王興紅，鄭亞萍，王麗菲

(1.漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校生理教研室，漯河 462000；2.昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院、云南省腫瘤醫(yī)院頭頸外科，昆明 650000)

利拉魯肽對高糖誘導(dǎo)大鼠近端小管上皮細(xì)胞Toll 樣受體4表達(dá)和鈉鉀ATP酶活性影響*

王興紅1，鄭亞萍1，王麗菲2

(1.漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校生理教研室，漯河 462000；2.昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院、云南省腫瘤醫(yī)院頭頸外科，昆明 650000)

目的 探討利拉魯肽(Li)對高糖誘導(dǎo)大鼠近端小管上皮細(xì)胞(PTEC)的保護作用。方法 體外原代培養(yǎng)大鼠PTEC。將細(xì)胞分為正常對照組、模型對照組、Li小劑量組、Li中劑量組、Li大劑量組，每組設(shè)6個復(fù)孔，作用72 h后液閃法測定PTEC鈉鉀ATP酶活性；Western blot測定Toll 樣受體4(TLR4)蛋白表達(dá)；酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法測定細(xì)胞培養(yǎng)上清白細(xì)胞介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)的含量。結(jié)果 與正常對照組比較，高糖培養(yǎng)72 h PTEC鈉鉀ATP酶活性[(2 737.88±317.22) μmol·g-1·h-1]升高，細(xì)胞和培養(yǎng)液中TLR4蛋白表達(dá)、IL-6、 TNF-α和PAI-1增加，均差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；與模型對照組比較，Li中、大劑量組作用72 h 后PTEC鈉鉀ATP酶活性[(2 487.76±215.54)，(2 301.55±207.63) μmol·g-1·h-1]明顯降低，細(xì)胞和培養(yǎng)液中TLR4蛋白表達(dá)、IL-6、TNF-α和PAI-1降低，均差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論 Li在一定程度上抑制高糖環(huán)境炎癥細(xì)胞因子表達(dá)并能穩(wěn)定鈉鉀ATP酶活性，可能對腎臟有一定的保護作用。

利拉魯肽；近端小管上皮細(xì)胞；鈉鉀ATP酶；炎癥；Toll 樣受體4

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)發(fā)病機制尚無定論，近年來炎癥學(xué)說備受關(guān)注。Toll樣受體家族(Toll-like receptors，TLRs)是介導(dǎo)慢性炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因素，其中Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)過表達(dá)是導(dǎo)致糖尿病腎損傷的重要機制之一[1]。利拉魯肽(liraglutide，Li) 已成為治療2型糖尿病的研究熱點，其是否具有腎臟保護作用至今尚未闡明。本研究擬在細(xì)胞水平觀察Li對高糖誘導(dǎo)大鼠近端小管上皮細(xì)胞(proximal tubule epithelial cells，PTEC)TLR4等炎癥因子和鈉鉀ATP酶活性的影響，為臨床應(yīng)用Li防治DN提供實驗和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物 健康Wistar 大鼠，清潔級，體質(zhì)量(250±20) g，由河南省實驗動物中心提供(動物使用合格證號：410217，動物生產(chǎn)許可證號：SYXK(豫)2010-0011)，動物實驗室溫度22～25 ℃，相對濕度：55%～70%，黑暗和光照時間比為12 h：12 h。全部大鼠常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

1.2 藥物與試劑 Li注射溶液(丹麥諾和諾德公司生產(chǎn)，規(guī)格：3 mL：18 mg，每盒1支，批號：20120224)；RPMI1640培養(yǎng)液(美國Gibco 公司，批號：20121201)；Ⅱ型膠原酶(美國Gibco 公司，批號：20120911)；胎牛血清(杭州四季青生物工程有限公司，批號：20130111)；考馬斯亮藍(lán)蛋白測定試劑盒(南京建成生物工程公司，批號：20130321)；D-(+)-葡萄糖(美國Sigma公司，批號：20111223，含量：≥99.5%)；鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(strept avidin-biotin complex，SABC)、Mouse IgG試劑盒(批號：20130211)及二氨基聯(lián)苯胺顯色試劑盒(批號：20130211)均購自武漢博士德公司；[γ-32P]ATP(北京福瑞生物工程公司核酸研究室，批號：20130221)；白細(xì)胞介素-6 (interleukin-6，IL-6)酶聯(lián)免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(批號：20120129)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)ELISA試劑盒(批號：20120219)、纖溶酶原激活物抑制劑-1(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)ELISA試劑盒(批號：20120329)均購自南京建成生物工程研究所；TLR4小鼠抗大鼠單克隆抗體(美國Santa Cruz公司，批號：20120512)；β-actin(北京博奧森生物公司，批號：20111223)。

1.3 主要儀器 紫外分光光度計(日本島津公司)；全自動酶聯(lián)免疫吸附儀(芬蘭Thermo Labsytom公司)，Power-pac200電泳儀(美國BIO-RAD公司)，Trans-Blot電泳濕轉(zhuǎn)儀(美國BIO-RAD公司)，液體閃爍計數(shù)器(上海核所日環(huán)光電儀器有限公司)。

1.4 原代PTEC的培養(yǎng)與鑒定 按照杜飛等[2]改良的Doucet手工微分離法分離大鼠單根近端小管，原代培養(yǎng)大鼠PTEC。將近端腎小管置入2 mL RPMI1640培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，置37 ℃、含5%二氧化碳(CO2)的培養(yǎng)箱中原代培養(yǎng)，于第3天更換第一次培養(yǎng)液，7～8 d細(xì)胞基本鋪滿瓶底。行免疫細(xì)胞化學(xué)SABC法鑒定細(xì)胞。

1.5 實驗分組 用MTT法檢測高糖和Li對細(xì)胞增殖的影響，由此選出高糖及藥物濃度。PTEC生長至基本鋪滿瓶底，將其消化并接種于96孔板，24 h后更換為無血清RPMI1640低糖培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h使細(xì)胞同步化，然后將細(xì)胞隨機分為5組。正常對照組：PTEC培養(yǎng)于含5.6 mmol·L-1葡萄糖普通無血清RPMI1640培養(yǎng)液中；模型對照組：PTEC培養(yǎng)于含25 mmol·L-1葡萄糖普通無血清RPMI1640培養(yǎng)液中；Li小劑量組：PTEC培養(yǎng)于含25 mmol·L-1葡萄糖普通無血清RPMI1640培養(yǎng)液同時給予Li 10 nmol· L-1干預(yù)；Li中劑量組：PTEC培養(yǎng)于含25 mmol·L-1葡萄糖普通無血清RPMI1640培養(yǎng)液同時給予100 nmol· L-1Li干預(yù)；Li大劑量組：PTEC培養(yǎng)于含25 mmol·L-1葡萄糖普通無血清RPMI1640培養(yǎng)液同時給予Li1 000 nmol· L-1干預(yù)。每組設(shè)6個復(fù)孔，作用72 h后取樣觀察。

1.6 原代PTEC鈉鉀ATP酶活性的測定 將各組處理后的PTEC消化并移至離心管中，用4 ℃磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution,PBS)沖洗2次，1 000 r·min-1(r=250 mm)離心10 min后棄上清液，加入三蒸水100 μL，然后-80 ℃與37 ℃水浴兩次快速低滲并凍融處理，再置4 ℃ 冰箱。鈉鉀ATP酶活性(μmol·g-1·h-1)=(X-B)/蛋白濃度×樣本體積×孵育時間(h)×[γ-32P]ATP比活性。X為待測樣本的液體閃爍計數(shù)值，B為空白對照管的液體閃爍計數(shù)值[2-3]。

1.7 細(xì)胞培養(yǎng)液上清液IL-6和TNF-α及PAI-1的檢測 取培養(yǎng)液中的上清液，通過自動酶免分析儀測定IL-6、TNF-α、PAI-1水平，在波長550 nm光下讀取吸光度(A)值，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算含量。操作嚴(yán)格按照相應(yīng)的ELISA試劑盒說明書進行。

1.8 Western blot測定TLR4蛋白表達(dá) 按照不同的實驗要求，收集各組PTEC，用苯甲基磺酰氟攝取蛋白質(zhì)，測定總蛋白含量。蛋白樣品行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上，封閉，加入一抗[TLR4小鼠抗大鼠單克隆抗體(1：1 000)]，4 ℃過夜，傾去一抗，TBST洗膜3次，每次15 min。洗滌后二抗孵育[羊抗小鼠抗體(1：5 000)]，置搖床上搖動，室溫下1 h，棄去二抗，Tris-HCl緩沖液加吐溫洗膜3次，每次15 min；電化學(xué)發(fā)光劑暗室曝光成像、攝相，IMAGE J軟件分析求得積分A值。

2 結(jié)果

2.1 PTEC鈉鉀ATP酶的活性 與模型對照組比，經(jīng)Li 100，1 000 nmol· L-1培養(yǎng)72 h 后，PTEC鈉鉀ATP酶活性顯著降低(P<0.05，P<0.01)，而小劑量的Li(10 nmol· L-1)對高糖誘導(dǎo)的PTEC鈉鉀ATP酶活性無明顯作用，見表1。

2.2 PTEC炎癥因子IL-6和TNF-α及PAI-1的含量 與模型對照組比較，經(jīng)Li 100，1 000 nmol· L-1培養(yǎng)72 h后，PTEC炎癥因子IL-6、TNF-α、PAI-1水平顯著降低(P<0.05或P<0.01)，而小劑量的Li(10 nmol· L-1)對高糖誘導(dǎo)的PTEC炎癥因子IL-6、TNF-α、PAI-1水平無明顯作用。見表1。

2.3 PTEC TLR4蛋白的表達(dá) 與模型對照組比較，經(jīng)Li 100，1 000 nmol· L-1培養(yǎng)72 h 后，PTEC的TLR4蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05或P<0.01)，而小劑量的Li(10 nmol· L-1)對高糖誘導(dǎo)的PTEC的TLR4蛋白表達(dá)無明顯作用。見圖1。

3 討論

DN是糖尿病最為嚴(yán)重的并發(fā)癥之一。近年來免疫炎癥學(xué)說認(rèn)為糖尿病是一種天然免疫激活和慢性低度炎癥反應(yīng)為特征的疾病。TLR能促進細(xì)胞因子的合成與釋放，引發(fā)炎癥反應(yīng)。其中TLR4可以介導(dǎo)多種炎癥及急性期反應(yīng)的細(xì)胞因子形成，有研究證實其在DN發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。DN早期存在明顯的巨噬細(xì)胞浸潤[4-5]。NF-κB是炎癥調(diào)控的中心環(huán)節(jié)[6-7]。研究表明，單核巨噬細(xì)胞可以通過膜表面TLR感受PAMP刺激，經(jīng)細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終由進入胞核內(nèi)活化的NF-κB啟動核內(nèi)相關(guān)基因，合成IL-1、IL-6、IFN-γ、TNF-α等多種促炎因子并釋放到細(xì)胞外，并形成復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，介導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)[8]。高糖培養(yǎng)細(xì)胞是目前體外復(fù)制糖尿病模型的一種重要手段[9]。本研究結(jié)果顯示高糖環(huán)境下PTEC TLR4蛋白表達(dá)增高，培養(yǎng)液上清炎癥因子IL-6、TNF-α、PAI-1含量增高，提示PTEC在高糖環(huán)境下出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，其機制可能與TLR4/NF-κB 信號通路有關(guān)。Li是一種新型的GLP-1類似物，具有降低血糖，保護胰島β細(xì)胞和心臟等多種作用[10]。本研究表明，Li可以抑制高糖環(huán)境下PTEC TLR4蛋白表達(dá)，從而減少培養(yǎng)液上清炎癥因子IL-6、TNF-α、PAI-1含量。提示Li可能與抑制TLR4/NF-κB 信號通路有關(guān)，其可能通過阻斷TLR信號通路介導(dǎo)的多種炎性細(xì)胞因子形成，抑制DN的發(fā)展。

表1 5組PTEC炎癥因子IL-6和TNF-α及PAI-1的含量和鈉鉀ATP酶活性的比較

與正常對照組比較，*1P<0.01，*2P<0.05；與模型對照組比較，*3P<0.01，*4P<0.05

Compared with normal control group，*1P<0.01，*2P<0.05；compared with model control group，*3P<0.01，*4P<0.05

A.正常對照組；B.模型對照組；C.Li小劑量組；D.Li中劑量組；E.Li大劑量組；與正常對照組比較，*1P<0.01；與模型對照組比較，*2P<0.01，*3P<0.05

圖1 5組大鼠PTEC Western blot測定TLR4蛋白的表達(dá)電泳圖(Ⅰ)和柱形圖(Ⅱ)

A.normal control group；B.model control group；C.low-dose Li group；D.medium-dose Li group；E.high-dose Li group；compared with normal control group，*1P<0.01；compared with model control group，*2P<0.01，*3P<0.05

Fig.1 Electrophotogram (Ⅰ) and Histogram (Ⅱ) of western blot analysis on TLR expression in PTEC of five groups of rats

PTEC是腎小管重吸收和分泌多種物質(zhì)的重要細(xì)胞。有研究認(rèn)為PTEC中鈉與葡萄糖的轉(zhuǎn)運過強，使鈉鹽在此段過度重吸收是DN發(fā)病的關(guān)鍵[11]。鈉鉀ATP酶是存在于PTEC細(xì)胞基底膜上的重要離子泵，它與多種重要物質(zhì)的轉(zhuǎn)運過程密切相關(guān)。研究鈉鉀ATP酶活性對深入了解腎臟功能異常具有重要意義。用鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠早期，其近端小管的鈉鉀ATP酶活性及其亞單位的表達(dá)均顯著升高，與DN的發(fā)生、發(fā)展有顯著的相關(guān)性[12]。本研究結(jié)果顯示，高糖環(huán)境培養(yǎng)PTEC鈉鉀ATP酶活性顯著升高，提示鈉鉀ATP酶參與腎基底膜損傷過程，而Li可以抑制高糖誘導(dǎo)的PTEC鈉鉀ATP酶活性的顯著升高，并且呈現(xiàn)劑量依賴性，隨著劑量的增加，穩(wěn)定鈉鉀ATP酶活性的作用增強，達(dá)到保護腎小管上皮細(xì)胞作用。綜上研究提示Li治療DN的機制可能與其降低血糖，糾正機體及細(xì)胞代謝異常有關(guān)。具體途徑還有待進一步研究。

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DOI 10.3870/yydb.2015.08.003

Effect of Liraglutide on Toll-like Receptor 4 and Na+/K+-ATPase Activity in Proximal Tubular Epithelial Cells of Rats Induced by High Glucose

WANG Xinghong1, ZHENG Yaping1, WANG Lifei2

(1.DepartmentofPhysiology,LuoheMedicalCollegeLuohe462000,China； 2.DepartmentofOtolaryngology-head&NeckSurgery,YunnanTumorHospital,theThirdAffiliatedHospitalofKunmingMedialUniversity,Kunming650000,China)

Objective To explore the protective effect of liraglutide (Li) on the proximal tubular epithelial cells (PTECs) of rats induced by high glucose. Methods The PTECs of rats were obtained by primary culture and divided into normal control group (NC), model control group (HG), HG+low-dose Li group, HG+ medium-dose Li group, and HG+high-dose Li group (n=6 in each group).After 72 h of incubation, the activity of Na+/K+-ATPase in PTECs was measured by the liquid scintillation counter.Protein expression of Toll-like receptor 4 (TLR4) was measured by Western blotting.Interleukin-6 (IL-6), tumor necrosis factor-α (TNF-α) and plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1) in culture supernatants were measured by the enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). Results Compared with NC, activity of Na+/K+-ATPase [(2 737.88±317.22) μmol·g-1·h-1] and the protein expression of TLR4 in PTECs, IL-6, TNF-α and PAI-1 in culture supernatants were significantly increased in HG (P<0.05, orP<0.01).Compared with HG, activity of Na+/ K+-ATPase and the protein expression of TLR4 in cells, IL-6, TNF-α and PAI-1 in culture supernatants reduced significantly in HG+ medium- or high dose Li groups (P<0.05, orP<0.01). Conclusion Liraglutide can inhibit the expression of inflammatory cytokines and stabilize the Na+/ K+-ATPase’s activity in PTECs in high glucose environment.Therefore, it may play a role in kidney protection.

Liraglutide；Proximal tubule epithelial cells；Na+/ K+-ATPase；Inflammation； Toll-like receptor 4

2014-07-23

2014-10-10

*漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校自然科學(xué)研究資助項目(2013-S-LMC24)

王興紅(1981-)，女，山東臨沂人，講師，碩士，研究方向：糖尿病腎病的發(fā)病機制與防治。電話：(0)15839575585，E-mail：xinghong0124@163.com。

R977.15； R587.1

A

1004-0781(2015)08-0998-04