王國(guó)強(qiáng)，梁兆豐，班俊峰，鄧廣漢，林嘉成，呂竹芬

(1.廣東省藥物新劑型重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東藥學(xué)院藥物研究所，廣州 510006；2.廣東藥學(xué)院圖書(shū)館，廣州 510006)

兩種曲安奈德新型脂質(zhì)載體經(jīng)皮滲透性比較*

王國(guó)強(qiáng)1，梁兆豐1，班俊峰2，鄧廣漢1，林嘉成1，呂竹芬1

(1.廣東省藥物新劑型重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東藥學(xué)院藥物研究所，廣州 510006；2.廣東藥學(xué)院圖書(shū)館，廣州 510006)

目的 比較曲安奈德(TAA)納米脂質(zhì)組裝體(TAA-LPPs)、TAA乙醇脂質(zhì)體(TAA-Ethosomes)的體外透皮特性。方法 制備TAA-LPPs和TAA-Ethosomes，采用透射電鏡觀察其形態(tài)，激光粒度儀測(cè)定其粒徑分布，改良Franz單室擴(kuò)散池進(jìn)行離體大鼠皮膚滲透實(shí)驗(yàn)，測(cè)定兩種曲安奈德脂質(zhì)載體的累積透過(guò)量及在皮膚內(nèi)的滯留量。結(jié)果 TAA-LPPs和TAA-Ethosomes均呈球形或類球形，平均粒徑分別為(99.9±1.3)和(105±1.4) nm。TAA-LPPs、TAA-Ethosomes和TAA-混懸液的累積透過(guò)量分別為(53.59±4.40)，(87.03±4.87)，(30.54±8.61) μg·(cm2)-1，32 h后皮膚內(nèi)藥物滯留分別為(1.02±0.13)，(0.62±0.08)，(0.55±0.17)μg·(cm2)-1。結(jié)論 與TAA-Ethosomes比較，TAA-LPPs更利于曲安奈德經(jīng)皮局部給藥，減少藥物全身吸收。

曲安奈德；納米脂質(zhì)組裝體；乙醇脂質(zhì)體；經(jīng)皮滲透

曲安奈德(triamcinolone acetonide，TAA)是治療增生性瘢痕的皮質(zhì)類固醇激素藥物[1-2]。其治療一般以瘢痕下注射為主，注射時(shí)會(huì)伴有劇烈疼痛，同時(shí)還會(huì)出現(xiàn)皮膚萎縮、毛細(xì)血管擴(kuò)張等并發(fā)癥。納米脂質(zhì)組裝體(lipoparticles，LPPs)是結(jié)合脂質(zhì)囊泡和納米粒各自特性，具有脂質(zhì)外殼并以納米粒為核心的新型復(fù)式藥物載體[3]，這種復(fù)式包裹的結(jié)構(gòu)具有更高的穩(wěn)定性，加入表面活性劑還可增加磷脂膜的流動(dòng)性，使其具有變形脂質(zhì)體的柔韌性，可增加藥物對(duì)皮膚的透過(guò)。LPPs中的納米粒核心具有長(zhǎng)效緩釋性能，可提高藥物在皮膚角質(zhì)層下的保留，避免更多藥物經(jīng)皮全身吸收，實(shí)現(xiàn)局部給藥治療的效果[4]。乙醇脂質(zhì)體(ethosomes)是由TOUITOU等[5]在1996年提出的一種具有脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)的新型囊泡藥物載體，其透皮速率及皮膚滯留量較普通脂質(zhì)體均顯著提高，是皮膚局部用藥的理想載體。筆者在本實(shí)驗(yàn)制備了TAA-LPPs和TAA-Ethosomes，采用改良Franz單室擴(kuò)散池法對(duì)兩種新型脂質(zhì)載體的體外透皮吸收進(jìn)行對(duì)比評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量180～200 g，購(gòu)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(粵)2013-0020。動(dòng)物合格證號(hào)：No.44005900000555，溫度18～22 ℃，相對(duì)濕度50%～70%，動(dòng)物房常規(guī)飼養(yǎng)1周。

1.2 試藥 TAA原料(天津金匯藥業(yè)，含量：99.9%，批號(hào)：TI101205)；TAA對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，含量：98.8%，批號(hào)：100055-201103)；聚乳酸羥基乳酸共聚物(濟(jì)南岱罡生物科技有限公司，聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly(lactide-co-glycolide)acid，PLGA]乳酸：羥基乙酸=70：30，批號(hào)：2012053011)；大豆卵磷脂S-100(德國(guó)Lipoid公司，批號(hào)：1032591/906)，α-生育酚(阿拉丁試劑有限公司，批號(hào)：23959)，其他試劑均為分析純。

1.3 儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司，DAD檢測(cè)器)；Delsa Nano C激光粒度儀(美國(guó)Beckman Coulter公司)；TK-12B透皮擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)儀(上海鍇凱科技貿(mào)易有限公司)；JEM-100CXII透射電子顯微鏡(日本電子株式會(huì)社)；JY92-II超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技有限公司)。十萬(wàn)分之一天平(感量0.01 mg)和萬(wàn)平之一天平(感量0.1 mg)。

1.4 TAA脂質(zhì)載體的制備

1.4.1 納米脂質(zhì)組裝體混懸液的制備 參考文獻(xiàn)[6]，采用自乳化溶劑揮發(fā)法結(jié)合薄膜分散法制備TAA-LPPs，先取處方量TAA及PLGA溶于丙酮-乙醇中，攪拌下緩慢注入含聚山梨酯-80的水溶液中，繼續(xù)攪拌6 h，揮去溶劑，制得納米粒懸浮液。另取大豆卵磷脂、α-生育酚至圓底燒瓶中，加入適量無(wú)水乙醇溶解，于40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，使其形成脂質(zhì)薄膜層，加入納米粒懸浮液洗脫脂質(zhì)薄膜，直至洗脫完全。冰水浴下超聲3 min，即得(每毫升含TAA 0.5 mg)。

1.4.2 TAA乙醇脂質(zhì)體混懸液的制備 參考文獻(xiàn)[5]，采用注入法制備TAA-Ethosomes。將TAA、大豆卵磷脂和聚山梨酯-80溶于乙醇中，恒溫40 ℃攪拌下緩慢注入純化水，注完后繼續(xù)攪拌10 min，冰水浴下超聲3 min，即得(每毫升含TAA 0.5 mg)。

1.4.3 TAA混懸液的制備 取適量經(jīng)微粉化的TAA混于30%聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)400溶液中，采用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)超聲處理，即得(每毫升含TAA 0.5 mg)。

1.5 TAA脂質(zhì)載體的理化表征

1.5.1 外觀形態(tài) 采用透射電鏡觀察TAA脂質(zhì)載體的形態(tài)，取樣品溶液滴加到專用銅網(wǎng)上，用1.5%磷鉬酸染色后置于電鏡下觀察并拍攝照片。

1.5.2 粒徑分布 將制得的TAA脂質(zhì)載體稀釋適當(dāng)倍數(shù)，采用Delsa Nano C激光粒度儀測(cè)定其粒徑分布。

1.6 TAA分析方法的建立

1.6.1 色譜條件 照《中華人民共和國(guó)藥典》[7]方法。采用Kromasil-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以甲醇-水(525：475)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為240 nm，柱溫40 ℃，流速1.0 mL·min-1，進(jìn)樣量20 μL。

1.6.2 溶液的制備

1.6.2.1 對(duì)照品溶液 取TAA對(duì)照品10.18 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，得203.6 μg·mL-1對(duì)照品貯備液。

1.6.2.2 供試品溶液 分別取TAA-LPPs、TAA-Ethosomes和TAA混懸液各1 mL于Franz擴(kuò)散池的離體皮膚上，按“1.7.2”項(xiàng)條件實(shí)驗(yàn)，分別得到藥物皮膚滲透量和皮膚滯留量的供試品溶液[8]。

1.6.2.3 陰性對(duì)照溶液 取純化水1 mL于Franz擴(kuò)散池離體皮膚，其余同供試品溶液的制備，分別得到藥物皮膚透過(guò)量的陰性對(duì)照溶液和皮膚滯留藥量的陰性對(duì)照溶液。

1.6.3 專屬性實(shí)驗(yàn) 分別取“1.6.2”項(xiàng)對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖(圖1)。陰性對(duì)樣品測(cè)定無(wú)干擾。

1.對(duì)照品溶液；2.TAA-LPPs；3.TAA-Ethosomes，4.TAA混懸液；5.陰性對(duì)照溶液；a.TAA

1.6.4 線性關(guān)系考察 精密量取“1.6.2”項(xiàng)TAA對(duì)照品貯備液適量，分別用甲醇稀釋成濃度為0.254 5，0.509，1.018，5.09，10.18，20.36，40.72 μg·mL-1系列對(duì)照品溶液，按“1.6.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積(A)與濃度(C)進(jìn)行線性回歸。得回歸方程A=208.7C+34.65，(r=0.999 8)。結(jié)果表明，藥物濃度在0.254 5～40.72 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。檢測(cè)限按信噪比3：1計(jì)為1.8 ng·mL-1，定量限按信噪比10：1計(jì)為5.9 ng·mL-1。

1.6.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密量取1 mL TAA-LPPs混懸液于Franz擴(kuò)散池的離體皮膚上，平行6份，按“1.7.2”項(xiàng)條件實(shí)驗(yàn)，32 h后取接收液過(guò)濾后進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得藥物透過(guò)濃度為9.95 μg·mL-1，RSD為6.36%。即單位面積藥物透過(guò)量為54.26 μg·(cm2)-1，RSD為6.36%。

1.6.6 回收率實(shí)驗(yàn) 精密量取 20. 36 μg·mL-1對(duì)照品溶液 1，2，3 mL 各 3 份于 10 mL 量瓶，分別作為低、中、高濃度組，加入“1.6.2”項(xiàng)藥物皮膚透過(guò)量陰性對(duì)照溶液稀釋至刻度。 濾過(guò)，取續(xù)濾液進(jìn)樣測(cè)定，根據(jù)測(cè)得量與加入量的比值計(jì)算各組回收率(n=3)和RSD。結(jié)果低、中、高濃度組回收率(RSD)分別為95.17%(1.33%)， 95.57%(2.53%)，97.52%(1.15%)。

1.6.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取“1.6.5”項(xiàng)下同一供試品溶液，分別于0，1，3，6，9，12，24 h進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得RSD為0.68%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

1.7 透皮擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)

1.7.1 離體大鼠皮膚的制備 將大鼠用乙醚麻醉后斷脊椎處死，用8%硫化鈉溶液作脫毛劑脫毛，脫毛后洗凈殘留脫毛劑。小心剝離大鼠腹部皮膚并刮去皮下脂肪等殘余物，0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本實(shí)驗(yàn)使用SPSS 18.0版統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，應(yīng)用One-Way ANOVA進(jìn)行多組樣本均數(shù)的比較，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 透射電鏡觀察結(jié)果 將所制得的TAA-LPPs、TAA-Ethosomes及TAA混懸液在透射電鏡下觀察，結(jié)果見(jiàn)圖2。結(jié)果可見(jiàn)其形狀規(guī)整，大多數(shù)呈球形或類球形，TAA-LPPs和TAA-Ethosomes的粒徑約100 nm，TAA混懸液粒徑約200 nm。

2.2 粒徑分布測(cè)定結(jié)果 TAA-LPPs、TAA-Ethosomes和TAA混懸液的平均粒徑分別為(99.9±1.3)，(105.0±1.4)，(240.7±2.2) nm，多分散系數(shù)(polydispersity index，PDI)分別為(0.268±0.008)，(0.068±0.003)，(0.464±0.019)，結(jié)果見(jiàn)圖3。三者粒徑分布均呈單一峰，粒徑約100～300 nm，其結(jié)果與透射電鏡結(jié)果一致。

2.3 體外經(jīng)皮滲透實(shí)驗(yàn) 以TAA混懸液為對(duì)照，研究TAA-LPPs和TAA-Ethosomes的經(jīng)皮滲透性質(zhì)，結(jié)果見(jiàn)圖4和表1。從結(jié)果可知，TAA-Ethosomes的32 h透過(guò)量和透皮速率大于TAA-LPPs和TAA混懸液，且隨著時(shí)間的推移透過(guò)量差異越來(lái)越明顯。累積透過(guò)量依次為：TAA-Ethosomes> TAA-LPPs>TAA 混懸液，三者透皮速率及32 h累積滲透量均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。32 h后皮膚內(nèi)藥物滯留量依次為：TAA-LPPs>TAA-Ethosomes>TAA混懸液，TAA-LPPs在皮膚內(nèi)的滯留量大于后兩者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

A.TAA-LPPs(×100 000)；B.TAA-Ethosomes(×100 000)；C.TAA混懸液(×50 000)

A.TAA-LPPs；B.TAA-Ethosomes；C.TAA混懸液

圖4 TAA離體皮膚累積滲透曲線(n=3)

Fig.4 Accumulative transdermal penetration curve of TAAinvitro(n=3)

表1 TAA脂質(zhì)載體的經(jīng)皮滲透特性

Js為穩(wěn)態(tài)透皮速率，Qr和Qs分別為32 h藥物經(jīng)皮累積透過(guò)量和藥物在皮膚內(nèi)滯留量；與TAA混懸液組比較，*1P<0.05；與TAA-Ethosomes組比較，*2P<0.05

Js is the steady percutaneous speed, Qr and Qs is accumulative transdermal penetration and retention amount in the skin respectively；Compared with TAA suspention group，*1P<0.05；compared with TAA-Ethosomes group，*2P<0.05

3 討論

筆者前期實(shí)驗(yàn)中測(cè)得TAA在1%十二烷基硫酸鈉、20%PEG400和20%乙醇0.9%氯化鈉溶液中的溶解度(91.34，522.47和544.66 μg·mL-1)均可達(dá)到TAA的漏槽條件，故在篩選透皮實(shí)驗(yàn)的接收液時(shí)曾嘗試使用以上3種溶液，結(jié)果發(fā)現(xiàn)20%乙醇0.9%氯化鈉溶液具有抑菌防腐的作用，可防止大鼠離體皮膚長(zhǎng)時(shí)間實(shí)驗(yàn)過(guò)程中產(chǎn)生異味或腐爛，故最終選用20%乙醇0.9%氯化鈉溶液作為透皮實(shí)驗(yàn)的接收溶液。

TAA-Ethosomes對(duì)TAA的經(jīng)皮滲透促進(jìn)作用最為顯著，原因是其含有高濃度的乙醇，通過(guò)軟化角質(zhì)層，使離體皮膚緊密排列的脂質(zhì)分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，同時(shí)也可增加磷脂膜的流動(dòng)性和柔韌性，增加藥物對(duì)皮膚的透過(guò)率[9]。

體外經(jīng)皮滲透實(shí)驗(yàn)表明，TAA-Ethosomes的藥物累積透過(guò)量及透皮速率高于TAA-LPPs，但皮內(nèi)藥物滯留量低于TAA-LPPs，因而對(duì)于增生性瘢痕的治療，TAA-LPPs將更有利于TAA的經(jīng)皮局部給藥，減少藥物全身吸收。

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DOI 10.3870/yydb.2015.03.022

Comparison of Transdermal Penetration of Two New Kinds of Triamcinolone Acetonide Lipid Carriers

WANG Guoqiang1，LIANG Zhaofeng1，BAN Junfeng2，DENG Guanghan1，LIN Jiacheng1， LYU Zhufen1

(1.KeyLaboratoryofAdvancedDrugDeliveryofGuangdongProvince/InstituteofMaterialMedica，GuangdongPharmaceuticalCollege，Guangzhou510006，China；2.LibraryofGuangdongPharmaceuticalCollege，Guangzhou510006，China)

Objective To compare transdermal penetration of triamcinolone acetonide liposparticles (TAA-LPPs) and TAA-Ethosomesinvitro. Methods The TAA-LPPs and TAA-Ethosomes were produced and the morphology was observed by transmission electron microscope，particle size was detected by laser particle analyzer.The percutaneous permeabilityinvitrowas tested by modified Franz diffusion pools.The amount of penetrated triamcinolone acetonide and the retention in the skin were determined by HPLC. Results The shape of TAA-LPPs and TAA-Ethosomes was almost spherical with mean diameter of (99.9±1.3) and (105±1.4) nm, respectively.The cumulative transdermal penetration of TAA-LPPs, TAA-Ethosomess and TAA suspension was (53.59±4.40),(87.03±4.87),and (30.54±8.61) μg·(cm2)-1, respectively .The drug retention in the skin after 32 h was (1.02±0.13), (0.62±0.08), (0.55±0.17) μg·(cm2)-1, respectively． Conclusion TAA-LPPs is better for transdermal administration of triamcinolone acetonide by reducing systemic absorption of the drug.

Triamcinolone acetonide；Lipoparticles；Ethosomes；Percutaneous penetration

2013-11-26

2014-01-20

*廣東省教育廳科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(GCZX-A0807)

王國(guó)強(qiáng)(1988-)，男，遼寧丹東人，在讀碩士，主要從事藥物制劑新技術(shù)與新劑型的研究。電話：020-39352513，E-mail:wanggq_88@126.com。

呂竹芬(1965-)，女，教授，主要從事藥物制劑新技術(shù)與新劑型的研究。電話：020-39352506，E-mail: luzhufen@163.com。

R944.9；R986

B

1004-0781(2015)03-0361-05