李 焱 龔旗煌

（北京大學(xué)物理學(xué)院，北京 100871）

光學(xué)顯微鏡（optical microscope）在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)等眾多科學(xué)技術(shù)以及生產(chǎn)領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用.16世紀(jì)至18世紀(jì)細(xì)胞等生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的重大發(fā)現(xiàn)幾乎都與顯微鏡的重要改進(jìn)分不開.進(jìn)入20世紀(jì)，光學(xué)顯微鏡又有重要突破，分辨能力進(jìn)入納米尺度[1-7].2014年獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)的超分辨熒光顯微鏡，已是名副其實(shí)的“顯納鏡”（nanoscope）.

1 光學(xué)顯微鏡的原理

顯微鏡的發(fā)明，大大提升了人類的觀察能力，打開了人類認(rèn)識(shí)微觀世界的大門.人類感官接收的外部信息中，約90%以上通過(guò)眼睛傳遞給大腦.眼睛看見物體形成視覺的過(guò)程可以簡(jiǎn)化成以下幾步（見圖1）：來(lái)自物體的光穿過(guò)角膜和瞳孔到達(dá)晶狀體后折射，折射光線穿過(guò)玻璃體在視網(wǎng)膜上形成像，再經(jīng)視神經(jīng)傳導(dǎo)至大腦視覺中樞形成視覺.其中黃斑附近視神經(jīng)最發(fā)達(dá)，所以眼睛觀察物體時(shí)，通常將成的像調(diào)節(jié)到黃斑附近.由于瞳孔和晶狀體大小有限，而且感光細(xì)胞也有一定大小，當(dāng)兩個(gè)物點(diǎn)距離太近時(shí)，形成的像斑重疊或落在同一感光細(xì)胞上時(shí)，眼睛便不能分辨.一般人眼的正常角分辨率為1′，對(duì)于眼睛敏感的綠光，兩個(gè)物點(diǎn)在1m處間隔大于0.3mm才能分辨清楚，亦即在明視距離（25cm）處兩個(gè)物點(diǎn)的間距要大于0.08mm才能分辨清楚.因此，人眼要看清整個(gè)長(zhǎng)度僅為0.21mm的柄翅卵蜂等微小物體是極其困難的，但借助顯微鏡卻能做到.

圖1 眼睛成像示意圖

顯微鏡的使用已有400多年的歷史.16世紀(jì)，歐洲的眼鏡業(yè)已經(jīng)很發(fā)達(dá)，放大鏡廣泛使用，磨鏡技術(shù)大大提高，為顯微鏡的出現(xiàn)奠定了基礎(chǔ).1590年，荷蘭和意大利的眼鏡制造者已經(jīng)制造出類似顯微鏡的放大儀器.1610年前后，意大利的伽利略和德國(guó)的開普勒在研究望遠(yuǎn)鏡的同時(shí)，改變物鏡和目鏡之間的距離，得出合理的顯微鏡光路結(jié)構(gòu)，當(dāng)時(shí)的光學(xué)工匠紛紛從事顯微鏡的制造、推廣和改進(jìn).

光學(xué)顯微鏡的成像系統(tǒng)主要由靠近物體的物鏡和靠近眼睛的目鏡組成，如圖2所示.被觀察物體位于物鏡的前焦點(diǎn)外側(cè)附近，經(jīng)物鏡成一倒立的實(shí)像于目鏡前焦點(diǎn)內(nèi)側(cè)附近，這個(gè)中間像經(jīng)目鏡成一放大虛像于明視距離處.常規(guī)顯微鏡最大有效放大倍率接近500倍，分辨能力提升到亞微米.人們借助顯微鏡可以“看見”微米量級(jí)的微小物體.

2 光學(xué)顯微鏡的組成

圖2 光學(xué)顯微鏡成像原理圖

17世紀(jì)中葉，英國(guó)的羅伯特·胡克（Robert Hooke）和荷蘭的列文虎克（Anton van Leeuwenhoek）對(duì)顯微鏡的發(fā)展作出了卓越的貢獻(xiàn).1665年前后，胡克在顯微鏡中加入粗動(dòng)和微動(dòng)調(diào)焦機(jī)構(gòu)、照明系統(tǒng)和承載標(biāo)本片的工作臺(tái).這些部件經(jīng)過(guò)不斷改進(jìn)，成為現(xiàn)代顯微鏡的基本組成部分.常見的光學(xué)顯微鏡一般由載物臺(tái)、聚光照明系統(tǒng)、物鏡和目鏡組成的成像系統(tǒng)和調(diào)焦機(jī)構(gòu)組成.早期的光學(xué)顯微鏡只是光學(xué)元件和精密機(jī)械元件的組合，它以人眼作為接收器來(lái)觀察放大的像.后來(lái)在顯微鏡中加入了攝影裝置，以感光膠片作為可以記錄和存儲(chǔ)的接收器.現(xiàn)代又普遍采用光電元件、電視攝像管和電荷耦合器等作為顯微鏡的接收器，配以微型電子計(jì)算機(jī)后構(gòu)成完整的圖像信息采集和處理系統(tǒng)，如圖3所示.

圖3 光學(xué)顯微鏡的組成

3 光學(xué)顯微鏡對(duì)生物學(xué)發(fā)展的推動(dòng)作用

顯微鏡的發(fā)明極大地促進(jìn)了生物學(xué)和醫(yī)學(xué)等學(xué)科的發(fā)展.1665年，胡克利用顯微鏡觀察軟木的木栓組織上的微小氣孔，并命名為“細(xì)胞”.圖4為胡克顯微鏡.

圖4 胡克顯微鏡

1674年，列文虎克發(fā)現(xiàn)了原生動(dòng)物，并隨后發(fā)現(xiàn)了“細(xì)菌”，創(chuàng)建微生物學(xué)，他還發(fā)明了高倍物鏡的研磨和拋光方法，被稱為“顯微鏡之父”.1833年，布朗 （Brown）通過(guò)顯微鏡觀察紫羅蘭，隨后發(fā)表了對(duì)“細(xì)胞核”的詳細(xì)論述.1857年，寇利克（Kolliker）發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞中的“線粒體”.1879年，佛萊明 （Flemming）發(fā)現(xiàn)了動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂時(shí)，其清晰可見的染色體活動(dòng)過(guò)程.人們借助顯微鏡逐漸描繪出細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，植物葉肉細(xì)胞的立體結(jié)構(gòu)模型如圖5所示.

1888年，以卡嘉爾（Cajal）為首的組織學(xué)家發(fā)展出顯微鏡染色觀察法，為顯微解剖學(xué)奠定了基礎(chǔ).1932年，澤尼克（Zernike）發(fā)明出相襯顯微鏡，可以直接觀察活細(xì)胞和未染色標(biāo)本，他為此在1953年獲得了諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng).1952年，諾馬斯基（Nomarski）發(fā)明了微分干涉相襯光學(xué)顯微鏡，能顯示細(xì)胞等立體影像.1988年，共焦掃描顯微鏡投入使用，不僅可以用于觀察細(xì)胞形態(tài)，也可以用于進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)生化成分的定量分析和實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間活細(xì)胞動(dòng)態(tài)觀察.1990年，發(fā)展了非線性光學(xué)多光子顯微成像技術(shù)，可以獲得生物細(xì)胞、活組織的長(zhǎng)時(shí)間動(dòng)態(tài)三維成像.

4 阿貝衍射極限

雖然光學(xué)顯微鏡發(fā)展迅速，但是人們繼續(xù)提高常規(guī)光學(xué)顯微鏡分辨能力卻遇到了不可逾越的障礙，常規(guī)光學(xué)顯微鏡不能分辨病毒或比其更小的東西，這是受到阿貝衍射極限的限制，如圖6所示.由于衍射的存在，物鏡、眼睛等無(wú)法把光線匯聚成無(wú)限小的點(diǎn)，而只會(huì)在像平面上形成有限大小的艾里斑（中心是很亮的斑，外圍是明暗相間的環(huán)）.光學(xué)儀器成像過(guò)程中，是把物平面上的無(wú)數(shù)微小的點(diǎn)轉(zhuǎn)換成艾里斑，然后再把它們疊加起來(lái)呈現(xiàn)在像平面上.

艾里斑的大小與光學(xué)系統(tǒng)有關(guān)，而能分辨的最小細(xì)節(jié)由瑞利判據(jù)決定.假如物平面上有兩個(gè)點(diǎn)，通過(guò)一個(gè)光學(xué)成像系統(tǒng)后產(chǎn)生兩個(gè)艾里斑.當(dāng)這兩個(gè)點(diǎn)離得較遠(yuǎn)時(shí)，像平面上的艾里斑也會(huì)離得較遠(yuǎn)——此時(shí)我們可以很容易地分辨出物平面上有兩個(gè)點(diǎn).如果把兩個(gè)點(diǎn)逐漸移近，艾里斑也會(huì)隨之接近.當(dāng)這兩個(gè)艾里斑接近到一個(gè)圓斑中心與另一個(gè)圓斑邊緣重合的時(shí)候，我們達(dá)到能夠分辨出有兩個(gè)點(diǎn)的極限（這就叫瑞利判據(jù)）.如果這兩點(diǎn)再接近，像平面上的兩個(gè)艾里斑互相重疊在一起，實(shí)際看起來(lái)成為一個(gè)圓斑，那物平面上的兩個(gè)點(diǎn)就不能分辨了，如圖7所示.早在1872至1873年，阿貝（Ernst Abbe）通過(guò)分析指出，在常規(guī)光學(xué)顯微鏡中，恰能分辨時(shí)兩點(diǎn)的距離約為半波長(zhǎng).可見光中波長(zhǎng)最短的藍(lán)光波長(zhǎng)約400nm，這意味著光學(xué)顯微鏡能分辨出的物體最小距離約0.2μm（200nm）.因此0.2μm 成為光學(xué)顯微鏡能夠達(dá)到的最高分辨率，也就是我們通常所說(shuō)的阿貝衍射極限.細(xì)胞的許多內(nèi)部結(jié)構(gòu)以及大部分病毒的尺寸，都在200nm左右或者更小，常規(guī)光學(xué)顯微鏡就無(wú)能為力了.

圖7 阿貝衍射極限示意圖

5 光學(xué)“顯納鏡”—超分辨熒光顯微鏡

為了繞開阿貝衍射極限的限制，很多人選擇了其他顯微技術(shù)，利用光學(xué)近場(chǎng)掃描技術(shù)或非線性光學(xué)方法，或使用波長(zhǎng)極短的電子顯微鏡（分辨率能達(dá)到0.2nm），但是這些方法不利于活體生物樣品大視角遠(yuǎn)場(chǎng)實(shí)時(shí)觀察.2014年獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)的埃里克·貝齊格、斯特凡·黑爾和威廉·莫納（圖8）獨(dú)辟蹊徑，突破阿貝衍射極限，將分辨能力提升到納米量級(jí)，實(shí)現(xiàn)了超分辨熒光顯微技術(shù)，又大大推動(dòng)了生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的發(fā)展.

圖8 獲得2014年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)的3位科學(xué)家

超分辨率熒光顯微鏡利用了熒光分子的發(fā)光特性.熒光分子能夠吸收一種波長(zhǎng)的光，放射出另外一種波長(zhǎng)的光.熒光分子有一定的壽命，其持續(xù)發(fā)光一段時(shí)間后，將不能繼續(xù)發(fā)光.熒光分子可以是熒光蛋白質(zhì)分子，也可以是有機(jī)分子.

在莫納之前，人們觀測(cè)熒光分子時(shí)都是同時(shí)觀測(cè)到幾百萬(wàn)甚至幾千萬(wàn)個(gè)分子，得到的結(jié)果是其平均統(tǒng)計(jì)結(jié)果.而莫納是第一個(gè)能夠探測(cè)單個(gè)熒光分子的人，在1989年，那是一項(xiàng)偉大的成就.能夠探測(cè)并觀察單個(gè)熒光分子對(duì)于超分辨率顯微鏡極其重要，并啟發(fā)大量化學(xué)家將他們的注意力轉(zhuǎn)向單分子研究，其中一位便是埃里克·貝齊格.雖然單個(gè)熒光分子成像后也是一個(gè)0.2μm的愛里斑，但是在沒(méi)有其他分子存在的情況下，它的中心位置可以通過(guò)大量統(tǒng)計(jì)而精確地定位，定位精度能可以達(dá)到1nm.

莫納的另一個(gè)貢獻(xiàn)是發(fā)現(xiàn)了像控制電燈泡一樣方便地控制熒光蛋白發(fā)光的方法即光激活（photoactivation）.1997年，莫納來(lái)到加州大學(xué)圣迭戈分校，后來(lái)被授予諾貝爾獎(jiǎng).綠色熒光蛋白技術(shù)的發(fā)明人錢永健也在這里任職.錢永健從水母體內(nèi)分離出發(fā)綠色熒光的蛋白，其重要意義在于它能夠讓活體生物體內(nèi)細(xì)胞的其他蛋白質(zhì)同樣變得可見.運(yùn)用基因技術(shù)，科學(xué)家們將這些微小的綠色熒光蛋白與其他類型的蛋白進(jìn)行結(jié)合.這樣，利用綠色熒光作為標(biāo)記，科學(xué)家們便能知道那些被標(biāo)記的蛋白質(zhì)在生物體內(nèi)所處的位置.莫納注意到一種綠色熒光蛋白分子，其熒光可以被隨意地開啟或關(guān)閉.當(dāng)用波長(zhǎng)488nm的光激發(fā)這一蛋白質(zhì)時(shí)，它開始發(fā)出熒光，但過(guò)一會(huì)之后它就熄滅了.此后不管再使用多少光去照射它，這個(gè)蛋白質(zhì)的熒光都已經(jīng)死了.然而如果使用波長(zhǎng)為405nm的光去照射它，這個(gè)蛋白質(zhì)又能再次復(fù)活并發(fā)出熒光.當(dāng)該蛋白質(zhì)被再次激活，它會(huì)再次發(fā)出波長(zhǎng)為488nm的熒光.莫納將這些可以被光激活的蛋白質(zhì)均勻分散到一種凝膠中，這樣其單個(gè)分子之間的距離就能大于阿貝衍射極限所限定的0.2μm的長(zhǎng)度.由于這些分子被分散開來(lái)，一臺(tái)常規(guī)的光學(xué)顯微鏡便可以區(qū)分來(lái)自單個(gè)分子發(fā)出的熒光——它們就像是帶著開關(guān)的微小燈泡.這一發(fā)現(xiàn)顯示了通過(guò)光學(xué)手段操控單個(gè)分子熒光的可能性，解決了兩年多一直困擾著埃里克·貝齊格的問(wèn)題.

貝齊格發(fā)明的超分辨率顯微鏡叫光激活定位顯微鏡（PALM：PhotoActivated Localization Microscopy），利用了莫納發(fā)現(xiàn)的光激活方法.貝齊格利用微弱的405nm激光照射樣品，使得其中極小部分熒光分子能夠發(fā)出熒光.由于這些發(fā)光的熒光分子很稀疏從而相距較遠(yuǎn)，它們的位置能夠精確地確定下來(lái).等這些分子失去活性后，再次照射405nm激光而激活另一小部分熒光分子.重復(fù)這個(gè)過(guò)程即可將樣品中的所有分子定位出來(lái)，從而得到整個(gè)樣品的圖像，其原理如圖9所示.

圖9 單分子熒光顯微原理

溶酶體膜的光激活定位顯微鏡成像與傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡成像的比較如圖10所示，可以看出超分辨光激活定位顯微鏡確實(shí)是“顯納鏡”.

幾乎與貝齊格2006年發(fā)明PALM同時(shí)，哈佛大學(xué)化學(xué)系與物理系的華人教授莊小威也獨(dú)立發(fā)明了另一種超分辨率顯微鏡-隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)顯微鏡 （STORM：STochastic Optical Reconstruction Microscopy）.PALM和STORM這兩種顯微技術(shù)不僅同年，而且原理也基本一致.不同之處在于貝齊格利用的是光激活蛋白，而莊小威使用的是有機(jī)熒光分子對(duì).圖11是常規(guī)顯微鏡和STORM顯微鏡拍攝的線粒體圖像.

圖10 溶酶體膜的顯微成像

圖11 一個(gè)細(xì)胞中的線粒體

黑爾發(fā)明的受激發(fā)射損耗（STED：STimulated Emission Depletion）顯微技術(shù)，直接實(shí)現(xiàn)對(duì)點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)的調(diào)制，能夠?qū)崿F(xiàn)更快的成像速度，對(duì)熒光染料依賴程度低，因此備受關(guān)注.科學(xué)家們利用受激發(fā)射原理可以冷卻熒光分子，即將一束特定激光束對(duì)準(zhǔn)一個(gè)熒光分子，后者立即失去能量并變得黯淡.1994年，黑爾提出了受激發(fā)射損耗顯微技術(shù)的設(shè)想，計(jì)劃采用一束激光來(lái)激發(fā)所有的熒光分子，隨后利用另外一束激光讓所有分子熒光熄滅——那些位于中心位置上納米尺度空間內(nèi)的熒光分子除外.當(dāng)進(jìn)行記錄時(shí)則只記錄下這一納米部分.讓這一光束掃過(guò)整個(gè)樣品表面，并連續(xù)記錄光強(qiáng)信息，就有可能得到一張整體圖像.每次允許發(fā)出熒光的空間區(qū)域越小，最后得到的圖像分辨率便越高.于是，從原理上說(shuō)，對(duì)于光學(xué)顯微成像的極限再也不復(fù)存在了，如圖12所示.

圖12 受激發(fā)射損耗顯微原理

多年以后這項(xiàng)理論才得以在實(shí)踐中被證實(shí).在那段時(shí)間里，黑爾一邊繼續(xù)科研工作，一邊四處奔走籌集科研經(jīng)費(fèi).2000年，他證明了自己的技術(shù)方法在實(shí)際工作中是可行的.當(dāng)時(shí)他對(duì)大腸桿菌進(jìn)行了拍攝，其分辨率是此前任何光學(xué)顯微鏡都未能達(dá)到過(guò)的（圖13）.

圖14是常規(guī)顯微鏡和受激發(fā)射損耗顯微鏡拍攝的一個(gè)人類腦瘤樣本的對(duì)比圖像，不難看出超分辨受激發(fā)射損耗顯微技術(shù)的巨大優(yōu)勢(shì).

圖13 第一張由黑爾使用受激發(fā)射損耗顯微技術(shù)拍攝的大腸桿菌圖像

圖14 一個(gè)人類腦瘤樣本

6 結(jié)語(yǔ)

超分辨熒光顯微技術(shù)是物理思想、化學(xué)方法、光學(xué)技術(shù)和分子探針相結(jié)合的產(chǎn)物，大大提高了人們認(rèn)識(shí)微觀世界的能力，光學(xué)顯微鏡進(jìn)入了“顯納鏡”時(shí)代，并在眾多領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用.光學(xué)顯微鏡不斷帶動(dòng)許多學(xué)科的發(fā)展，現(xiàn)在的功能越來(lái)越強(qiáng)，也必將繼續(xù)促進(jìn)科學(xué)技術(shù)和社會(huì)進(jìn)步.

[1]谷祝平.光學(xué)顯微鏡[M].蘭州：甘肅人民出版社，1985.

[2]光學(xué)顯微鏡網(wǎng)站：http：／／micro.magnet.fsu.edu／primer／index.html

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