張達(dá)娟，郭東暉，王桂忠，李少菁*

(1. 天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院 天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384；2. 廈門(mén)大學(xué) 海洋與地球?qū)W院，福建 廈門(mén) 361005)

海水酸化對(duì)中華哲水蚤全蛋白表達(dá)的影響

張達(dá)娟1，郭東暉2，王桂忠2，李少菁2*

(1. 天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院 天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384；2. 廈門(mén)大學(xué) 海洋與地球?qū)W院，福建 廈門(mén) 361005)

運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)技術(shù)對(duì)暴露于酸化海水中的中華哲水蚤全蛋白進(jìn)行分析，結(jié)果表明，對(duì)照組、CCO20.08%和CCO20.20%處理組中華哲水蚤的雙向電泳圖譜上可以分別分辨出1 191、1 117和946個(gè)蛋白點(diǎn)，選取其中43個(gè)差異蛋白進(jìn)行MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜鑒定，成功鑒定出23個(gè)差異蛋白，這些蛋白主要與蛋白合成和分解、能量代謝、DNA分子修復(fù)以及解毒過(guò)程有關(guān)。

二氧化碳；酸化；中華哲水蚤；蛋白質(zhì)組學(xué)

1 引言

由于人類(lèi)活動(dòng)，尤其是礦物燃料燃燒、植被破壞導(dǎo)致大量溫室氣體排放，二氧化碳(CO2)作為其重要組成部分，在大氣中的濃度已達(dá)到0.038%[1]，至本世紀(jì)末，將升至0.075%。海洋作為重要的碳匯，每年可以吸收CO2排放量的1/3，大量CO2溶于海水，導(dǎo)致其碳酸鹽系統(tǒng)及其他化學(xué)性質(zhì)的改變，海水pH已由工業(yè)化前的8.20下降至2007年的8.10，至本世紀(jì)末將繼續(xù)降低0.3～0.5個(gè)單位[2—3]，這種海水二氧化碳分壓升高、pH降低，碳酸鹽系統(tǒng)發(fā)生改變的現(xiàn)象即為海水酸化(ocean acidification)。

近年來(lái)，很多學(xué)者已開(kāi)展海水酸化對(duì)生物(主要為個(gè)體較大的生物或鈣化生物)影響的研究工作，酸化不僅影響生物的種群組成、群落結(jié)構(gòu)，還影響其生長(zhǎng)、繁殖等一系列生理、生化過(guò)程，并具有一定的種類(lèi)特異性[4—7]。橈足類(lèi)作為海洋浮游動(dòng)物的重要組成部分，在海洋物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)過(guò)程中起承上啟下的作用，而關(guān)于海水酸化對(duì)橈足類(lèi)影響的報(bào)道十分稀少。Kurihara等[8—9]以及Zhang等[10—12]對(duì)酸化條件下幾種橈足類(lèi)的存活率、產(chǎn)卵率、孵化率以及抗氧化能力進(jìn)行過(guò)研究，而橈足類(lèi)對(duì)海水酸化響應(yīng)的分子作用機(jī)制卻未見(jiàn)報(bào)道。本研究運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)的相關(guān)技術(shù)，選取我國(guó)近岸橈足類(lèi)的典型代表種類(lèi)——中華哲水蚤(Calanussinicus)作為受試對(duì)象，研究其在酸化條件下機(jī)體全蛋白表達(dá)情況，尋找并鑒定特異性蛋白及其功能，對(duì)揭示橈足類(lèi)對(duì)海水酸化響應(yīng)的分子機(jī)制具有重要意義。

2 材料與方法

2.1 樣品采集

中華哲水蚤采自廈門(mén)港附近。樣品用大型 (網(wǎng)孔直徑 505 μm)浮游生物網(wǎng)于夜間水平拖網(wǎng)采得。將采集好的樣品在2 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室，立即進(jìn)行挑選、分離，挑選成熟雌性個(gè)體 (挑選標(biāo)準(zhǔn)：活潑、雌性生殖節(jié)飽滿(mǎn))，經(jīng)解剖鏡 (SMZ-140，Motic)鏡檢確定后，暫養(yǎng)于結(jié)晶皿中。實(shí)驗(yàn)海水取自廈門(mén)大學(xué)海洋與地球?qū)W院海洋生物科學(xué)與技術(shù)系活體培養(yǎng)室，經(jīng)砂濾后，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，其鹽度為29～30，pH為8.10～8.24。

2.2 酸化海水制備

將經(jīng)過(guò)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾的海水充分曝氣后分裝到5個(gè)500 mL大小的細(xì)口瓶中，其中1瓶作為對(duì)照，不進(jìn)行通氣處理，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前利用酸堿滴定法測(cè)定海水總堿度、用pH測(cè)定計(jì)測(cè)定pH，其平均pH為(8.17±0.02)。另外2組海水分別通入混合氣體 (廈門(mén)空分特氣實(shí)業(yè)有限公司提供)，其中一組CO2、氮?dú)夂脱鯕夂糠謩e為0.08%、78.92%和21.0%；另一組分別為0.20%、78.80%和21.0%。氣體流量用流量計(jì) (ZBWJ-90，正博)控制在300 mL/min左右，運(yùn)用pH控制器 (pH/ORP-101，HOTEC)控制海水pH，當(dāng)其達(dá)到穩(wěn)定后通氣自動(dòng)停止。

2.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)共設(shè)置CCO20.08%和0.20%兩個(gè)處理組和一個(gè)對(duì)照組 (CCO20.038%)。實(shí)驗(yàn)在500 mL的細(xì)口玻璃瓶中進(jìn)行。添加扁藻 (Platymonassp.)和中肋骨條藻 (Skeletonemacostatum)的混合藻液作為中華哲水蚤的餌料，餌料密度分別為0.5 × 104cell/mL和4 × 104cell/mL。每瓶分別投放50只中華哲水蚤成熟雌體，在自然光照控溫 (16℃)條件下連續(xù)培養(yǎng)4 d，第3 d用相應(yīng)CCO2的海水換水，不添加餌料，并挑出死亡個(gè)體。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，將收集到的中華哲水蚤用MilliQ水清凈后分裝于2 mL離心管中 (每管約50只)，-80℃儲(chǔ)存，待提取總蛋白。

2.4 蛋白的提取與定量

2.4.1 蛋白的提取

(1)向收集到的中華哲水蚤中加入1 mLTrizol裂解液，冰浴超聲波破碎；

(2) 加入三氯甲烷，每使用1 mLTrizol加入200 μL三氯甲烷，震蕩15s后，室溫放置5 min；

(3) 4℃，12 000 g離心15 min，去掉無(wú)色上清液以及乳白色中層沉淀；

(4) 加入300 μL100%乙醇震蕩混勻，4℃，2 000 g離心5 min，取上清液；

(5) 將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，按樣品∶異丙醇=1∶3的量加入異丙醇，震蕩混勻后，-20℃過(guò)夜；

(6) 4℃，14 000 g離心10 min取沉淀；

(7) 向上述沉淀中加入1 mL95%乙醇，震蕩重懸浮后4℃，14 000 g離心10 min，取沉淀，本步驟重復(fù)操作兩遍；

(8) 上述操作結(jié)束后獲得的沉淀即為蛋白，干燥后將其重溶于相應(yīng)量的[7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，4% CHAPS (質(zhì)量體積比)]重溶液中，溶解時(shí)間約為1 h；

(9) 蛋白完全溶解后于16℃，20 000 g離心5 min，取上清液，分裝保存。

2.4.2 蛋白的定量

采用Amersham公司的PlusOneTM2-D Quant Kit進(jìn)行蛋白定量。

2.5 蛋白雙向電泳

2.5.1 等電聚焦電泳

第一向等電聚焦電泳使用18 cm，pH4-7的IPG膠條。按蛋白量為80 μg計(jì)算所需樣品體積，將蛋白樣品與0.003 4 g二硫蘇糖醇(0.01 μg/μL)、1.8 μL IPG緩沖液以及重溶液混合至340 μL 。利用IPGphor3 聚焦儀(GE公司，美國(guó))完成等電聚焦過(guò)程。等電聚焦參數(shù)設(shè)置：50 V，13 h；100 V，2 h；200 V，2 h；500 V，1 h；1 000 V，2 h；4 000 V，2 h；8 000 V，50 000 Vhrs。

2.5.2 膠條平衡和SDS-PAGE垂直電泳

等電聚焦完成后，將膠條轉(zhuǎn)移到裝有平衡緩沖液Ⅰ (5 mL平衡液中含有二硫蘇糖醇 0.05 g)中，15 min后，移入至平衡緩沖液Ⅱ(5 mL平衡液中含有0.125 g 碘乙酰胺)中，15 min后，用TGS (25 mmol/L Tris，192 mmol/L Glycine和0.1% SDS，pH 8.6)潤(rùn)洗膠條后轉(zhuǎn)移至12.5%SDS聚丙烯酰胺凝膠上端，0.5%瓊脂糖封頂液封頂，進(jìn)行第二向SDS-PAGE電泳。電泳參數(shù)為：25 mA，30 min；50 mA至電泳結(jié)束 (2張膠)。

2.6 凝膠染色、圖像掃描與數(shù)據(jù)分析

采用硝酸銀染色法對(duì)凝膠進(jìn)行染色[13]。凝膠用ImageScanner掃描儀(GE公司，美國(guó))采集圖像。掃描后的圖像用ImageMaster凝膠圖像分析軟件(GE公司，美國(guó))分析蛋白點(diǎn)。

2.7 酶解

(1)將挖取所得的差異單白點(diǎn)用MilliQ水沖洗2次后加入200 μL脫色液 (0.16 g硫代硫酸鈉和0.1 g 鐵氰化鉀溶于10 mLMilliQ水中)，于室溫條件下脫色，脫色時(shí)間一般不超過(guò)10 min；

(2)脫色后用MilliQ水沖洗3次，每次10 min；

(3)沖洗后向離心管中加入乙腈200 μL，室溫條件下脫水約10 min，直至膠粒變成白色顆粒；

(4)干燥：將上述乙腈吸出后，于超凈工作臺(tái)中干燥20 min；

(5) 酶解：加入適量的濃度為10 ng/μL的酶液 (溶于10 mmol/L碳酸氫銨的胰蛋白酶)，讓膠粒溶脹，置于4℃冰箱中反應(yīng)30 min；

(6)孵化過(guò)夜：向每個(gè)離心管中加入5～10 μL 10 mmol/L碳酸氫銨溶液，于37℃條件下過(guò)夜，用于質(zhì)譜分析。

2.8 質(zhì)譜分析及蛋白鑒定

0.6 μL樣品與0.6 μL基質(zhì)液(100 mmol/L α-氰基-4-羥基肉桂酸溶解于含有50%乙腈和0.1%的三氟乙酸)充分混合后，加至點(diǎn)樣板上。利用MALDI-TOF/TOFTM5800質(zhì)譜串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(ABI，美國(guó))進(jìn)行質(zhì)譜分析。

將所得的質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過(guò)Matrix Science Ltd公司提供的本地NCBInr數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜索和匹配。

3 結(jié)果

3.1 不同酸化條件下中華哲水蚤蛋白的表達(dá)

利用雙向電泳技術(shù)獲得了酸化條件下中華哲水蚤總蛋白的雙向電泳圖譜，蛋白點(diǎn)呈圓形或橢圓形，大部分點(diǎn)與點(diǎn)之間界限清晰，略有橫向拖尾現(xiàn)象，說(shuō)明雙向電泳譜圖質(zhì)量較高(見(jiàn)圖1)。對(duì)照組、CCO20.08%處理組和CCO20.20%處理組蛋白點(diǎn)數(shù)分別為1 191、1 117和946個(gè)，對(duì)照組與CCO20.08%和CCO20.20%的差異蛋白點(diǎn)數(shù)分別為74和245個(gè)，從中選取表達(dá)差異顯著的43個(gè)點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析。

不同酸化條件細(xì)胞蛋白質(zhì)組的表達(dá)存在差異：一些蛋白的表達(dá)量在不同酸化條件下發(fā)生明顯變化，甚至消失。各差異蛋白點(diǎn)的變化如圖2所示。在CCO20.08%條件下，中華哲水蚤體內(nèi)1號(hào)蛋白的表達(dá)量有所上升，不過(guò)在CCO20.20%時(shí)，表達(dá)量明顯下降。2、3、6、11、12、13、14、16、18、21、22、23、25、30號(hào)蛋白在對(duì)照組和CCO20.08%中表達(dá)量基本一致，不過(guò)在CCO20.20%中表達(dá)量顯著下降。4、34和43號(hào)蛋白在對(duì)照組中基本不表達(dá)，但隨著CCO2的升高，它們的表達(dá)量明顯升高。42號(hào)蛋白在對(duì)照組中不表達(dá)，在CCO20.08%和CCO20.20%處理組中表達(dá)量略有升高。35、36和37號(hào)蛋白的表達(dá)量在對(duì)照組中最高，隨著CCO2的升高，它們的表達(dá)量下降，甚至不表達(dá)。

3.2 差異蛋白的質(zhì)譜鑒定結(jié)果

43個(gè)差異蛋白中，8個(gè)蛋白不能被質(zhì)譜儀檢測(cè)到信號(hào)；12個(gè)蛋白未能搜索到與其相匹配的蛋白，為未知蛋白；其他23種蛋白則發(fā)現(xiàn)了與之同源的蛋白 (其中包括未知功能的假設(shè)蛋白質(zhì))，其表達(dá)情況見(jiàn)圖2，質(zhì)譜鑒定結(jié)果見(jiàn)表1。根據(jù)功能可將檢測(cè)到的蛋白分為以下幾類(lèi)：與蛋白合成和分解有關(guān)的蛋白，如1、4和34號(hào)蛋白；與新陳代謝相關(guān)的蛋白，如35和36號(hào)，主要在機(jī)體能量和物質(zhì)代謝過(guò)程中起作用；與機(jī)體DNA和分子修復(fù)過(guò)程、細(xì)胞周期以及解毒過(guò)程有關(guān)的蛋白，如3、9、13、16、21和30號(hào)蛋白；與肌肉活動(dòng)有關(guān)的蛋白，如23和37號(hào)蛋白等。

4 討論

CCO20.08%處理組與對(duì)照組的差異蛋白點(diǎn) (74個(gè))比CCO20.20%處理組與對(duì)照組的差異蛋白點(diǎn) (214個(gè))少，這說(shuō)明CCO20.08%的酸化海水對(duì)橈足類(lèi)的影響相對(duì)較小，這與我們其他研究結(jié)果相似[10—12]。由于缺乏對(duì)應(yīng)的基因組和蛋白質(zhì)組庫(kù)，本研究中中華哲水蚤的差異蛋白有些為未知蛋白或未知功能蛋白，本文重點(diǎn)針對(duì)已知的幾種蛋白進(jìn)行討論。

橈足類(lèi)的蛋白合成過(guò)程是機(jī)體正?；顒?dòng)的保障，在這個(gè)過(guò)程中，翻譯起始因子和延長(zhǎng)因子起著十分重要的調(diào)節(jié)作用。在本研究中，34號(hào)和1號(hào)蛋白分別為真核翻譯起始因子4A和翻譯延長(zhǎng)因子2，前者解旋酶活性被認(rèn)為是與打開(kāi)mRNA5′端非編碼順序的次級(jí)結(jié)構(gòu)以便募集核糖體有關(guān)；后者可以催化初步形成的肽段發(fā)生構(gòu)象變化，而進(jìn)入下一輪的延長(zhǎng)過(guò)程[14]。酸化條件下，34號(hào)蛋白的表達(dá)量明顯上調(diào)，而1號(hào)蛋白表達(dá)量顯著下降，說(shuō)明中華哲水蚤的蛋白合成收到影響，這一結(jié)果符合Seibel 和Walsh[15—16]的推論。橈足類(lèi)蛋白合成量的降低可引起其生長(zhǎng)和繁殖的變化，尤其需要大量蛋白合成與積累的繁殖過(guò)程受到的影響可能更劇烈。這在一定程度上印證了橈足類(lèi)產(chǎn)卵率隨酸化水平的加劇而降低的現(xiàn)象[10—12]。14號(hào)蛋白為羧基末端蛋白酶，它是一種蛋白翻譯后修飾蛋白。酸化條件下其表達(dá)量明顯下降，可能會(huì)導(dǎo)致蛋白得不到應(yīng)有的加工和修飾而缺失相應(yīng)的功能，從而影響機(jī)體的正常生命活動(dòng)。 Fabry[17]指出，機(jī)體可以通過(guò)抑制一些高耗能過(guò)程來(lái)完成其對(duì)海水酸化的耐受，而其中最為重要的過(guò)程之一即為蛋白合成，本文的結(jié)果支持這一觀點(diǎn)。在酸化條件下，與橈足類(lèi)蛋白合成有關(guān)的蛋白表達(dá)量明顯下降，這可以作為蛋白合成降低的一個(gè)顯著標(biāo)志。

圖1 中華哲水蚤全蛋白雙向電泳圖Fig.1 2D-PAGE analysis of total soluble proteins from C.sinicus

本研究中35號(hào)蛋白是以NADP為輔酶的異檸檬酸脫氫酶(NADP-IDHs)，參與三羧酸循環(huán)過(guò)程，是其4個(gè)關(guān)鍵氧化-還原步驟之一[18]。朱國(guó)萍等[19]指出，NADP-IDHs的最適pH通常略偏堿性，隨著pH的降低，IDHs脫羧酶的活性趨于減弱。35號(hào)蛋白的表達(dá)量在酸化條件下顯著下降，可能是因?yàn)樗峄瘜?duì)機(jī)體正常的物質(zhì)代謝具有抑制作用。36號(hào)蛋白是甘油醛-3-磷酸脫氫酶 (GAPDH)，是糖酵解過(guò)程中的重要催化劑，并可以促進(jìn)有絲分裂過(guò)程中膜融合，并具有修復(fù)DNA的作用。本研究中，其表達(dá)量在酸化條件下明顯下降。如上所述，參與三羧酸循環(huán)和糖酵解主要過(guò)程的兩種蛋白質(zhì)的表達(dá)均在酸化條件下降低，這說(shuō)明酸化對(duì)機(jī)體的物質(zhì)代謝和能量代謝均產(chǎn)生影響，造成機(jī)體能量產(chǎn)量的降低。不過(guò)Hauton等[20]研究指出，酸化 (pH 7.6)條件下培養(yǎng)至成體的鉤蝦，體內(nèi)甘油醛-3-磷酸脫氫酶的表達(dá)量顯著高于在正常海水中培養(yǎng)的個(gè)體。是何原因?qū)е虏煌锓N相同蛋白的表達(dá)量在相似條件下呈現(xiàn)不同情況，還需要深入研究。在酸化條件下，17β-羥基類(lèi)固醇脫氫酶 (6號(hào)蛋白)的表達(dá)量也明顯降低。最初將這種蛋白歸為類(lèi)固醇代謝酶，不過(guò)最近發(fā)現(xiàn)其在線粒體的脂肪酸合成過(guò)程中具有重要作用[21]。其表達(dá)量的降低在一定程度上說(shuō)明橈足類(lèi)脂肪酸合成可能受到酸化的影響，機(jī)體積累能量的能力降低。此外，43號(hào)蛋白是脂酰CoA硫酯水解酶，主要參與磷脂的新陳代謝過(guò)程并可以催化水解高能硫酯鍵，使ADP磷酸化成ATP。其表達(dá)量在酸化條件下明顯升高，說(shuō)明中華哲水蚤機(jī)體在酸化條件下不能維持正常的能量代謝，需要磷脂類(lèi)的大量參與，進(jìn)而保證機(jī)體的正?；顒?dòng)。

圖2 酸化條件下中華哲水蚤特異蛋白點(diǎn)的差異表達(dá)Fig.2 Different expression of specific proteins spots of C.sinicus in acidified-seawater

表1 酸化條件下中華哲水蚤差異蛋白的質(zhì)譜分析

Tab.1 Different expression proteins indentified by MALDI-TOF/TOF inC.sinicusexposed to acidified-seawater

蛋白編號(hào)序列(全氨基酸)類(lèi)似序列g(shù)i編號(hào)理論等電點(diǎn)/分子量測(cè)定等電點(diǎn)/分子量功能1MVNFTVDQIR(853)Eukarytictranslationelongationfactor2gi|282789426 28/95450 296 28/96415 15Regulatedtheproteinsynthesis

續(xù)表1

續(xù)表1

除上述與機(jī)體蛋白合成和基本代謝有關(guān)的蛋白受到酸化影響外，其他一些與細(xì)胞修復(fù)和解毒能力有關(guān)的蛋白的表達(dá)量也有明顯變化。3號(hào)蛋白是基于細(xì)胞色素C的一氧化氮還原酶，將有毒的一氧化氮 (NO)催化還原為無(wú)毒的氧化亞氮 (N2O)，從而消除NO對(duì)細(xì)胞的毒害作用。在酸化條件下，這種蛋白的表達(dá)量顯著下降，在一定程度上說(shuō)明，橈足類(lèi)機(jī)體受到酸化的脅迫作用。16號(hào)蛋白為谷胱甘肽過(guò)氧化物酶，這是一種小分子水溶性蛋白，是機(jī)體內(nèi)重要的Ⅱ相解毒代謝酶，其在酸化條件下的表達(dá)量明顯下調(diào)，解毒能力會(huì)下降，這與我們其他研究結(jié)果相似[10—11]。Todgham和Hofmann[22]對(duì)暴露在酸化海水中96 h后海膽幼體體內(nèi)GST mRNA表達(dá)量進(jìn)行分析后指出，這種解毒酶的mRNA表達(dá)量顯著下降，本文的結(jié)果與此相似。由此可見(jiàn)，酸化會(huì)對(duì)橈足類(lèi)個(gè)體產(chǎn)生氧化損傷，從而對(duì)其他生命過(guò)程產(chǎn)生影響。13號(hào)蛋白為DNA連接酶，在DNA復(fù)制、重組和修復(fù)中起著重要的作用[23]。酸化條件下，這種蛋白的表達(dá)量明顯下調(diào)說(shuō)明機(jī)體分子水平的修復(fù)能力可能降低。上述幾種蛋白均是橈足類(lèi)防御系統(tǒng)中不可缺少的重要蛋白，它們的表達(dá)量下降直接說(shuō)明酸化條件會(huì)明顯降低橈足類(lèi)對(duì)環(huán)境脅迫的抵御能力。根據(jù)相關(guān)研究，酸化對(duì)紫貽貝的噬菌能力有顯著的抑制作用，貽貝持續(xù)的從海水中吸收CO2使其免疫系統(tǒng)逐漸惡化[24]；血碳酸濃度升高導(dǎo)致凡納濱對(duì)蝦處于缺氧狀態(tài)，并降低血細(xì)胞和組織的抑菌能力，使機(jī)體較容易感染細(xì)菌[25]。由此可見(jiàn)，酸化對(duì)生物的影響不僅體現(xiàn)在其對(duì)蛋白合成和新陳代謝的抑制上，而且可以通過(guò)對(duì)其他抵御系統(tǒng)的破壞來(lái)降低其對(duì)環(huán)境變化的耐受能力。

[1] Scheffer M，Carpenter S，F(xiàn)oley J A，et al. Catastrophic shifts in ecosystems[J]. Nature，2001，413(6856): 591-596.

[2] IPCC. A contribution of Working Groups Ⅰ，Ⅱ and Ⅲ to the third assessment report of the intergovernmental panel on climate change[M]. Cambridge: Cambridge University Press，2001.

[3] Royal Society. Ocean acidification due to increasing atmospheric carbon dioxide[M]. London: The Royal Society，2005: 60.

[4] Clark D，Lamare M，Barker M. Response of sea urchin pluteus larvae (Echinodermata: Echinoidea) to reduced seawater pH: a comparison among a tropical，temperate，and a polar species[J]. Marine Biology，2009，156(6): 1125-1137.

[5] Zippay M L，Hofmann G E. Effect of pH on gene expression and thermal tolerance of early life history stages of red abalone (Haliotisrufescens)[J]. Journal of Shellfish Research，2010，29(2): 429-439.

[6] Bradassi F，Cumani F，Bressan G，et al. Early reproductive stages in the crustose coralline algaphymatolithonlenormandiiare strongly affected by mild ocean acidification[J]. Marine Biology，2013，160(8): 2261-2269.

[7] Wall C B，F(xiàn)an T Y，Edmunds P J. Ocean acidification has no effect on thermal bleaching in the coralSeriatoporacaliendrum[J]. Coral Reefs，2014，33(1): 119-130.

[8] Kurihara H. Effects of CO2-driven ocean acidification on the early developmental stages of invertebrates[J]. Marine Ecology Progress Series，2008，373: 275-284.

[9] Kurihara H，Ishimatsu A. Effects of high CO2seawater on the copepod (Acartiatsuensis) through all life stages and subsequent generations[J]. Marine Pollution Bulletin，2008，56(6): 1086-1090.

[10] Zhang D J，Li S J，Wang G Z，et al. Impacts of CO2-driven seawater acidification on survival，egg production rate and hatching success of four marine copepods[J]. Acta Oceanologica Sinica，2011，30(6): 86-94.

[11] Zhang D J，Li S J，Wang G Z，et al. Biochemical responses of the copepodCentropagestenuiremisto CO2-driven acidified seawater[J]. Water Science & Technology，2012，65(1): 30-37.

[12] 張達(dá)娟，李少菁，王桂忠，等. 二氧化碳酸化對(duì)兩種橈足類(lèi)肌肉和卵母細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響[J]. 海洋學(xué)報(bào)，2012，34(3): 127-133.

Zhang Dajuan，Li Shaojing，Wang Guizhong，et al. Impacts of CO2-driven acidified seawater on the muscle and oocyte ultrastructure of two marine copepods[J]. Haiyang Xuebao，2012，34(3): 127-133.

[13] Wang D Z，Lin L，Chan L L，et al. Comparative studies of four protein preparation methods for proteomic study of the dinoflagellateAlexandriumsp. using two-dimensional electrophoresis[J]. Harmful Algae，2009，8(5): 685-691.

[14] Redpath N T，F(xiàn)oulstone E J，Proud C G. Regulation of translation elongation factor-2 by insulin via a rapamycin-sensitive signalling pathway[J]. EMBO Journal，1996，15(9): 2291-2297.

[15] Seibel B A，Walsh P J. Potential impacts of CO2injection on deep-sea biota[J]. Science，2001，294(5541): 319-320.

[16] Seibel B A，Walsh P J. Biological impacts of deep-sea carbon dioxide injection inferred from indices of physiological performance[J]. The Journal of Experimental Biology，2003，206(4): 641-650.

[17] Fabry V J. Ocean science: marine calcifiers in a high-CO2ocean[J]. Science，2008，320(5879): 1020-1022.

[18] Hurley J H，Dean A M，Koshland D E，et al. Catalytic mechanism of NADP+-dependent isocitrate dehydrogenase: implications from the structures of magnesium-isocitrate and NADP+complexes[J]. Biochemistry，1991，30(35): 8671-8678.

[19] 朱國(guó)萍，黃恩啟，趙禙軍. NADP-異檸檬酸脫氫酶的結(jié)構(gòu)與功能[J]. 安徽師范大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版，2007，30(3): 366-371.

Zhu Guoping，Huang Enqi，Zhao Beijun. Structure and function of NADP-Isocitrate dehydrogenase[J]. Journal of Anhui Normal University: Natural Science，2007，30(3): 366-371.

[20] Hauton C，Tyrrell T，Williams J. The subtle effects of sea water acidification on the amphipodGammaruslocusta[J]. Biogeoscience，2009，6: 1479-1489.

[21] Chen Z J，Kastaniotis A J，Miinalainen I J，et al. 17β-Hydroxysteroid dehydrogenase type 8 and carbonyl reductase type 4 assemble as a ketoacyl reductase of human mitochondrial FAS[J]. The FASEB Journal，2009，23(11): 3682-3691.

[22] Todgham A E，Hofmann G E. Transcriptomic response of sea urchin larvaeStrongylocentrotuspurpuratusto CO2-driven seawater acidification[J]. The Journal of Experimental Biology，2009，212(16): 2579-2594.

[23] Tomkinson A E，Vijayakumar S，Pascal J M，et al. DNA ligases: structure，reaction mechanism，and function[J]. Chemical Reviews，2006，106(2): 687-699.

[24] Bibby R，Widdicombe S，Parry H，et al. Effects of ocean acidification on the immune response of the blue musselMytilusedulis[J]. Aquatic Biology，2008，2(1): 67-74.

[25] Burgents J E，Burnett K G，Burnett L E. Effects of Hypoxia and hypercapnic hypoxia on the localization and the elimination ofVibriocampbelliiinLitopenaeusvannamei，the pacific white shrimp[J]. Biological Bulletin，2005，208(3): 159-168.

Proteomic study of the effects of acidified seawater onCalanussinicus

Zhang Dajuan1，Guo Donghui2，Wang Guizhong2，Li Shaojing2

(1.CollegeofFisheries，TianjinAgriculturalCollege，TianjinKeyLaboratoryofAqua-ecologyandAquaculture，Tianjin300384，China; 2.CollegeofOcean&EarthScience，XiamenUniversity，Xiamen361005，China)

This study compared proteim profiles ofCalanussinicuscultured underCCO20.08% andCCO20.20% CO2-acidified seawater for 4 days using a proteomic approach，and identified the differentially expressed proteins. The results are shown that，1 191，1 117 and 946 protein spots ofC.sinicusin control，CCO20.08% andCCO20.20% groups were detected in the two-dimensional electrophoresis gels，respectively. The 43 protein spots were selected based on their differential expression between control andCCO20.08% group，CCO20.20% group，and 23 proteins of which were identified by MALDI-TOF/TOF mass spectrometry. The data demonstrated that these differentially expressed proteins were associated with protein synthesize and proteolysis，energy metabolism，DNA repaired and detoxified of organisms.

carbon dioxide; ocean acidification;Calanussinicus; proteome

10.3969/j.issn.0253-4193.2015.06.010

2014-09-23；

2015-03-27。

國(guó)家自然科學(xué)基金“不同生態(tài)類(lèi)型的海洋橈足類(lèi)對(duì)硅藻的利用與適應(yīng)的生態(tài)遺傳學(xué)研究”面上項(xiàng)目(41276132)。

張達(dá)娟(1981—)，女，天津市人，博士，實(shí)驗(yàn)師，主要從事浮游生物生理生態(tài)學(xué)研究。E-mail:dajuanzhang@163.com

*通信作者：李少菁(1931—)，男，福建省安溪市人，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事海洋浮游生物學(xué)研究。E-mail:zoopecol@xmu.edu.cn

Q178.53

A

0253-4193(2015)06-0097-09

張達(dá)娟，郭東暉，王桂忠，等. 海水酸化對(duì)中華哲水蚤全蛋白表達(dá)的影響[J].海洋學(xué)報(bào)，2015，37(6)：97—105，

Zhang Dajuan，Guo Donghui，Wang Guizhong，et al. Proteomic study of the effects of acidified seawater onCalanussinicus[J]. Haiyang Xuebao，2015，37(6)：97—105，doi：10.3969/j.issn.0253-4193.2015.06.010