鄧振雪，張石，解雨婷，曹莉，孫立新

(沈陽(yáng)藥科大學(xué)藥學(xué)院，沈陽(yáng) 110016)

16-妊娠雙烯醇酮脂質(zhì)體凍干制劑的制備與質(zhì)量評(píng)價(jià)*

鄧振雪，張石，解雨婷，曹莉，孫立新

(沈陽(yáng)藥科大學(xué)藥學(xué)院，沈陽(yáng) 110016)

目的 研究16-妊娠雙烯醇酮脂質(zhì)體凍干制劑制備的處方工藝，并對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)。方法 采用薄膜分散-超聲法結(jié)合冷凍干燥技術(shù)制備16-妊娠雙烯醇酮脂質(zhì)體凍干制劑，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)篩選最佳處方和工藝，并進(jìn)行初步質(zhì)量評(píng)價(jià)。結(jié)果 最佳處方工藝為：卵磷脂PC-98T用量為 6.5%(W/V)，卵磷脂PC-98T與膽固醇硫酸鈉的質(zhì)量比為 4：1，水化溫度為 60 ℃，超聲時(shí)間2 min，最佳凍干保護(hù)劑為7.5%葡萄糖。所制凍干制劑平均粒徑(121.3±48.7) nm，Zeta 電位-41.9 mV，包封率(98.7±0.1)%。結(jié)論 該方法制備的16-妊娠雙烯醇酮脂質(zhì)體凍干制劑處方合理，工藝可行，穩(wěn)定性好。

16-妊娠雙烯醇酮；脂質(zhì)體凍干制劑；包封率；穩(wěn)定性

16-妊娠雙烯醇酮(16-dehydropregnenolone，16-DHP)最早發(fā)現(xiàn)于早產(chǎn)新生兒的血清中[1]，是一種較強(qiáng)的17α-羥化酶及15α-還原酶抑制劑[2]，也是一種法尼醇X受體拮抗劑，具有顯著的降血脂活性[3]。目前印度中央藥物研究所(Central Drug Research Institute，CDIR)正在將16-DHP開(kāi)發(fā)成口服降血脂藥。本課題組首次從中藥白英中分離得到16-DHP。進(jìn)一步研究表明，16-DHP在體外對(duì)多種腫瘤細(xì)胞增殖有抑制作用[4]，16-DHP還可通過(guò)激活A(yù)TM-Chk2-p53介導(dǎo)G1期阻滯和線粒體凋亡途徑來(lái)抑制Hela細(xì)胞的生長(zhǎng)[5]。為進(jìn)一步證明16-DHP的抗腫瘤活性，有必要對(duì)其進(jìn)行體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)。但由于16-DHP難溶于水，普通注射劑很難提高給藥劑量[6]。脂質(zhì)體(liposome)具有組織親和性、靶向性、緩釋性、增加藥物溶解度等特點(diǎn)，因而被廣泛用做抗腫瘤藥物載體[7-8]。液態(tài)脂質(zhì)體穩(wěn)定性差，儲(chǔ)存過(guò)程中極易發(fā)生脂質(zhì)體聚集、融合、磷脂氧化，最終導(dǎo)致包裹的藥物泄露。研究表明，將脂質(zhì)體制成凍干制劑可以增加脂質(zhì)體的穩(wěn)定性[8-9]，因此本課題組將16-DHP制成脂質(zhì)體凍干制劑，并對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Elite-L1230高效液相色譜儀，Elite-L2400 紫外檢測(cè)器(日本株式會(huì)社日立高新技術(shù))，NicompTM380動(dòng)態(tài)光散射粒度測(cè)定/Zeta-電位測(cè)定儀(美國(guó) PSS 公司)，TDZ-WS低速臺(tái)式離心機(jī)(湘儀離心機(jī)儀器有限公司)，JEM-2010透射電子顯微鏡(日本電子公司)，電子天平(余姚市金諾天平儀器有限公司，感量0.1 mg)，冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-200A(上海亞榮生化儀器)。

1.2 試藥 16-DHP對(duì)照品(沈陽(yáng)藥科大學(xué)藥物分析實(shí)驗(yàn)室制備液相純化，采用HPLC-DAD法、HPLC-ELSD法和HPLC-MS檢測(cè)，面積歸一化法計(jì)算純度>99.0%，批號(hào)：20120601)；16-DHP原料藥(沈陽(yáng)藥科大學(xué)藥物分析實(shí)驗(yàn)室合成，含量>98.0%，批號(hào)：20120906，20120909，20120912)；天然蛋黃卵磷脂(PC-98T，上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)：EL12004，含量：98.0%)；膽固醇硫酸鈉(sodium cholesteryl sulfate，SCS，湖北鑫源順醫(yī)藥化工有限公司，批號(hào)：2013-06-17，含量：97%)；葡萄糖(上?；瘜W(xué)試劑廠，批號(hào)：20100925，含量：99.5%)；注射用水(沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院藥劑科，注射級(jí)，批號(hào)：20140416)；乙腈(百靈威科技有限公司，色譜純，批號(hào)：L5C0N33)；甲醇和二氯甲烷(山東禹王實(shí)業(yè)有限公司，分析純，批號(hào)分別為201304102和201301053 )；水為純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司，批號(hào)：20130415)。

2 方法與結(jié)果

2.1 16-DHP脂質(zhì)體的制備 稱取PC-98T(6.5%，W/V)、SCS(3.25%，W/V)和16-DHP原料藥置茄形瓶中，加入適量二氯甲烷于35 ℃水浴下微熱使溶解，60 ℃減壓蒸發(fā)除去二氯甲烷，使在瓶壁上形成均勻薄膜。取同溫度磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS，10 mmol·L-1，pH 6.5)適量加入茄形瓶，50 ℃水浴中旋轉(zhuǎn)洗膜至薄膜完全脫落，將制得混懸液在冰水浴中超聲分散3 min，得16-DHP脂質(zhì)體。

2.2 單因素法優(yōu)化16-DHP脂質(zhì)體處方工藝 按照“2.1”項(xiàng)方法制備16-DHP脂質(zhì)體，考察PC-98T用量、PC-98T和SCS的比值、PBS緩沖液pH、水化溫度以及超聲時(shí)間對(duì)脂質(zhì)體的影響。

2.2.1 PC-98T用量 將PC-98T的用量分別設(shè)為3.0%，5.0%，6.5%，8.5%和10%，其他條件不變，制備16-DHP脂質(zhì)體。結(jié)果16-DHP脂質(zhì)體包封率分別為53.76%，78.20%，97.10%，96.40%和95.50%。表明當(dāng)PC-98T的用量>6.5%時(shí)，脂質(zhì)體的包封率趨于穩(wěn)定。

2.2.2 PC-98T和SCS的比值 將處方中PC-98T與SCS的比值分別設(shè)為1：1，2：1，4：1，6：1和8：1，其他條件不變，制備16-DHP脂質(zhì)體。結(jié)果16-DHP脂質(zhì)體包封率分別為88.3%，97.1%，97.7%，97.2%和84.4%。表明當(dāng)PC-98T與SCS的比值在(2：1)～(6：1)的范圍內(nèi)脂質(zhì)體包封率較高，均>97.0%。

2.2.3 PBS緩沖液的pH 將水化過(guò)程中PBS緩沖液的pH分別設(shè)為6.5，7.0，7.4和8.0，其他條件不變，制備16-DHP脂質(zhì)體。結(jié)果16-DHP脂質(zhì)體包封率分別為97.4%，97.4%，98.5%和95.2%。表明PBS緩沖液的pH對(duì)脂質(zhì)體包封率的影響不大，pH為7.4時(shí)，包封率最高，因此確定脂質(zhì)體制備時(shí)PBS緩沖液的pH為7.4。

2.2.4 水化溫度 將水化過(guò)程中的水化溫度設(shè)為30，40，50，60和70 ℃，其他條件不變，制備16-DHP脂質(zhì)體。結(jié)果16-DHP脂質(zhì)體的包封率分別為85.3%，87.8%，97.5%，96.5%和96.3%。表明隨著水化溫度的增加，脂質(zhì)體包封率隨之增加，當(dāng)水化溫度>50 ℃時(shí)，包封率達(dá)到96.0%。

2.2.5 超聲時(shí)間 超聲時(shí)間對(duì)脂質(zhì)體的包封率、粒徑大小和分布均有影響。其他條件不變，制備16-DHP脂質(zhì)體，考察不同超聲時(shí)間對(duì)16-DHP脂質(zhì)體的影響。結(jié)果當(dāng)超聲時(shí)間為1，2，3，4和5 min時(shí)，脂質(zhì)體的包封率分別為71.68%，97.50%，97.40%，95.10%和79.70%。粒徑分布結(jié)果如圖1。當(dāng)超聲時(shí)間超過(guò)3 min時(shí)，脂質(zhì)體粒徑下降到100 nm，不利于藥物在腫瘤組織的分布。超聲時(shí)間為2 min時(shí)，多分散性指數(shù)(polydispersity index，PI)最小，粒徑分布最均勻。綜合考慮粒徑大小、PI值及包封率結(jié)果，超聲時(shí)間確定為2 min。

圖1 超聲時(shí)間對(duì)16-DHP脂質(zhì)體粒徑分布和PI的影響

Fig.1 Effect of ultrasound time on the particle size and PI of 16-DHP liposomes

2.3 正交設(shè)計(jì)法優(yōu)化16-DHP脂質(zhì)體處方工藝 由單因素考察結(jié)果可知，PC-98T用量(A)、PC-98T與SCS比例(B)和水化溫度(C)這3個(gè)因素對(duì)脂質(zhì)體包封率的影響較大，因此擬設(shè)計(jì)L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，按照“2.1”項(xiàng)條件下方法制備16-DHP脂質(zhì)體(PBS的pH為7.4，超聲時(shí)間2 min)，以脂質(zhì)體包封率為考察指標(biāo)篩選最佳處方和工藝參數(shù)。正交實(shí)驗(yàn)因素水平見(jiàn)表2，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3和表4。

表2 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

Tab.3 Results of orthogonal design and analysis

序號(hào)ABCD(空白)包封率/%16．52150197．226．54160298．236．56170397．348．02160396．858．04170197．868．06150297．2710．02170295．4810．04150396．5910．06160196．3K197．696．597．0K297．397．597．1K396．196．996．8R1．5001．0330．267

表4 方差分析結(jié)果

由表3和表4結(jié)果可知，3個(gè)因素對(duì)脂質(zhì)體包封率影響的主次順序?yàn)锳>B>C，其中A因素對(duì)包封率有顯著影響(P<0.05)，B和C因素對(duì)包封率的影響無(wú)顯著性，最佳處方工藝為A1B2C2，即PC-98T的用量為6.5%、PC-98T與SCS的比為4：1、水化溫度為60 ℃。

2.4 處方和工藝驗(yàn)證 采用正交實(shí)驗(yàn)得到的最佳處方與工藝，即A1B2C2，按照“2.1”項(xiàng)操作(PBS的pH為7.4，超聲時(shí)間2 min)制備3批16-DHP脂質(zhì)體，每批20瓶，測(cè)定包封率和粒徑，每批樣品的包封率進(jìn)行3樣本分析，以驗(yàn)證該脂質(zhì)體制備方法的重復(fù)性及處方工藝的合理性，結(jié)果見(jiàn)表5。由表可知，測(cè)得3批樣品的平均粒徑約為120 nm，粒徑分布均勻，包封率均高于實(shí)驗(yàn)中9種處方，證明A1B2C2是最佳制備處方和工藝。

表5 處方和工藝驗(yàn)證結(jié)果

Tab.5 Results of prescription and process validation

±s

2.5 凍干保護(hù)劑的選擇 按照“2.1”項(xiàng)方法以最佳處方工藝(PC-98T用量6.5%，PC-98T與SCS比例4：1，PBS的pH 7.4，水化溫度60 ℃，超聲時(shí)間2 min)制備16-DHP脂質(zhì)體，加入凍干保護(hù)劑，攪拌溶解后，脂質(zhì)體經(jīng)孔徑0.8，0.45，0.22 μm微孔濾膜依次整粒。將16-DHP脂質(zhì)體按每瓶2 mL分裝于西林瓶中，置冷凍干燥機(jī)中，負(fù)壓條件下凍干。使用前每瓶加水2 mL復(fù)溶。以脂質(zhì)體凍干后外觀、復(fù)溶難易程度、復(fù)溶后粒徑和包封率為指標(biāo)，從甘露糖、葡萄糖、乳糖、麥芽糖和海藻糖中篩選出最佳凍干保護(hù)劑，并進(jìn)一步確定凍干保護(hù)劑的濃度。初步篩選的結(jié)果表明葡萄糖的凍干效果最佳，考察添加不同濃度葡萄糖對(duì)凍干效果的影響。測(cè)得16-DHP脂質(zhì)體凍干前的包封率為98.6%，粒徑為(122.2±45.6) nm，PI為0.209，凍干后各參數(shù)結(jié)果見(jiàn)表6。結(jié)果表明，當(dāng)葡萄糖濃度為7.5% 時(shí)凍干效果最佳。

2.6 16-DHP脂質(zhì)體凍干制劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.6.1 脂質(zhì)體的顯微形態(tài)觀察 將復(fù)溶后的16-DHP脂質(zhì)體凍干制劑加水稀釋至適當(dāng)濃度，取適量滴至覆有支持膜的銅網(wǎng)上，用1%磷鎢酸染色，自然干燥，用透射電鏡觀察其形態(tài)，透射電鏡照片見(jiàn)圖2。

2.6.2 粒徑分布及Zeta電位 將復(fù)溶后的16-DHP脂質(zhì)體凍干制劑用水稀釋至適當(dāng)濃度，用Nicomp 380動(dòng)態(tài)光散射粒度/Zeta電位測(cè)定儀檢測(cè)上述液體，結(jié)果表明，脂質(zhì)體Zeta電位為-41.9 mV，粒度分布較均勻，粒徑為(121.3±48.7) nm，PI為0.162。粒徑分布見(jiàn)圖3。

表6 不同濃度凍干保護(hù)劑的效果

圖2 16-DHP脂質(zhì)體凍干制劑復(fù)溶后透射電鏡圖(×30 000)

Fig.2 Transmission electron micrographs of the freeze-dried 16-DHP liposome after redissolution(×30 000)

圖3 16-DHP脂質(zhì)體凍干制劑復(fù)溶后粒徑分布圖

Fig.3 Size distribution of the freeze-dried 16-DHP liposome after redissolution

2.6.3 脂質(zhì)體的含量測(cè)定

2.6.3.1 對(duì)照品溶液制備 取16-DHP對(duì)照品約25 mg，精密稱定，置25 mL量瓶，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 mL置25 mL量瓶，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，配成200.0 μg·mL-1的16-DHP對(duì)照品溶液。

2.6.3.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 色譜柱：Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm， 5 μm)，流動(dòng)相：乙腈-水(65：35)，流速：1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)：238 nm，柱溫：30 ℃，進(jìn)樣體積：20 μL。理論板數(shù)按16-DHP計(jì)算>3 000，分離度>1.5，拖尾因子為1.02。

2.6.3.3 方法學(xué)考察 分別精密吸取空白脂質(zhì)體和16-DHP脂質(zhì)體0.2 mL，置10 mL量瓶，用甲醇破乳并稀釋至刻度，得空白脂質(zhì)體溶液和16-DHP脂質(zhì)體溶液，分別精密吸取空白脂質(zhì)體溶液、16-DHP脂質(zhì)體溶液和對(duì)照品溶液20 μL進(jìn)行色譜分析，考察分析方法的專屬性。結(jié)果顯示16-DHP的保留時(shí)間為10.6 min，輔料對(duì)藥物含量的測(cè)定無(wú)干擾(圖4)。線性關(guān)系考察時(shí)，分別精密吸取200.0 μg·mL-116-DHP對(duì)照品溶液適量，加甲醇稀釋成20.0，40.0，60.0，80.0和100.0 μg·mL-1的16-DHP對(duì)照品溶液。分別精密吸取20 μL，注入色譜儀。以16-DHP的峰面積(A)為縱坐標(biāo)，16-DHP質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程A=4.225×104C-3.571×102，r=0.999 9，表明16-DHP在20.0～100.0 μg·mL-1內(nèi)呈良好線性關(guān)系。取60.0 μg·mL-116-DHP對(duì)照品溶液，按“2.6.3.2”項(xiàng)色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算峰面積的RSD為0.59%，表明色譜系統(tǒng)精密度良好。按“2.6.3.4”項(xiàng)方法平行制備16-DHP供試品溶液6份，按“2.6.3.2”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行分析，記錄峰面積，16-DHP含量的RSD為0.71%，表明方法的重復(fù)性良好；精密吸取空白脂質(zhì)體9份，每份0.2 mL，置10 mL量瓶，分別加入相當(dāng)于處方量80%，100%和120%的16-DHP對(duì)照品溶液，按“2.6.3.4”項(xiàng)方法制備供試品溶液進(jìn)行色譜分析，低、中、高平均回收率分別為99.5%，99.7%和100.3%，RSD分別為 1.1%，1.8%和0.65%；穩(wěn)定性結(jié)果表明，樣品在室溫下放置24 h穩(wěn)定性良好(RSD 1.7%)。

2.6.3.4 16-DHP脂質(zhì)體含量測(cè)定 按照最佳處方工藝制備16-DHP脂質(zhì)體凍干制劑，精密吸取復(fù)溶后的脂質(zhì)體0.2 mL置10 mL量瓶中，加入甲醇破乳并稀釋至刻度，搖勻，得供試品溶液。另取質(zhì)量濃度為60 μg·mL-1的16-DHP對(duì)照品溶液，按“2.6.3.1”項(xiàng)色譜條件分別進(jìn)樣分析，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算脂質(zhì)體中16-DHP的含量。測(cè)得3批脂質(zhì)體樣品的平均含量為(2.993±0.004) mg·mL-1。

2.6.4 脂質(zhì)體包封率的測(cè)定 按照最佳處方工藝制備16-DHP脂質(zhì)體凍干制劑，精密吸取復(fù)溶后的16-DHP脂質(zhì)體0.2 mL，上樣于已填充好的葡聚糖凝膠G-50柱(10 mm×30 mm)上，以純化水為洗脫劑，收集帶有乳光的洗脫液，置10 mL量瓶中，用甲醇破乳并稀釋至刻度，用孔徑0.45 μm濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液按照“2.6.3.2”項(xiàng)下色譜條件分析，測(cè)定并計(jì)算脂質(zhì)體中包裹的藥物量(W包)。另取復(fù)溶后的脂質(zhì)體0.2 mL置10 mL量瓶，同法操作，測(cè)定并計(jì)算脂質(zhì)體中藥物總量(W總)。按下式計(jì)算3批脂質(zhì)體的平均包封率為(98.7±0.1)%。包封率(%)=W包/W總×100%。

2.6.5 脂質(zhì)體凍干制劑穩(wěn)定性研究 按照最優(yōu)處方和工藝制備3批16-DHP脂質(zhì)體凍干制劑，觀察在室溫(25±2) ℃干燥條件下和4 ℃下3個(gè)月內(nèi)樣品的外觀，復(fù)溶難易程度，復(fù)溶后粒徑、包封率和含量有無(wú)顯著改變，結(jié)果見(jiàn)表7。

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，凍干后的16-DHP脂質(zhì)體可在室溫或4 ℃下保存3個(gè)月，外觀、水復(fù)溶的難易程度、平均粒徑，包封率和含量均無(wú)顯著變化。16-DHP凍干脂質(zhì)體在該儲(chǔ)藏條件下比較穩(wěn)定。

3 討論

脂質(zhì)體制備關(guān)鍵是使脂質(zhì)膜形成均勻脂質(zhì)體，達(dá)到需要的粒徑，同時(shí)使被包裹的藥物具有較高的包封率且不易從脂質(zhì)體中滲漏。目前脂質(zhì)體的制備方法有多種，其中薄膜分散法因具有操作簡(jiǎn)單和提高藥物包封率的優(yōu)點(diǎn)，至今仍被廣泛應(yīng)用[10]。本實(shí)驗(yàn)采用薄膜分散-超聲法制備脂質(zhì)體，以4 ℃條件下儲(chǔ)存24 h后脂質(zhì)體是否出現(xiàn)藥物析出現(xiàn)象為指標(biāo)，篩選磷脂(太偉大豆磷脂、E-80蛋黃卵磷脂和PC-98T蛋黃卵磷脂)，膜流動(dòng)性調(diào)節(jié)劑(膽固醇和膽固醇硫酸鈉)和最大載藥量，結(jié)果，當(dāng)以PC-98T蛋黃卵磷脂為脂質(zhì)材料，SCS為膜流動(dòng)性調(diào)節(jié)劑，藥物含量為3 mg·mL-1時(shí)，制得脂質(zhì)體穩(wěn)定性最好，24 h內(nèi)未發(fā)生藥物析出。為得到包封率高且粒徑分布均勻的脂質(zhì)體，本實(shí)驗(yàn)對(duì)脂質(zhì)體處方和工藝的參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明，PC-98T用量為6.5%，PC-98T與SCS的比為4：1，PBS的pH為7.4，水化溫度為60℃，超聲時(shí)間為2 min時(shí)，制得的脂質(zhì)體包封率高，粒徑分布均勻。

1.16-DHP

儲(chǔ)存條件t/d外觀復(fù)溶難易復(fù)溶后粒徑/nmZeta電位/mV包封率/%含量/(mg·mL-1)4℃0白色疏松 較易121．9±2．5-40．2±0．498．3±0．22．971±0．00630白色疏松 較易122．4±1．8-39．4±0．198．0±0．42．963±0．00460白色疏松 較易123．6±2．1-39．3±0．798．1±0．32．965±0．01290白色疏松 較易123．8±1．7-37．9±1．297．7±0．12．960±0．004室溫0白色疏松 較易121．9±2．5-40．2±0．498．3±0．22．971±0．00630白色疏松 較易122．5±2．5-39．5±1．298．4±0．42．969±0．00660白色疏松 較易123．0±1．9-39．4±0．797．9±0．32．971±0．01090白色疏松 較易122．8±2．5-39．1±1．197．6±0．32．965±0．004

為提高脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，筆者在本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用冷凍干燥技術(shù)將16-DHP脂質(zhì)體制成凍干制劑。研究表明凍干保護(hù)劑可以降低藥物和脂質(zhì)體的水解和氧化速率，進(jìn)而保持脂質(zhì)體膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[11]，本實(shí)驗(yàn)考察了加入不同種類和不同濃度凍干保護(hù)劑對(duì)凍干效果的影響，結(jié)果表明加入7.5 %(W/V)葡萄糖作為凍干保護(hù)劑時(shí)凍干效果最佳。

脂質(zhì)體包封率測(cè)定有多種方法[12]，為將脂質(zhì)體與游離藥物分離，本實(shí)驗(yàn)先后考察了透析法、微柱離心法和超速離心法，結(jié)果透析法雖簡(jiǎn)單，但操作費(fèi)時(shí)；應(yīng)用超速離心法時(shí)，由于游離16-DHP水溶性差，難以準(zhǔn)確測(cè)定離心后上清液中游離16-DHP的含量。本實(shí)驗(yàn)采用葡聚糖凝膠G-50微柱離心法，對(duì)脂質(zhì)體基本無(wú)吸附(平均回收率99.6%)，而對(duì)16-DHP的吸附率>99.5%，表明葡聚糖凝膠G-50微柱離心法可將脂質(zhì)體和游離藥物完全分離，可作為包封率測(cè)定中樣品的處理方法。

[1] KOBAYASHI Y，TAGAWA N，SAIKI K，et al.Studies on steroids in fetuses and neonates:identification of 16-dehydropregnenolone in the circulation of preterm neonates [J].Biol Pharm Bull， 1994， 17(11):1501-1504.

[2] LING Y Z，LI J S，KATO K，et al.Synthesis andinvitroactivity of some epimeric 20 α-hydroxy， 20-oxime and aziridine pregnene derivatives as inhibitors of human 17α-hydroxylase/C17，20-lyase and 5α-reductase [J].Bioorg Med Chem， 1998， 6(10):1683-1693.

[3] PRATAP R，GUPTA R C，CHANDER R，et al.Method of treating hyperlipidemic and hyperglycemic conditions in mammals using pregnadienols and pregnadienones:EP， 99302556.8 [P].2000-07-19.

[4] SUN L X，F(xiàn)U W W，REN J，et al.Cytotoxic constituents from solanum lyratum [J].Arch Pharm Res， 2006， 29(2):135-139.

[5] MA E L，ZHAO D M，LI Y C，et al.Activation of ATM-Chk2 by 16-dehydropregnenolone induces G1phase arrest and apoptosis in HeLa cells [J].J Asian Nat Prod Res，2012，14(9)：817-825.

[6] SURYAWANSHI S，WAHAJUDDIN，GUPTA R C，et al.Preclinical pharmacokinetics， dose proportionality， gender difference and protein binding study of 16-dehydropregnenolone， an antihyperlipidemic agent，in rats [J].J Pharm Pharmacol， 2011， 63(1):41-48.

[7] 祁梅芳，李俊麗，劉小平，等.奧沙利鉑長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體制備工藝優(yōu)選[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2013，32(5)：660-663.

[8] 邱立朋，楊磊，龍苗苗，等.注射用奧沙利鉑納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體凍干制劑的工藝優(yōu)選[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2012，31(11):1471-1473.

[9] CHEN C J， HAN D D， CAI C F， et al.An overview of liposome lyophilization and its future potential[J].J Control Release，2010，142(3)：299-311.

[10] 孫慶雪，邵軍，黃桂華.脂質(zhì)體制備方法的選擇[J].中成藥，2010，32(8)： 1397-1401.

[11] WANG T，WANG N，WANG T，et al.Preparation of submicron liposomes exhibiting efficient entrapment of drugs by freeze-drying water-in-oil emulsions [J].Chem Phys Lipids，2011，164(2)：151-157.

[12] 邵紅霞，奉建芳，龍曉英.脂質(zhì)體包封率的測(cè)定方法[J].中南藥學(xué)，2009，7(3)：212-215.

DOI 10.3870/yydb.2015.03.023

Preparation and Quality Evaluation of Lyophilized 16-Dehydropregnenolone Liposome

DENG Zhenxue, ZHANG Shi, XIE Yuting, CAO Li, SUN Lixin

(SchoolofPharmacy，ShenyangPharmaceuticalUniversity，Shenyang110016，China)

Objective To optimize preparation of freeze-dried 16-dehydropregnenolone (16-DHP) liposome and evaluate the quality. Methods The freeze-dried liposome was prepared by rotary-evaporated film-ultrasonication with lyophilization.Single factor experiments and orthogonal design were used to optimize the prescription and preparation，and the quality was evaluated. Results The optimum preparation technics were as follows: the concentration of PC-98T was 6.5% (W/V)， the quantity ratio of PC-98T to cholesteryl sodium sulfate salt was 4：1，hydration temperature was 60 ℃， ultrasonic time was 2 min，and the cryoprotectant was 7.5% glucose.The average particle size， Zeta potential and encapsulation efficiency were (121.3±48.7) nm，-41.9 mV and (98.7±0.1)%， respectively. Conclusion The formulation of freeze-dried 16-DHP liposome is reasonable，the technology is practicable and stable.

16-Dehydropregnenolone; Lyophilized liposome; Encapsulation efficiency; Stability

2014-01-25

2014-02-21

*沈陽(yáng)市科技局項(xiàng)目(F11-148-9-00)；遼寧省高校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)支持計(jì)劃(LT 2012018)

鄧振雪(1988-)，女，黑龍江齊齊哈爾人，在讀碩士，研究方向：藥物新劑型和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。電話：024-23986365，E-mail：dengzhenxue2009@126.com。

孫立新(1967-)，女，滿族，遼寧撫順人，教授，博士，研究方向：藥物質(zhì)量控制方法及藥物代謝動(dòng)力學(xué)。電話：024-23986365，E-mail:slx04@163.com。

R972.6；TQ450.1

B

1004-0781(2015)03-0365-06