吳 浩，韓紅娟，任小華，梁 琳

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院 a.口腔科，b.藥學(xué)部，四川 成都 610072)

缺氧對(duì)成牙骨質(zhì)細(xì)胞增殖、凋亡及缺氧相關(guān)基因的影響

吳 浩a，韓紅娟a，任小華a，梁 琳b

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院 a.口腔科，b.藥學(xué)部，四川 成都 610072)

目的 探討不同時(shí)間缺氧微環(huán)境對(duì)成牙骨質(zhì)樣細(xì)胞OCCM-30增殖、凋亡及缺氧相關(guān)基因的影響，了解缺氧在正畸導(dǎo)致的牙骨質(zhì)吸收中所起的作用。方法 利用三氣培養(yǎng)箱構(gòu)建細(xì)胞缺氧模型，以常氧條件培養(yǎng)為對(duì)照組，利用MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖率，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，RT-PCR檢測(cè)HIF-1α、VEGF mRNA等相關(guān)基因的表達(dá)變化。結(jié)果 缺氧可以抑制OCCM-30細(xì)胞的增殖，明顯提高細(xì)胞的凋亡率，并能顯著誘導(dǎo)HIF-1α和VEGF mRNA基因的表達(dá)，HIF-1αmRNA的表達(dá)水平在24 h達(dá)到頂峰后進(jìn)入平臺(tái)期；而VEGF mRNA的表達(dá)水平在36 h后開(kāi)始逐步上調(diào)。結(jié)論 缺氧微環(huán)境能抑制OCCM-30細(xì)胞增殖，促進(jìn)調(diào)亡及缺氧相關(guān)基因的表達(dá)。

缺氧；成牙骨質(zhì)樣細(xì)胞；OCCM-30；增殖；HIF-1α

正畸矯治過(guò)程中，施加于牙齒上的矯治力使牙周組織產(chǎn)生相應(yīng)的組織改建，從而使牙齒移動(dòng)。機(jī)械張/壓應(yīng)力和氧分壓的下降是牙周系統(tǒng)在正畸矯治過(guò)程中受到的主要外界刺激，以前的研究大多關(guān)注機(jī)械張/壓應(yīng)力對(duì)其相關(guān)功能的調(diào)節(jié)。相關(guān)研究表明，缺氧微環(huán)境對(duì)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的功能均有很大的影響[1]。正畸能導(dǎo)致牙周血管變化，在牙周形成局部缺氧環(huán)境，正畸牙周改建中也起著同樣重要的作用。本文擬對(duì)缺氧環(huán)境對(duì)成牙骨質(zhì)細(xì)胞增殖、凋亡及缺氧相關(guān)基因的影響作初步的探討，為正畸臨床提供理論基礎(chǔ)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 本實(shí)驗(yàn)所使用的細(xì)胞為美國(guó)華盛頓大學(xué)Somerman教授實(shí)驗(yàn)室提供的成牙骨質(zhì)樣細(xì)胞株OCCM-30。相關(guān)研究表明，OCCM-30細(xì)胞的主要性能完全符合成牙骨質(zhì)細(xì)胞功能特點(diǎn)，是成熟、穩(wěn)定的成牙骨質(zhì)細(xì)胞株體系，能作為研究成牙骨質(zhì)細(xì)胞相關(guān)調(diào)控功能的模型[2]。

1.2 研究方法

1.2.1 細(xì)胞缺氧 采用德國(guó)Binder三氣培養(yǎng)箱，通過(guò)控制N2的輸入量，用傳感器來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)O2濃度的實(shí)時(shí)精確控制。將細(xì)胞按1×105個(gè)/毫升接種于中號(hào)培養(yǎng)瓶(50 ml)內(nèi)，每瓶2 ml，鏡下觀察細(xì)胞大部分貼壁后(約12 h)，將培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移至三氣缺氧箱內(nèi)，當(dāng)氧氣濃度降至預(yù)設(shè)濃度時(shí)(大約1～2小時(shí))，開(kāi)始計(jì)時(shí)。缺氧組條件設(shè)置：2%O2、5%CO2、93%N2；對(duì)照組培養(yǎng)條件：20%O2、5%CO2、75%N2(細(xì)胞正常培養(yǎng)條件)。檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)：0、6、12、24、36、48、72 h。缺氧完成后按檢測(cè)手段分別收集細(xì)胞。

1.2.2 MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖率 按時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×104個(gè)/毫升，于96孔板每孔加入200 μl，一段時(shí)間后每孔加入20 μl MTT溶液，繼續(xù)孵育4小時(shí)后吸棄液體，每孔加入DMSO 200 μl，震蕩15分鐘，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上選擇570 nm波長(zhǎng)，設(shè)立不含任何細(xì)胞的空白對(duì)照孔調(diào)零，測(cè)定每孔的光密度值(OD值)。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集缺氧干預(yù)后的細(xì)胞，75%酒精調(diào)整細(xì)胞密度，在4 ℃環(huán)境下固定24小時(shí)。制作碘化吡啶(PI)溶液：將PI溶于中性PBS中，并調(diào)整終濃度為100 μg/ml，4 ℃冰箱中棕色瓶避光保存。將固定好的細(xì)胞離心5分鐘后棄去液體，PBS重懸5分鐘，400目濾網(wǎng)過(guò)濾1次除雜質(zhì)，4 ℃冰箱中避光30分鐘，流式細(xì)胞儀檢測(cè)并進(jìn)行分析。

1.2.4 RT-PCR檢測(cè)HIF-1α、VEGF mRNA的表達(dá)

引物由寶生物公司代為合成及測(cè)試。HIF-1α 正向引物：5'-TGCTCATCAGTTGCCACTTCC-3'，反向引物：5'-CGCTGTGTGTTTTGTTCTTTACCC-3'。VEGF 正向引物：5'-CGACAGAAGGGGAGCAGAAAG-3'，反向引物：5'-GCAAGTACGTTCGTTTAACTC-3'。GAPDH正向引物：5'-GAGAGGAGAAGAAGCTTTACAC-3'，反向引物：5'-CCAAGCAATTCCAATGAA-3'。逆轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃ 15分鐘，85 ℃ 5秒，逆轉(zhuǎn)錄得到模板cDNA。熒光定量PCR檢測(cè)HIF-1α、VEGF mRNA基因的表達(dá)。PCR反應(yīng)體系總體積20 μl，包括PCR正向、反向引物各0.8 μl，SYBR Premix Ex Taq 10 μl，ROX Reference Dye(50×) 0.4 μl，ddH2O 6 μl，DNA 模板 2 μl。設(shè)置好反應(yīng)條件后，計(jì)算機(jī)系統(tǒng)自動(dòng)控制反應(yīng)并實(shí)時(shí)檢測(cè)，繪制擴(kuò)增曲線并分析。運(yùn)用△Ct 法來(lái)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，具體方法如下：①根據(jù)每個(gè)樣本的各個(gè)基因的Ct值來(lái)計(jì)算其△Ct 值：△Ct = Ct 目的基因-Ct GAPDH；②根據(jù)步驟①計(jì)算所得△Ct 值計(jì)算相對(duì)于對(duì)照組的△△Ct值：△△Ct =△Ct 實(shí)驗(yàn)組-△Ct 對(duì)照組；③計(jì)算2-△△Ct 的數(shù)值，即為實(shí)驗(yàn)組樣本的目的基因相對(duì)于對(duì)照組樣本的目的基因變化的倍數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)分析采用Excel 2003 version軟件進(jìn)行。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SNK法、單因素方差分析法(ANOVA)進(jìn)行相關(guān)比較，P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OCCM-30細(xì)胞缺氧后增殖情況(圖1) MTT分析法結(jié)果顯示，其OD 570 nm值和對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示缺氧可以抑制OCCM-30細(xì)胞的增殖，并且隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)，缺氧抑制OCCM-30細(xì)胞增殖的作用越明顯。

2.2 OCCM-30細(xì)胞后凋亡情況(圖2) 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表明，缺氧可明顯提高OCCM-30細(xì)胞的凋亡率，而且隨缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)，OCCM-30細(xì)胞凋亡率逐漸增加。正常培養(yǎng)的各對(duì)照組中細(xì)胞的凋亡率均為(1.52±0.12)%。

2.3 OCCM-30細(xì)胞中HIF-1α mRNA的表達(dá)變化 隨著缺氧的進(jìn)行，HIF-1α mRNA的表達(dá)逐步上調(diào)，在24小時(shí)達(dá)到頂峰，進(jìn)入平臺(tái)期，從24小時(shí)起至72小時(shí)，HIF-1α mRNA的表達(dá)水平無(wú)明顯差異(P> 0.05)，見(jiàn)圖3。

圖1 OCCM-30細(xì)胞缺氧后增殖情況 與空白對(duì)照組比較：*P < 0.05，**P < 0.01

圖2 OCCM-30細(xì)胞缺氧后凋亡情況 與對(duì)照組比較：*P < 0.05，**P < 0.01

圖3 OCCM-30細(xì)胞缺氧后HIF-1α mRNA的表達(dá)變化 與對(duì)照組比較：*P < 0.05，**P < 0.01

2.4 OCCM-30細(xì)胞中VEGF mRNA的表達(dá)變化

細(xì)胞缺氧后6 h組、12 h組、24 h組VEGF mRNA的表達(dá)水平?jīng)]有顯著變化(P> 0.05)，從36 h組開(kāi)始，表達(dá)水平逐步上調(diào)，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)，見(jiàn)圖4。

3 討論

Steinbrech等[3]研究表明，缺氧能顯著抑制體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞的增殖活性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，缺氧明顯抑制OCCM-30細(xì)胞的增殖，并且具有明顯的時(shí)間依賴性，隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)，這種抑制作用越明顯，與大多數(shù)研究結(jié)果一致。但有研究學(xué)者也認(rèn)為，缺氧既有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，也有抑制效應(yīng)，Piret等[4]則認(rèn)為缺氧的具體效應(yīng)與細(xì)胞的種類、缺氧程度密切相關(guān)。缺氧微環(huán)境對(duì)細(xì)胞增殖的調(diào)控是通過(guò)細(xì)胞分裂周期、細(xì)胞代謝相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，但具體機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。

圖4 OCCM-30細(xì)胞缺氧后VEGF mRNA的表達(dá)變化

本實(shí)驗(yàn)中對(duì)照組細(xì)胞的凋亡率為1.52%，與文獻(xiàn)報(bào)道的體外培養(yǎng)細(xì)胞的正常凋亡率基本一致，反應(yīng)細(xì)胞正常的更替。細(xì)胞缺氧后6 h，凋亡率高于對(duì)照組，但無(wú)明顯差別，在12 h后，細(xì)胞凋亡率逐步上升，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明缺氧能顯著提高OCCM-30細(xì)胞的凋亡率。在正畸矯治過(guò)程中，成牙骨質(zhì)細(xì)胞受到了機(jī)械矯治力和缺氧微環(huán)境的共同作用，細(xì)胞凋亡程序啟動(dòng)，加速了細(xì)胞凋亡，影響到牙骨質(zhì)受損后的修復(fù)。

Akeno等的研究表明[5]，HIF-1α在細(xì)胞缺氧特異性應(yīng)答的過(guò)程中發(fā)揮了調(diào)控作用，被認(rèn)為是缺氧環(huán)境與細(xì)胞功能變化間的橋梁，是細(xì)胞缺氧后一系列變化的啟動(dòng)因子，接受HIF-1α調(diào)控的下游基因在其增強(qiáng)子或者啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)中具備一個(gè)或多個(gè)能與HIF-1α連接位點(diǎn)[6]。本實(shí)驗(yàn)研究顯示，缺氧能顯著誘導(dǎo)HIF-1α mRNA的表達(dá)，在缺氧6小時(shí)后，HIF-1α mRNA的表達(dá)量相比對(duì)照組即有明顯的提高，并隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)逐步上調(diào)，在24小時(shí)達(dá)到頂峰，進(jìn)入平臺(tái)期，從24小時(shí)起至72小時(shí)，HIF-1α的表達(dá)水平無(wú)明顯差異?？梢钥闯?，在感受到缺氧微環(huán)境后，作為細(xì)胞感受氧分壓下降后的上游基因，HIF-1α在很短時(shí)間內(nèi)調(diào)控即發(fā)生了變化。24小時(shí)后表達(dá)達(dá)到了高峰，可能是由于細(xì)胞內(nèi)HIF-1α mRNA表達(dá)量的持續(xù)增加、累積，抑制了其繼續(xù)轉(zhuǎn)錄，同時(shí)，細(xì)胞凋亡率上升，細(xì)胞活力開(kāi)始下降，導(dǎo)致正常的轉(zhuǎn)錄水平下降。

在骨折/骨損傷修復(fù)中，成骨細(xì)胞分泌表達(dá)的VEGF誘導(dǎo)了新血管的生長(zhǎng)，為新骨的形成及重塑提供必要的營(yíng)養(yǎng)支持[7]。同時(shí)，VEGF還能通過(guò)影響骨細(xì)胞的分化進(jìn)程、增殖效率來(lái)促進(jìn)骨生成和重塑，在骨折重建過(guò)程中發(fā)揮重要作用[8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，缺氧微環(huán)境能顯著誘導(dǎo)OCCM-30細(xì)胞VEGF mRNA的表達(dá)上調(diào)，但與成骨方面的研究相比在表達(dá)的時(shí)效性上存在差別，在缺氧后36小時(shí)表達(dá)量才逐步上升，可能是因?yàn)镺CCM-30細(xì)胞具備成牙骨質(zhì)細(xì)胞的特性，成牙骨質(zhì)細(xì)胞與成骨細(xì)胞相比屬于惰性細(xì)胞，大多數(shù)情況下處于未激活狀態(tài)，因而在對(duì)缺氧應(yīng)答上存在差異。本實(shí)驗(yàn)尚未觀察到VEGF mRNA表達(dá)在上調(diào)后繼而下降的現(xiàn)象，可能是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)設(shè)定觀察時(shí)間較短，需要進(jìn)一步研究。綜上所述，缺氧能顯著抑制成牙骨質(zhì)細(xì)胞的活性，在正畸導(dǎo)致的牙骨質(zhì)吸收過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。

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Effect of hypoxia on proliferation，apoptosis and hypoxia-related gene of cementoblast-like cells

WUHaoa，HANHong-juana，RENXia-huaa，LIANGLinb

(a.DepartmentofStomatology，b.DepartmentofPharmacy，SichuanAcademyofMedicalSciences&SichuanProvincialPeople’sHospital，Chengdu610072，China)

Objective To investigate the influence of hypoxia on proliferation，apoptosis and hypoxia-related gene of cementoblast-like cells in order to understand the role of hypoxia in orthodontic-induced cementum absorption.Methods A cell hypoxic model was constructed by using a special incubator.At the same time，cell cultured under normal oxygenic pressure was used as control.MTT，F(xiàn)CM and RT-PCR were used to measure the proliferation ratio，apoptosis ratio and mRNA expressions of HIF-1α and VEGF.Results Hypoxia could depress the cell proliferation，increase apoptosis ratio and induce mRNA expressions of HIF-1α and VEGF of OCCM-30 cells.The expressions of HIF-1α mRNA reached the highest platform at 24 h after hypoxia while the expression of VEGF mRNA started to increase after 36 h of hypoxia.Conclusion Hypoxia could inhibit the cell proliferation and increase the cell apoptosis and hypoxia-relative gene expressions.

Hypoxia；Cementoblast-like cell；OCCM-30；Proliferation；HIF-1α

R780.2

A

1672-6170(2015)01-0043-03

2014-08-20；

2014-10-10)