AKT1等[8]。目前有望成為甲狀腺癌分子靶向治療的藥物主要有小分子酪氨酸激酶抑制劑、表皮生長因子受體(EGFR)抑制劑和血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR)抑制劑等，包括索拉非尼、舒尼替尼、凡德他尼、莫替沙尼、吉非替尼，越來越多的甲狀腺癌分子靶向藥物進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)期，為甲狀腺癌患者帶來福音。

圖1 PP4R1過表達(dá)慢病毒感染甲狀腺癌SW579細(xì)胞系 a：熒光顯微鏡下觀察PP4R1慢病毒和對(duì)照病毒感染的SW579細(xì)胞，病毒感染效率達(dá)90%；b：qPCR分析慢病毒感染后PP4R1 mRNA的表達(dá)；c：免疫印記分析慢病毒感染后PP4R1蛋白的表達(dá)

圖2 轉(zhuǎn)入PP4R1基因前后SW579細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的改變

圖3 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過表達(dá)PP4R1后 SW579細(xì)胞的克隆數(shù)

黃秀清等報(bào)道了PP4能夠通過PP4R1與HDAC3(Histone deacetylase 3，組蛋白去乙酰化酶)產(chǎn)生相互作用，從而調(diào)節(jié)HDAC3 Ser424的去磷酸化，抑制HDAC3的活性，使得腫瘤耐藥細(xì)胞恢復(fù)藥物敏感性[9]。近期，Berchmann等發(fā)現(xiàn)在T淋巴細(xì)胞中，PP4R1作為PP4全酶的一部分，橋接NF-κB激酶抑制劑(IKK)復(fù)合物和磷酸酶PP4c，從而引導(dǎo)PP4c的去磷酸化活性和IKK復(fù)合物的失活，人初級(jí)T淋巴細(xì)胞的活化和增殖可以引發(fā)PP4R1的表達(dá)。PP4R1表達(dá)不足可以引起IKK活性持續(xù)和增強(qiáng)、T細(xì)胞過度活化以及出現(xiàn)異常NF-κB信號(hào)，過表達(dá)PP4R1則NF-κB信號(hào)降低。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)PP4R1在T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株中低表達(dá)，在一株來源于Sézary綜合征患者的淋巴瘤細(xì)胞株中，PP4R1幾乎不表達(dá)，PP4R1橋接了NF-κB激酶抑制劑(IKK)復(fù)合物和磷酸酶PP4c，當(dāng)PP4R1表達(dá)量下降時(shí)，IKK復(fù)合物與PP4c分離，從而激活NF-κB信號(hào)通路[10]。以上相關(guān)研究表明PP4R1很可能是一個(gè)重要的抑癌基因，其剛引起人們的關(guān)注，僅見其在T細(xì)胞淋巴瘤中的報(bào)道，在甲狀腺癌中的功能及其對(duì)甲狀腺癌進(jìn)展的影響尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。

為了證實(shí)PP4R1對(duì)甲狀腺癌發(fā)生與發(fā)展的影響，我們?cè)诒狙芯恐凶C實(shí)，在甲狀腺癌細(xì)胞株SW579中，轉(zhuǎn)入PP4R1基因，細(xì)胞的增殖能力明顯受限，到第5天時(shí)，實(shí)驗(yàn)組約為對(duì)照組細(xì)胞數(shù)目的2/3(P< 0.05)。進(jìn)一步的克隆形成實(shí)驗(yàn)提示，細(xì)胞的生長和增殖能力明顯受到抑制。細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)提示，過表達(dá)PP4R1能夠降低G2/M期的細(xì)胞。我們的研究提示PP4R1有抑制腫瘤形成的功能，這表明PP4R1的缺失在甲狀腺癌的發(fā)生與發(fā)展階段發(fā)揮重要的作用。

PP4R1在甲狀腺癌中的調(diào)節(jié)機(jī)制還不清楚?，F(xiàn)有研究顯示，其功能很可能與HDAC3密切相關(guān)，也有研究報(bào)道了其功能與NF-κB信號(hào)通路相關(guān)。因此，進(jìn)一步研究PP4R1抑制甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制將有利于為甲狀腺癌的防治提供新的思路。

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PP4R1 can suppress the proliferation of SW579 thyroid cancer cells in vitro

LIXin-xiao

(DepartmentofBreastandThyroidSurgery，WestChinaHospitalofSichuanUniversity，Chengdu610041，China)

Objective To investigate the effect of protein serine/threonine phosphatase 4 regulatory subunit 1(PP4R1)on proliferation of SW579 thyroid cancer cells.Methods Thyroid cancer cells SW579/PCDH1-Con and SW579/pCDH1-PP4R1 were built by Centivirus imfection.The expression levels of the enzyme in SW579 cells were examined by using Western blot and qRT-PCR analyses.The changes of the cell proliferation were determined by using a CCK-8 assay.The changes of the cell cycle were detected by using a flow cytometry while a clone formation assay was used to observe the change in the clone formation rate.Results SW579 cell line that was infected with PP4R1 over-expression Lentivirus was successfully constructed.In in vitro experiments，over-expressed PP4R1 could inhibit the proliferation of SW579 cells and arrest the cell cycle at S phase，thus inhibit thyroid tumor growth.Conclusion PP4R1 may play an important role in thyroid cancer development.However，further studies are needed to determine whether it can be used as a novel therapeutic target for treatment of the cancer.

PP4R1；Thyroid cancer；Proliferation

R736.1

A

1672-6170(2015)03-0021-04

2014-10-28；

2015-01-20)