黃 會，佘姝敏，詹希美，吳多榮

碳青霉烯酶藥物不敏感的腸桿科細菌中KPC酶的檢測及分析

黃 會1，佘姝敏2，詹希美3，吳多榮1

目的 了解海南地區(qū)三級醫(yī)院中腸桿菌科細菌產(chǎn)KPC酶的流行狀況及型別特點。方法 收集2012年8月到2013年6月海南地區(qū)四家三級醫(yī)院無菌部位分離的對亞胺培南或厄他培南中介或耐藥的腸桿菌科細菌43株，運用改良Hodge試驗進行KPC表型篩查；PCR的方法進行基因型別檢測。結果 43株細菌中，21株改良Hodge試驗陽性；PCR檢測3株為陽性，基因測序比對分析均為KPC-2型。結論 海南地區(qū)對碳青霉烯酶類藥物不敏感的腸桿科細菌中KPC酶的主要基因型別KPC-2型，攜帶KPC酶的質?？稍诓煌N屬細菌間水平傳遞，臨床應加強監(jiān)控，防止產(chǎn)碳青霉烯酶菌株在醫(yī)院環(huán)境中暴發(fā)和流行。

碳青霉烯酶；KPC；腸科桿細菌；改良Hodge試驗

腸桿菌科細菌如肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌等作為社區(qū)獲得性和醫(yī)院感染的重要病原菌，常可引起泌尿道、腹腔、膽道及呼吸道感染以及全身系統(tǒng)性感染。由于抗菌藥物的大量使用，腸桿菌科細菌的耐藥現(xiàn)象也十分普遍，甚至出現(xiàn)了碳青霉烯類抗生素耐藥的腸桿科細菌。而KPC酶的產(chǎn)生是目前引起腸桿菌科細菌對碳青霉烯類抗生素耐藥的主要原因[1]。迄今為止，在法國、哥倫比亞和以色列等許多國家和地區(qū)相繼報道了產(chǎn)KPC酶的菌株[2-3]，說明產(chǎn) KPC酶的菌株已在世界各地相繼流行和播散。在國內，2007年我國由魏澤慶等人首次報道在浙江地區(qū)發(fā)現(xiàn)了產(chǎn)KPC-2型碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌[4]，其后在我國一些南方省份開始流行，并在大腸埃希菌、粘質沙雷氏菌、費氏檸檬酸桿菌等菌中相繼發(fā)現(xiàn)了KPC-2型碳青霉烯酶。

本研究首次對海南地區(qū)碳青霉烯酶藥物不敏感的腸桿科細菌進行KPC酶的檢測，以了解海南地區(qū)腸桿菌科細菌產(chǎn)KPC酶狀況，以指導臨床合理使用抗菌藥物和及時好耐藥菌株的流行控制，對阻止或減緩產(chǎn)KPC型碳青霉烯酶細菌的產(chǎn)生及擴散和預防醫(yī)院感染方面具有重要意義，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源和鑒定 43株對亞胺培南或厄他培南中介或耐藥的腸桿菌科細菌均來自海南四家綜合性三級甲等醫(yī)院，其中?？谑腥嗣襻t(yī)院21株、海南省人民醫(yī)院10株、三亞市人民醫(yī)院6株、海南省農(nóng)墾總醫(yī)院6株。入選標準為：來自無菌部位的非重復性的且對亞胺培南或厄他培南中介或耐藥的腸桿菌科細菌。其中自中段尿標本21株、分泌物8株、血液標本5株、胸腹水和膽汁5株、其他標本4株。所有的分離株均使用法國梅里埃Vitek2 Compact 全自動細菌儀再次進行菌株鑒定、藥敏試驗及MIC值的測定。質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922、ATCC35218均來自衛(wèi)生部臨床檢驗中心。

1.2 改良Hodge 試驗 操作步驟按照2012年CLSI標準進行操作：用生理鹽水制備0.5麥氏濁度單位的大腸埃希菌ATCC25922濁菌液，用生理鹽水10倍稀釋后，用棉簽蘸取菌液均勻涂布M-H平板(在平板表面均勻涂布，并沿平板內緣均勻涂抹一周)，30 s后用無菌鑷子在平板中間貼10 μg/片厄他培南紙片，并用鑷子往下輕輕按壓，使紙片與瓊脂緊密結合，再用無菌接種環(huán)挑取3～5個待測菌落，將菌株從紙片邊緣向外沿離心方向劃20～25 mm長的直線，每個平板可接種3個待測菌株，標記后放入35 ℃培養(yǎng)箱中孵育18～24 h后觀察結果，如果在被測菌株與大腸埃希菌ATCC25922抑菌環(huán)交匯處大腸埃希菌生長增強，即為產(chǎn)碳青霉烯酶。陽性對照為產(chǎn)KPC酶肺炎克雷伯菌；陰性對照為肺炎克雷伯菌ATCC700603。

1.3 PCR基因擴增及測序

1.3.1 模板處理 用無菌接種環(huán)挑取2～4個菌落置于裝有300 μL三蒸水的EP管中，振蕩混勻，放于100 ℃干浴鍋中干浴10 min，迅速置于冰盒中冷卻5 min，1 200 r/min離心5 min，取上清DNA模板移入新的EP管，放-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 基因檢測 通過已經(jīng)設計好的引物(見表1)，進行PCR擴增。PCR整體反應的25 μL反應體系：模板DNA1 μL；引物1 μL；超純凈三蒸水9.5 μL；Taq酶12.5 μL。PCR反應的條件如下:94 ℃預變性4 min，然后 95 ℃ 50 s,57 ℃ 50 s,72 ℃ 60 s, 30個循環(huán)后,72 ℃延長7 min。將擴增得到的產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，將電泳完成的凝膠放入EB溶液中顯色，在電泳凝膠掃描成像儀中掃描并記錄結果，出現(xiàn)目的條帶的為陽性。

表1 PCR 擴增基因引物序列

1.3.3 陽性基因測序及序列比對 將上述PCR產(chǎn)物送去上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行測序，測序后在 GenBank運用BLAST進行比對。

2 結 果

2.1 鑒定和藥敏結果 從四家醫(yī)院收集來的43株菌株鑒定復核無誤，其中大腸埃希15株，陰溝腸桿菌9株，肺火克雷伯菌9株, 弗勞地檸檬酸桿菌4株，粘質沙雷菌 3株，其它菌株3株。重復藥敏試驗顯示均為對厄他培南、亞胺培南或美羅培南中介或耐藥的菌株，43株細菌對常見抗生素的耐藥情況見表2。

2.2 改良Hodge試驗篩查結果 改良Hodge試驗結果判斷：在劃線與抑菌圈的交叉處若細菌有增強生長的趨勢，使抑菌圈內呈矢狀生長者(典型為蘋果蒂樣生長)為陽性，否則為陰性。在43株藥敏初篩試驗陽性菌中，21株為改良Hodge試驗陽性。

2.3 KPC基因檢測結果 對21株表型篩查陽性的菌株進行KPC基因擴增結果顯示，有3株菌的PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后出現(xiàn)目的條帶，電泳結果見圖2。將PCR產(chǎn)物送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測序，所得DNA序列用BLAST程序與GenBank中的BLAST數(shù)據(jù)庫進行比對，比對結果3株陽性菌株均為KPC-2型基因,相似度99%。

表2 43株腸桿科細菌對常見抗生素的耐藥情況

Note: IPM--Imipenem; MEM--Meropenem; ETP--Ertapenem; FEP--Cefepime; CAZ--Peftazidime; CRO--Ceftriaxone; AMK--Amikacin; CN--Gentamicin; CIP--Ciprofloxacin; LEV--Levofloxacin; SXT--Sulfamethoxazole.

M: DL 2000 DNA Marker; 1: Negative control; 2-22: Amplification results of clinical strains.

3 討 論

碳青霉烯類抗生素是抗菌譜最廣，抗菌活性最強的非典型β-內酰胺抗生素，因其具有對β-內酰胺酶穩(wěn)定以及毒性低等特點，已經(jīng)成為治療嚴重細菌感染最主要的抗菌藥物之一。臨床主要致病菌對碳青霉烯類的耐藥很少見，在革蘭陰性菌中主要以鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌為主，一般來說對腸桿科的細菌敏感性較高，但是隨著碳青酶烯類抗生素在臨床的大量和不規(guī)范的應用，關于腸桿科細菌耐碳青霉烯類藥物的報道也越來越多[5-6]。

本研究中我們收集了2012年8月到2013年6月海南地區(qū)四家三甲醫(yī)院住院患者無菌部位非重復分離的對亞胺培南或美羅培南中介或耐藥的43株分離菌，對亞胺培南、厄他培南和美羅培南的耐藥率分別為60.6%、97.0%和69.7%，對β-內酰胺類耐藥率亦很高，對于三代頭孢菌素耐藥率高達93.9%，對喹諾酮類藥物耐藥為75.8%，對慶大霉素耐藥率為63.6%，僅對阿米卡星耐藥率相對較低，與各醫(yī)院往年情況相比，對碳青霉烯類抗生素的耐藥的腸桿科細菌出現(xiàn)上升的趨勢，這可能與抗生素特別是三、四代頭孢菌素類和碳青霉烯類抗生素的廣泛使用有關，應引起臨床醫(yī)師和微生物工作人員的重視。呼吸道標本因合格率較差且較難判定是致病菌還是定植菌，故在本研究中未收集。

腸桿科細菌耐碳青霉烯類藥物的機制主要是產(chǎn)碳青霉烯酶，包括：A類碳青霉烯酶；B類碳青霉烯酶(即金屬酶，常見的有VIM、IPM，最近報道超級細菌攜帶的NDM—1也屬于B類碳青霉烯酶)；D類碳青霉烯酶(如OXA系列，但一般在腸桿菌科細菌中較少見)[7]。其中最為常見的是KPC型碳青霉烯酶，它是近年發(fā)現(xiàn)的一種新型碳青霉烯酶，它首次發(fā)現(xiàn)是在美國卡羅利亞州北部的一株肺炎克雷伯菌中分離得到的，故將其命名為 KPC[8]。迄今，Genbank已收錄的KPC有14種之多。全球范圍報道的KPC型碳青霉烯酶多以 KPC-2和KPC-3為主，我國以KPC-2為主[9]。含有這種質?；虻木晖ǔＪ嵌嘀啬退?，可供選擇治療方法不多，并造成很高的死亡率，而且它傳播速度非?？?，可以在不同的種屬中傳播， KPC型碳青霉烯酶已引起了臨床特別注意，成為醫(yī)院感染控制和流行病學的新的挑戰(zhàn)，早期發(fā)現(xiàn)這樣的菌株是至關重要的。

本研究中，在 43株分離株中有21株經(jīng)改良Hodge試驗表型篩查為陽性，其中有3株菌的PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后出現(xiàn)目的條帶，測序比對結果3株陽性菌株均為KPC-2型基因，其他菌株耐藥或敏感性下降的原因可能為產(chǎn)金屬酶、其他β-內酰胺酶或合并多種酶需要進行進一步的研究。3株陽性菌分別為弗氏檸檬酸桿菌、大腸埃希菌、產(chǎn)酸克雷伯菌。據(jù)報道，目前產(chǎn)KPC型碳青霉烯酶的細菌有大腸埃希菌、陰溝腸桿菌、 產(chǎn)酸克雷伯菌、沙門菌屬、變形菌屬、弗氏檸檬酸桿菌、奧克西托克雷伯菌、褪色沙雷菌、銅綠假單胞菌、鮑氏不動桿菌等。本研結果表明在海南地區(qū)KPC型碳青霉烯酶亦不僅僅是存在于肺炎克雷伯菌中，亦存在跨種屬傳播的現(xiàn)象，目前還未出現(xiàn)流行。

值得注意的是這3株菌均分離于中段尿標本中，3例病人均有插尿管操作，這種有創(chuàng)的操作可能也是感染KPC型碳青霉烯酶腸桿科細菌的危險因素。另外，3例病人中年齡分別為5歲，71歲，72歲，這些病人免疫力較差，其中兩例有基礎性疾病，年齡和基礎性疾病與感染也是有密切關系的，但因為研究得到的陽性菌株數(shù)目太少，這些因素和感染的關系還需要更多的數(shù)據(jù)的支持。另外，在本試驗中我們只對KPC型碳青霉烯酶做了檢測，下一步研究將對包括ESBL、VIM、IPM、NDM-1的基因進行檢測，以進一步對腸桿科細菌耐碳青霉烯類藥物的機制進行全面的了解。

研究表明海南地區(qū)已出現(xiàn)產(chǎn)KPC型碳青霉烯酶腸桿科細菌，其主要的基因型別為KPC-2，攜帶KPC型碳青霉烯酶的質粒可在不同種屬細菌間進行轉移，臨床和微生物室應加強監(jiān)控，防止產(chǎn)碳青霉烯酶菌株在醫(yī)院環(huán)境中暴發(fā)和流行。

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KPC carbapenemases amongEnterobacteriaceaewith carbapenem non-susceptibility

HUANG Hui1,SHE Shu-min2,ZHAN Xi-mei3,WU Duo-rong1

(1.ClinicalLaboratory,HaikouMunicipalHospital,Haikou570208,China; 2.SchoolofTropicalMedicineandLaboratoryMedicine,HainanMedicalCollege,Haikou571199,China; 3.DepartmentofPathogenBiology,ZhongshanMedicalCollege,SunYat-senUniversity,Guangzhou51008,China)

To investigate the prevalence and gene types of KPC inEnterobacteriaceaestrains isolated from 4 tertiary general hospitals in Hainan area, a total 43 isolates which were resistant or intermediate to imipenem or ertapenem were collected from sterile sites between August 2012 and June 2013 from 4 tertiary general hospitals in Hainan area. Modified Hodge Tests (MHT) were performed for KPC phenotype screening. PCR amplification and DNA sequence were performed to analyze the encoding genes of KPC. Results showed that in the 43 isolates, 21 strains were positive in MHT. PCR and DNA sequence analysis confirmed that 3 isolates produced KPC-2. It's suggested that there were theEnterobacteriaceaecarrying KPC in Hainan area. The encoding genes were KPC-2. The KPC gene could be horizontally transmitted by plasmid among different groups of bacteria. It is important to control the transmission of theseEnterobacteriaceaecarrying KPC.

carbapenemase;Klebsiellapneumoniae carbapenemases;Enterobacteriaceae; Modified Hodge Test

Wu Duo-rong, Email: wuduorong@163.com

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.03.013

?？谑兄攸c科技計劃項目(No.2012-070)

吳多榮，Email:wuduorong@163.com

1.?？谑腥嗣襻t(yī)院 中南大學湘雅醫(yī)學院附屬?？卺t(yī)院檢驗科，?？?570208； 2.海南醫(yī)學院熱帶醫(yī)學與檢驗醫(yī)學院，?？?570208 3.中山大學中山醫(yī)學院病原生物部，廣州 510080

R378.2

A

1002-2694(2015)03-0247-04

Supported by the Key Project of Haikou Science and Technology Planning (No. 2012-070)

2014-09-12；

2014-12-04