駱中華，呂飛

(華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬普愛醫(yī)院消化科，武漢 430035)

小檗堿對大鼠肝硬化肝組織IFN-γ表達與端粒酶活性的影響

駱中華，呂飛

(華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬普愛醫(yī)院消化科，武漢 430035)

目的 探討小檗堿抑制血吸蟲肝硬化組織惡性變潛能的作用及其機制。方法 將80只大鼠感染日本血吸蟲尾蚴，隨機分為A、B、C、D組，每組20只。模型對照組(A組)不作任何治療；吡喹酮組(B組)感染尾蚴6周后給予吡喹酮500 mg·kg-1·d-1灌胃2 d；小檗堿組(C組)感染尾蚴6周后給予小檗堿150 mg·kg-1·d-1灌胃6周；小檗堿+吡喹酮組(D組)在感染尾蚴6周后給予吡喹酮500 mg·kg-1·d-1灌胃2 d，再以小檗堿150 mg·kg-1·d-1灌胃6周。另取10只大鼠作為正常對照組(E組)。第12周末分別留取各組大鼠肝組織，檢測肝臟Ⅰ、Ⅲ型膠原及干擾素-γ(IFN-γ)含量、端粒酶活性與端粒酶反轉錄酶(TERT)表達情況。結果 與A組比較，B組和C組肝纖維化程度均減輕，肝組織IFN-γ含量顯著升高，端粒酶活性與TERT表達水平降低(P<0.05)。與B組比較，C組大鼠肝纖維化程度、IFN-γ含量及端粒酶活性、TERT表達水平無明顯差異(P>0.05)。與B組、C組比較，D組大鼠肝纖維化程度進一步減輕，肝組織IFN-γ含量顯著升高(P<0.05)，端粒酶活性及TERT表達水平顯著降低(P<0.05)。結論 小檗堿可通過調(diào)節(jié)大鼠肝組織內(nèi)免疫應答，促進IFN-γ表達，抑制肝組織TERT表達及端粒酶活性，可配合吡喹酮對大鼠晚期血吸蟲肝硬化起協(xié)同、增效作用。

小檗堿；吡喹酮；干擾素-γ；肝硬化；血吸蟲；端粒酶反轉錄酶；端粒酶

日本血吸蟲肝病與肝癌的關系日益受到關注。流行病學和動物實驗資料均表明，血吸蟲感染在肝組織惡變中起到了某種直接或間接作用，抑制血吸蟲肝纖維化組織惡性變潛能成為防治血吸蟲病不可忽視的重要內(nèi)容之一[1]。小檗堿是黃連的提取物，目前研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿中具有抗肝纖維化、抑制肝癌細胞增殖的作用[2-3]，但未見其作用于血吸蟲肝病的研究報道。筆者在本實驗中以日本血吸蟲尾蚴感染大鼠建立血吸蟲肝纖維化模型，并給予小檗堿治療，觀察治療前后大鼠肝組織Ⅰ、Ⅲ型膠原和干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)含量、端粒酶(telomerase)活性以及端粒酶反轉錄酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)表達變化，探討小檗堿抑制血吸蟲肝纖維化的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 動物 清潔級雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量220～250 g，購自華中科技大學同濟醫(yī)學院動物實驗中心。實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(鄂)2010-0009，動物許可證號：HBDW NO：2008-1015。

1.2 藥物與試劑 鹽酸小檗堿片(東北制藥總廠生產(chǎn)，批號：130136，規(guī)格：每片0.1 g)，吡喹酮片(武漢康隆世紀醫(yī)藥制造有限公司產(chǎn)品，批號：CP2010，含量：99.8%，規(guī)格：每片0.5 g)。上述藥物使用時以0.9%氯化鈉溶液配成懸濁液?？勾笫骉ERT抗體購自美國Santa Cruz公司(批號：SC-68270)。端粒酶重復序列擴增及酶聯(lián)免疫吸附技術(polymerase chain reaction-Telomeric repeat amplification-Enzymek-linked immunosorbent assay,PCR-TRAP-ELISA)試劑盒購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司(批號：11854666910)?？勾笫螈裥湍z原抗體(批號：BA0325)、抗大鼠Ⅲ型膠原抗體(批號：BA0326 )及鏈霉親和素-生物素復合物(strept avidin-biotin complex,SABC)試劑盒(批號：SA1052)均購自武漢博士德生物工程有限公司。 IFN-γ ELISA 試劑盒購于美國PERPTOTECH 公司(批號：400-20)。

1.3 大鼠血吸蟲病肝纖維化模型的建立及分組 將每只大鼠經(jīng)腹部皮膚人工感染血吸蟲尾蚴25條，將感染后的大鼠80只隨機分為A、B、C、D組，每組20只。模型對照組(A組)感染尾蚴后不作任何治療；吡喹酮組(B組)感染尾蚴6周后予吡喹酮500 mg·kg-1·d-1灌胃2 d，qd；小檗堿組(C組)感染尾蚴6周后給予小檗堿150 mg·kg-1·d-1灌胃6周[4]，qd。小檗堿+吡喹酮組(D組)感染尾蚴6周后給予吡喹酮500 mg·kg-1·d-1灌胃2 d，再給予小檗堿150 mg·kg-1·d-1灌胃6周，qd。另取10只大鼠作為正常組(E組)。E組大鼠同時灌胃等體積0.9%氯化鈉溶液。感染血吸蟲尾蚴后第12周末，A、B、C、D、E組分別存活10，12，13，15，10只，將各組大鼠處死后取相同部位肝組織保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 免疫組化檢測Ⅰ、Ⅲ型膠原 采用SABC法，肝組織標本染色后采用MPZAS-500多媒體彩色病理圖文分析系統(tǒng)，計算平均積分吸光度值(A值)。

1.5 ELISA法檢測肝組織IFN-γ含量 取大鼠肝組織樣本(每份100 mg)，加入0.9%氯化鈉溶液在冰水中勻漿。以3 000×g離心5 min，取上清液，按照IFN-γ試劑盒說明測定IFN-γ含量。

1.6 Western blot 檢測各組肝組織TERT 取大鼠肝組織樣本(每份100 mg)，勻漿、離心后吸取上清液，按照BCA 蛋白含量測定試劑盒說明進行蛋白定量測定。等量蛋白質(zhì)樣品經(jīng)分離后轉移于硝酸纖維素膜(polyviny lidene fluoride,PVDF) 膜，以1：1 500兔抗大鼠TERT單克隆一抗4 ℃靜置孵育過夜，再以1：15 000過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗室溫孵育2 h，暗室用增強化學發(fā)光(enhanced chemilumine scence,ECL)試劑盒發(fā)光顯影，同時檢測β-actin的表達作為內(nèi)參對照。圖片經(jīng)吸光度圖像掃描儀(HP) 掃描，以Quantity One 軟件對結果進行分析，檢測各組大鼠肝組織TERT與β-actin表達灰度的比值。

1.7 PCR-TRAP-ELISA法檢測端粒酶活性 取大鼠肝組織(每份150 mg)，研碎，離心，取上清液進行聚合酶鏈反應，按照試劑盒說明書進行操作。分別測定樣品與陽性對照在波長450及630 nm處A值。端粒酶相對活性=(樣本A450-A630/陽性對照A450-A630)×150。

2 結果

2.1 肝組織Ⅰ、Ⅲ型膠原含量 E組大鼠肝組織無明顯膠原著色。A組、B組及C組肝內(nèi)Ⅰ、Ⅲ型膠原呈棕黃色，密集片狀，主要分布在蟲卵肉芽腫內(nèi)及匯管區(qū)。與A組比較，B組、C組大鼠肝組織Ⅰ、Ⅲ型膠原含量顯著下降(P<0.05)。D組肝組織Ⅰ、Ⅲ型膠原含量亦顯著下降(P<0.01)。與B組比較，C組大鼠肝組織Ⅰ、Ⅲ型膠原含量無明顯差異(P>0.05)，D組Ⅰ、Ⅲ型膠原含量較B組、C組顯著下降(P<0.05)，見圖1，2及表1。

2.2 肝組織IFN-γ含量 與A組比較，B組、C組大鼠肝組織IFN-γ含量均明顯升高(P<0.05)。D組肝組織IFN-γ含量亦明顯升高(P<0.01)。與B組比較，C組大鼠肝組織IFN-γ含量無明顯變化(P>0.05)。與B組、C組比較，D組大鼠肝組織 IFN-γ含量顯著升高(P<0.05)(表2)。

2.3 肝組織TERT表達 與A組比較，B組、C組肝組織TERT含量均顯著下降(P<0.05)；與B組比較，C組肝組織TERT含量無明顯下降(P>0.05)，而D組肝組織TERT含量較B組、C組均顯著下降(P<0.05)(圖3，表2)。

2.4 肝組織端粒酶活性 與A組比較，B組、C組肝組織端粒酶活性均顯著下降(P<0.05)；與B組比較，C組肝組織端粒酶活性無明顯下降(P>0.05)，而D組肝組織端粒酶活性較B組、C組均顯著下降(P<0.05)(表2)。

3 討論

大量流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn)，并發(fā)感染日本血吸蟲病的慢性病毒性肝炎患者，肝癌發(fā)病率明顯增高，表明日本血吸蟲感染可促進肝癌發(fā)生[5]。目前研究表明，血吸蟲及其形成的肝臟肉芽腫性炎癥、纖維化是肝癌發(fā)生的高危因素之一。蟲卵肉芽腫導致的炎癥反應可降低細胞免疫功能，促使正常肝細胞中原癌基因p53等變異而成為癌基因和(或)致抑癌基因失活[6]，易導致細胞惡變。

圖1 5組大鼠肝組織Ⅰ型膠原表達情況(×200)

圖2 5組大鼠肝組織Ⅲ型膠原表達情況(×200)

與A比較，*1P<0.05，*2P<0.01；與B組比較，*3P<0.05；與C組比較，*4P<0.05

Compared with group A，*1P<0.05，*2P<0.01; compared with group B，*3P<0.05；compared with group C，*4P<0.05

端粒酶異?；罨前┘毎麩o限增殖的關鍵，90%以上腫瘤細胞中端粒酶活性顯著增加，而正常細胞或組織中幾乎沒有檢測到端粒酶活性。因此端粒酶活性增高是區(qū)別正常細胞和腫瘤細胞的顯著特征，端粒酶活性可用作腫瘤診斷、治療及判斷預后的指標之一[7]。TERT是端粒酶活性的主要催化亞單位，為端粒酶的必需和限速組成成分，僅存于端粒酶陽性表達的細胞中。

圖3 5組大鼠肝組織TERT表達(Western blot )

與A組比較，*1P<0.05，*2P<0.01；與B組比較，*3P<0.05；與C組比較，*4P<0.05

Compared with group A，*1P<0.05，*2P<0.01; compared with group B，*3P<0.05; compared with group C，*4P<0.05

研究發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性肝癌組織中TERT表達較癌旁組織明顯升高，而肝炎組織、肝硬化組織未見明顯TERT表達[8]。

IFN-γ作為Th1細胞的特征性細胞因子，發(fā)揮調(diào)節(jié)細胞免疫應答功能的重要作用[9]。IFN-γ能激活巨噬細胞、NK細胞等直接殺傷癌細胞。IFN-γ可通過抑制癌基因的表達來阻止或減慢腫瘤細胞的轉化過程，從而直接抑制腫瘤細胞生成與生長。研究發(fā)現(xiàn)，可通過促進肝細胞凋亡和細胞周期阻滯抑制肝癌細胞生長[10]。

A組大鼠肝纖維化組織端粒酶活性和TERT 表達明顯增強，提示血吸蟲肝纖維化組織具有產(chǎn)生惡性變的潛能。A組肝組織IFN-γ水平升高考慮可能為血吸蟲成蟲和蟲卵肉芽腫產(chǎn)生的毒性代謝產(chǎn)物誘導免疫應答反應而呈現(xiàn)的反應性增高。吡喹酮治療后血吸蟲肝纖維化組織端粒酶活性和TERT 表達明顯下降，表明吡喹酮可在一定程度上抑制血吸蟲肝纖維化惡性變潛能發(fā)展，其機制可能為吡喹酮通過殺死血吸蟲成蟲、減少毒性代謝產(chǎn)物產(chǎn)生而減輕炎癥反應，促進IFN-γ表達而抑制血吸蟲肝纖維化惡性變潛能進一步發(fā)展。吡喹酮治療后血吸蟲肝纖維化組織端粒酶活性和TERT表達仍明顯高于E組，提示殺蟲治療后有必要盡早加用適宜藥物，以防血吸蟲肝纖維化組織惡性變潛能進一步發(fā)展。

應用小檗堿治療時肝組織IFN-γ表達明顯增高，而TERT表達、端粒酶活性明顯下降，表明小檗堿可通過促進IFN-γ表達降低端粒酶活而發(fā)揮抑制血吸蟲肝纖維化惡性變潛能發(fā)展的作用。較之應用吡喹酮，小檗堿治療端粒酶活性和TERT表達并無明顯下降。由此推測殺蟲治療能減少血吸蟲蟲卵及蟲卵肉芽腫的來源,在抑制血吸蟲纖維化組織惡性變潛能發(fā)展的治療中可能仍發(fā)揮重要作用。值得注意的是，吡喹酮繼之以小檗堿治療可使血吸蟲肝硬化組織中TERT表達和端粒酶活性較之吡喹酮或小檗堿治療明顯下降，推測兩者配合應用在抑制血吸蟲肝硬化惡性變潛能發(fā)展方面可起到協(xié)同、增效作用。

[1] QIU D C， HUBBARD A E， ZHONG B，et al.A matched， case-control study of the association betweenschistosomajaponicum and liver and colon cancers， in rural China[J].Ann Trop Med Parasitol， 2005， 99(1)：47-52.

[2] DOMITROVI R， JAKOVAC H， MARCHESI V V， et al.Resolution of liver fibrosis by isoquinoline alkaloid berberine in CCl4-intoxicated rat is mediated by suppression of oxidative stress and upregulation of MMP-2 expression[J].J Med Food， 2013，16(6)：518-528.

[3] YANG X， HUANG N.Berberine induces selective apoptosis through the AMPK mediated mitochondrial/caspase pathway in hepatocellular carcinoma[J].Mol Med Rep，2013，8(2)：505-510.

[4] 李曉翠，孫丹莉，張予蜀，等.鹽酸小檗堿對大鼠非酒精性脂肪性肝病的干預作用[J].胃腸病學和肝病學雜志，2011，20(2)：107-112.

[5] YOSRY A.Schistosomiasis and neoplasia[J].Contrib Microbiol， 2006，13(1)：81-150.

[6] PUROHIT V， RAPAKA R， KWON O S， et al.Roles of alcohol and tobacco exposure in the development of hepatocellular carcinoma[J].Life Sci， 2013， 92(1)：3-9.

[7] 朱剛劍，李艷.p53、c-Myc在血吸蟲感染的原發(fā)性肝癌患者肝癌組織中的表達及意義[J].胃腸病學和肝病學雜志，2008，17(12)：991-993.

[8] 李恒，李哲，喬曉俊，等.中心體α-微管蛋白、p53蛋白及端粒酶在原發(fā)性肝癌中的表達及相關性[J].山東大學學報(醫(yī)學版)，2013，51(8)：74-81.

[9] 葉建敏.川芎嗪對哮喘患兒外周血Th1/Th2細胞因子的調(diào)節(jié)作用[J].醫(yī)藥導報，2008，27 (5)： 538-539.

[10] LI P，DU Q，CAO Z，et al.Interferon-γ induces autophagy with growth inhibition and cell death in human hepatocellular carcinoma (HCC) cells through interferon-regulatory factor-1 (IRF-1)[J].Cancer Lett，2012，314(2)：213-222.

DOI 10.3870/yydb.2015.03.006

Effects of Berberine on the Expression of IFN-γ and Activity of Telomerase in Rat Liver Cirrhosis Tissue

LUO Zhonghua,LY Fei

(DepartmentofGastroenterology,PuaiHospital,TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430035，China)

Objective To study the inhibitory effect and mechanism of berberine on the malignant potential of liver cirrhosis tissue due to schistosoma. Methods Eighty rats infected withschistosomajaponicumwere equally divided into A， B， C and D groups, twenty rats in each.Group A was taken as model control without any treatment.Group B was treated with praziquantel at 500 mg·kg-1·d-1for 2 days.Group C was treated with berberine at 150 mg·kg-1·d-1for 6 weeks.Group D was treated with berberine at 150 mg·kg-1·d-1for 6 weeks followed by praziquantel treatment at 500 mg·kg-1·d-1for 2 days.Ten rats were taken as normal control group (group E).At 12th week， all rats were sacrificed and parts of liver tissues were preserved.The contents of IFN-γ，typeⅠ collagen， type Ⅲ collagen， telomerase reverse transcriptase (TERT )and the activity of telomerase in liver tissue before and after treatments were detected. Results Compared to the group A， the therapy of praziquantel or berberine singly reduced the contents of typeⅠand type Ⅲ collagens，TERT and the activity of telomerase and greatly raised the content of IFN-γ(P<0.05 ).Compared to the group B， there was no difference on the contents of IFN-γ，typeⅠ collagen，type Ⅲ collagen，TERT and the activity of telomerase in liver tissue between two groups(P>0.05).Compared to the group C or group B， the contents of typeⅠ collagen，type Ⅲ collagen，TERT and the activity of telomerase in liver tissue were obviously reduced and the content of IFN-γ was conspicuously elevated (P<0.05 ) in the group D. Conclusion Berberine can inhibit the malignancy by inhibiting the expression of TERT and the activity of telomerase via regulating immune response and promoting the expression of IFN- γ in liver tissue.Berberine may be used in symergism with the insecticidal treatment for advanced schistosomal hepatic cirrhosis.

Berberine；Praziquantel; Interferon-γ；Liver cirrhosis；Schistosomahepaticcirrhosis； Telomerase reverse transcriptase；Telomerase

2014-02-06

2014-03-10

駱中華(1969-)，男，湖北武漢人，副主任醫(yī)師，學士，研究方向：肝臟疾病防治。E-mail：tomz120@163.com。

R282.7；R965

A

1004-0781(2015)03-0306-04