梁雪妮，崔步云，毛玲玲，任 微，于靜波，薛文成，孟冬婭

PCR-HRM方法快速鑒定布魯氏菌的初步應(yīng)用

梁雪妮1，崔步云2，毛玲玲3，任 微4，于靜波4，薛文成4，孟冬婭4

目的 本研究旨在建立準確、快速地鑒定布魯氏菌菌種及生物分型的PCR-HRM(高分辨率熔解曲線)方法。方法 根據(jù)目的基因序列，參考文獻合成6對基因擴增引物(1對布魯氏菌屬特異引物，5對種間特異引物)，應(yīng)用PCR-HRM方法鑒定布魯氏菌屬6個種19個生物型的標準菌株，并初步應(yīng)用到臨床分離的35株布魯氏菌中。結(jié)果 采用布魯氏菌屬特異引物(Bspp)，6個種19個生物型的標準菌株均擴增出同樣形狀的溶解曲線，與其它對照菌株的曲線不同；采用5對種特異引物，6個種的標準菌株均有特征性PCR-HRM曲線；臨床分離的35株布魯氏菌的PCR-HRM曲線與羊種布魯氏菌標準菌株的一致。結(jié)論 該研究采用的PCR-HRM分析方法，獲得了布魯氏菌屬及6個種標準菌株的不同曲線圖，可準確鑒定臨床分離的羊種布魯氏菌，可用于臨床微生物實驗室疑似布魯氏菌感染的初步鑒定。

布魯氏菌；分子鑒定；高分辨溶解分析(PCR-HRM)

Supported by the grant from the Key Technologies R&D Program of Liaoning Province (No. 2011225021), and the Major National Science and Technology Special Project (No. 2009ZX10004-209) Corresponding author: Meng Dong-ya, Email: mengdongya@hotmail.com

布魯氏菌屬人畜共患病病原體，是潛在的致殘性生物恐怖戰(zhàn)劑，其引起的疾病為乙類傳染病或二類動物疫病。布魯氏菌屬分為6個種19個生物型，即羊種(生物型1～3)，牛種(生物型1～7和9),豬種(生物型1～5)，綿羊副睪種，沙林鼠種及犬種(各1個生物型)[1]。根據(jù)中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所已收集到的核酸鑒定結(jié)果顯示，我國已分離到除豬種4型、5型，羊種2型和沙林鼠種外的15個生物型，但在人群中主要致病菌株為羊種布魯氏菌。布魯氏菌生長緩慢，準確的生化鑒定及特異性凝集試驗需要一些特殊試劑，費時、費力也不適合在普通實驗室開展。臨床急需一種能夠準確、快速鑒定布魯氏菌菌種的方法。本文旨在探討PCR-HRM技術(shù)對布魯氏菌種進行準確快速鑒定的可行性及初步應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 由中國疾病預防控制中心提供的6個種19個生物型的標準菌株，即羊種(1～3型)，牛種(1～7，9型)，豬種(1～5型)，綿羊副睪種、沙林鼠種和犬種DNA樣品。2010—2013年9月間沈陽軍區(qū)總醫(yī)院及周邊醫(yī)院細菌培養(yǎng)分離的35株羊種布魯氏菌，由中國疾病預防控制中心鑒定分型。陰性對照(蒼白桿菌、流感嗜血桿菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、 鮑曼不動桿菌、黏質(zhì)沙雷菌)均分離自沈陽軍區(qū)總醫(yī)院微生物實驗室，經(jīng)16s rRNA基因測序驗證。

1.2 主要儀器與試劑 羅氏LightCycler?480 PCR擴增儀，SYBR?Premix Ex TaqTMII (Perfect Real Time)(寶生物，大連)，High Resolution Melting Master(Roche)。所用引物參照文獻[1]設(shè)計，引物序列、靶基因及用途等見表1。

表1 研究所需引物序列及用途

1.3 反應(yīng)體系 通過預實驗對反應(yīng)體系進行優(yōu)化，總體系20 μL，Master Mix為10 μL，每次試驗固定其它加入量，分別做MgCl2(25 mmol/L)、Primer(10 μmol/L)、模板DNA梯度實驗，剩余用H2O補足，根據(jù)各自梯度所對應(yīng)的最佳溶解曲線選擇出最適合此實驗的反應(yīng)體系。最終優(yōu)化好的反應(yīng)體系為Master Mix 10 μL，MgCl22.4 μL(終濃度3 mmol/L)，Primer F、R各 0.4 μL(終濃度0.2 μmol/L)，H2O 5.8 μL，模板DNA 1 μL(50 pg)。

1.4 PCR-HRM分析 通過預實驗對PCR反應(yīng)條件進行優(yōu)化，優(yōu)化后的PCR-HRM反應(yīng)條件：預變性95 ℃ 10 min，變性95 ℃ 10 s、退火65 ℃～53 ℃(touchdown PCR：每個循環(huán)降低0.5 ℃)15 s、延伸72 ℃ 20 s(收集熒光信號)、擴增45個循環(huán)。PCR擴增結(jié)束后直接運行HRM程序：95 ℃變性1 min，40 ℃降溫1 min，75 ℃～95 ℃連續(xù)升溫(每上升1 ℃收集25次熒光信號)，冷卻40 ℃ 10 s。使用LightCycler?480 Gene Scanning Software分析軟件，分析各種HRM曲線。

1.5 結(jié)果比對 將PCR-HRM鑒定結(jié)果與中國疾病預防控制中心的鑒定結(jié)果進行比較，評估HRM分析應(yīng)用于布魯氏菌分型的準確性及效果。

2 結(jié) 果

2.1 布魯氏菌屬PCR-HRM分析鑒定方法的建立 以布魯氏菌屬特異性引物Bspp進行PCR擴增，對其擴增產(chǎn)物進行HRM分析，可得到熒光強度變化率-溫度熔解曲線，軟件根據(jù)曲線的峰形、主峰的起落點和Tm值等對曲線進行歸類。實驗使用該方法對已知DNA序列的布魯氏菌6個種19個生物型標準菌株進行鑒定，所有菌種的標準菌株均擴增出了同樣形狀的HRM曲線，計算機分析軟件成功將其劃分為同一類，與其它陰性對照(蒼白桿菌、流感嗜血桿和其它陰性桿菌)菌株很好地鑒別開來，結(jié)果如圖1所示。

Primer Bspp; abscissa stands for temperature; ordinate stands for fluorescence.

2.2 布魯氏菌屬內(nèi)不同種型菌株鑒別的PCR-HRM分析方法建立 分別以Bmel、Boa、Bcan、Bsui、Bneo為引物，對布魯氏菌6個種19個生物型標準菌株進行PCR-HRM分析鑒定，得到了5套鑒定布魯氏菌種的HRM標準曲線，詳見圖2-6。這5套標準曲線可以將6種布魯氏菌相互鑒別。

Primer Boa; abscissa stands for temperature; ordinate stands for relative fluorescence.

2.3 羊種布魯氏菌臨床分離株的PCR-HRM鑒定的初步應(yīng)用 2010—2013年9月間，收集沈陽及周邊地區(qū)臨床分離的可疑布魯氏菌35株。經(jīng)中國疾病預防控制中心用傳統(tǒng)培養(yǎng)鑒定方法及血清學凝集實驗證實35株為羊種布魯菌；布魯氏菌屬特異的PCR-HRM分析證實35株為布魯氏菌屬，再用Bmel標準PCR-HRM分析其均為羊種布魯氏菌，PCR-HRM方法與傳統(tǒng)培養(yǎng)血清學凝集試驗鑒定方法的鑒定結(jié)果完全一致。微生物自動鑒定儀將35株臨床分離株中的5株誤鑒定為人蒼白桿菌、流感嗜血桿菌、支氣管鮑特菌、解脲寡源桿菌等，這5株經(jīng)16S rRNA基因測序鑒定為羊種布魯菌。PCR-HRM方法與微生物自動鑒定儀結(jié)果比較見表2。統(tǒng)計分析采用Fisher確切概率法，計算得出P=0.107 2，P≥0.05，差異無統(tǒng)計學意義。

Primer Bneo; abscissa stands for temperature; ordinate stands for relative fluorescence.

Primer Bcan; abscissa stands for temperature; ordinate stands for relative fluorescence.

Primer Bmel; abscissa stands for temperature; ordinate stands for relative fluorescence.

Primer Bsui; abscissa stands for temperature; ordinate stands for relative fluorescence.

表2 PCR-HRM方法和微生物自動鑒定儀對35株羊種布魯氏菌的鑒定結(jié)果

3 討 論

布魯氏菌病為乙類傳染病，布魯氏菌可以通過實驗室直接接觸和氣溶膠傳播，國內(nèi)外常有實驗室防護不當導致操作人員感染報道，甚至是爆發(fā)性的人群感染[2-3]。實際工作中，在缺乏相關(guān)臨床資料的情況下，實驗人員也不會針對培養(yǎng)物采取特殊的防護，極易造成實驗室感染[4]。由于該菌生長較慢，細菌鑒定儀器經(jīng)常將布魯氏菌鑒定為其它非傳染性疾病病原菌[5-6]。

PCR-HRM方法具有快速、準確、不需特殊設(shè)備、重復性好、靈敏度高等優(yōu)點。其分析原理[7-8]是在標準PCR試劑的基礎(chǔ)上加入可與雙鏈DNA結(jié)合的飽和性熒光染料， PCR擴增結(jié)束后即開始運行HRM程序, 將PCR產(chǎn)物自低到高(60 ℃～95 ℃)逐步升溫，每次升溫0.02 ℃～0.1 ℃，此過程雙鏈DNA解鏈，熒光染料脫落，不再產(chǎn)生熒光信號。以熒光強度變化率為縱坐標，以溫度為橫坐標作圖，即可得出對應(yīng)于特定雙鏈DNA的特征曲線。因DNA 序列的長度，GC 含量以及堿基互補性差異，每一段DNA的主峰高度、溶解溫度Tm(主峰最高處所對應(yīng)的溫度)不同，因而每一段DNA均具有獨特的PCR-HRM曲線。

本研究首先采用以布魯氏菌屬特異引物Bssp為基礎(chǔ)的PCR-HRM分析方法，得到布魯氏菌屬特有的曲線圖，并通過了該實驗驗證，即布魯氏菌屬中的6個種、19個生物型標準菌株及臨床分離的35株布魯氏菌均擴增出形態(tài)完全一致的HRM分析曲線，該溶解曲線形狀與Jonas M.Winchell等報道[1]基本一致。而其它與布魯氏菌親緣關(guān)系較近或形態(tài)相似的革蘭陰性小桿菌，如蒼白桿菌和流感嗜血桿菌等均未得到特征性擴增曲線。證明該研究所應(yīng)用的引物、優(yōu)化后的PCR-HRM反應(yīng)體系及反應(yīng)條件能夠?qū)⒉剪斒暇鷮倥c其它菌鑒別，適合常規(guī)微生物實驗室對疑似布魯氏菌屬感染的初步鑒別診斷。

在此基礎(chǔ)上，又合成了針對不同種布魯氏菌株的5對引物，得到了不同種間特異的HRM曲線圖。綿羊附睪種的glk基因有兩個G-A突變，牛種有一個G-A突變，其它種不存在突變,因此在圖2中引物Boa能夠?qū)⒕d羊附睪種、牛種與其它種分開；沙林鼠種的Glk基因有A-G突變，與其它種相比，沙林鼠種出現(xiàn)較晚的溶解曲線，圖3中引物Bneo將沙林鼠種與其它種區(qū)分開；圖4犬種的int-hyp基因有G-A突變，其溶解曲線與其它種不同；圖5中，引物Bmel擴增的125bpDNA片段存在G-T突變，溶解曲線能將羊種與其它種區(qū)分開；圖6中，引物Bsui將豬種、牛種與其它種分開；因此這些引物聯(lián)合應(yīng)用可以將不同種的布魯菌相互鑒別開。

引起人類感染的布魯氏菌主要為羊種(B.melitensis)、豬種(B.suis)、牛種(B.abortus)及犬種(B.canis)，這些種在不同地區(qū)分布差異明顯，本實驗收集的菌株主要為羊種布魯氏菌。實驗利用Bmel引物為基礎(chǔ)的PCR-HRM分析方法，成功地將35株沈陽軍區(qū)總醫(yī)院和周邊醫(yī)院臨床分離的羊種布魯氏菌與其它幾種布魯氏菌相鑒別，有助于對地區(qū)布魯氏菌流行病學調(diào)查研究。

綜合分析實驗結(jié)果，布魯氏菌PCR-HRM快速鑒定方法初步建立，其臨床應(yīng)用價值可觀，但初步應(yīng)用于本地區(qū)臨床分離株后，經(jīng)統(tǒng)計分析得出差異無統(tǒng)計學意義，尚不能認為微生物自動鑒定儀和PCR-HRM方法鑒定結(jié)果的準確率有明顯差別，可能受樣本數(shù)量不足影響，尚需大量樣本進一步驗證。從實驗過程得出PCR-HRM方法具有快速、準確、靈敏度高等優(yōu)點，推薦實驗室在遇到可疑病例時，先用種屬特異引物擴增分析，確定是否為布魯氏菌，再根據(jù)本地流行病學資料，首先選擇適合本地主要流行株鑒別的引物進行PCR-HRM分析，應(yīng)能滿足大部分臨床診斷需求。接下來我將嘗試應(yīng)用PCR-HRM方法區(qū)分羊種布魯氏菌的3個生物型。

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Clinical application of PCR and high resolution melting analysis for rapid identification ofBrucellaisolates

LIANG Xue-ni1,CUI Bu-yun2,MAO Ling-ling3, REN Wei4,YU Jing-bo4,XUE Wen-cheng4,MENG Dong-ya4

(1.PostgraduateTrainingBase,GeneralHospitalofShenyangMilitaryCommand,LiaoningMedicalUniversity,Jinzhou121001,China; 2.StateKeyLaboratoryforInfectiousDiseasePreventionandControl,CollaborativeInnovationCenterforDiagnosisandTreatmentofInfectiousDisease,NationalInstituteforCommunicableDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China; 3.LiaoningProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Shenyang110005,China; 4.ClinicalLaboratory,GeneralHospitalofShenyangMilitaryCommand,Shenyang110016,China)

The aim of this study is to develop a rapid and accurately species typing method forBrucellaisolates by using High Resolution Melting (HRM) analysis. Six pairs of primers were used according to the reference for the sequence of purpose gene. Nineteen biotypes of six speciesBrucellastandard strains were identified by PCR-HRM analysis and this analysis was used to detect the 35 clinical isolates. Results showedBrucellaamplified specific melting curves were different from contrasted strains with primer Bspp. The six speciesBrucellastandard strains have own characteristic curve shape from each others by PCR-HRM analysis with five pairs of primers. Thirty-five clinical isolates ofBrucellahave entirely consistent with PCR-HRM curve shape withBrucellamelitensisstandard strains. So, PCR-HRM analysis methods can accurately identifyBrucellastrains, especially clinical isolatedBrucellamelitensis, and may be used in clinical microbiology laboratories.

Brucella; molecular diagnosis; PCR-HRM analysis

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.03.015

遼寧省科技攻關(guān)計劃資助項目(2011225021)和國家科技重大專項課題(2009ZX10004-209)聯(lián)合資助(梁雪妮和崔步云同等貢獻)

孟冬婭，Email：mengdongya@hotmail.com

1.遼寧醫(yī)學院沈陽軍區(qū)總醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地，錦州 121001； 2.傳染病預防控制國家重點實驗室，感染性疾病診治協(xié)同創(chuàng)新中心，中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所,北京 102206； 3.遼寧省疾病預防控制中心，沈陽 110005； 4.沈陽軍區(qū)總醫(yī)院檢驗科，沈陽 110016

R378.5

A

1002-2694(2015)03-0255-05

2013-12-04；

2014-10-23