王會，吳漢東，劉政

(遼寧醫(yī)學院 食品科學與工程學院，遼寧 錦州 121001)

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根皮素誘導肝癌細胞SMMC-7721凋亡的機制研究

王會，吳漢東，劉政

(遼寧醫(yī)學院 食品科學與工程學院，遼寧 錦州 121001)

目的 研究根皮素對肝癌細胞SMMC-7721凋亡的影響，并探討其機制。方法 以30、60、120 mg/L根皮素培養(yǎng)對數(shù)生長期的肝癌細胞SMMC-7721分別為低、中、高濃度處理組；應用相差顯微鏡觀察凋亡細胞形態(tài)學變化，AO/EB雙熒光染色法觀察經(jīng)根皮素處理的細胞形態(tài)；應用流式細胞儀檢測細胞凋亡率、細胞周期、線粒體膜電位、鈣離子穩(wěn)態(tài)的變化。結果 細胞呈典型的凋亡形態(tài)學變化；根皮素對SMMC-7721細胞有誘導凋亡作用且呈濃度和時間依賴性；細胞周期阻滯于G1期，細胞線粒體膜電位降低，細胞內(nèi)鈣離子濃度增大。結論 根皮素可通過影響細胞周期，降低線粒體膜電位，改變細胞內(nèi)鈣離子平衡來誘導肝癌細胞SMMC-7721凋亡。

根皮素；肝癌細胞SMMC-7721；凋亡

肝癌是全球第五位常見惡性腫瘤，病死率位于第三位。全世界40%左右的肝癌患者集中在中國[1]。目前，由于絕大多數(shù)抗腫瘤藥物較大的不良反應，限制了其療效發(fā)揮和廣泛應用[2]。因此，尋找低毒、安全有效、靶點明確的天然抗腫瘤藥物成為科學界研究的焦點。

根皮素是一種存在于蘋果、梨等水果和多種蔬菜根莖或根皮中的類黃酮物質(zhì)，具有抗菌、抗氧化、抗糖尿病、抗腫瘤以及雌激素樣作用等活性。根皮素能激活蜂窩蛋白激酶，對細胞無序增殖有抑制作用，可用于多種腫瘤的治療[3-4]。根皮素可誘導腸癌細胞凋亡[5]。根皮素可通過抑制糖的跨膜運輸來誘導 B16 小鼠腫瘤 4A5 細胞凋亡[6]，還可以干擾 B16 腫瘤細胞 DNA 的復制，影響 PKC 的活性，從而促進細胞凋亡[7]。但目前關于根皮素誘導肝癌細胞凋亡的研究還很少，本實驗以人肝癌細胞 SMMC-7721為研究對象，探討了根皮素對其凋亡的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞:人肝癌 SMMC-7721細胞株(購自協(xié)和醫(yī)科大學)。

1.1.2 藥品與試劑：根皮素(純度，99.99%；批號：P7912-100MG)、甲基噻唑藍(MTT)、碘化丙啶(PI)、吖啶橙(AO)、溴乙啶(EB)，二甲基亞砜(DMSO)(購自Sigma 公司)；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(均購自GIBCO 公司)；Annexin V-FITC Apoptosis Detection試劑盒，JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒(購自BD公司)。

1.1.3 主要儀器 FC500流式細胞儀(BECKMAN，美國)；TE2000-E激光共聚焦顯微鏡(Nikon，日本)；細胞培養(yǎng)箱(Heraeus，德國)；IX-71倒置相差顯微鏡(Olympus，日本)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 用含10%標準胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞，當培養(yǎng)液顏色變黃時更換培養(yǎng)液，當細胞達到70%～80% 融合度時細胞傳代。

1.2.2 藥物配制及細胞分組處理 根皮素用DMSO(終濃度≤0.05%)溶解，再用基礎培養(yǎng)基稀釋成濃度為8 mg/mL的母液，分裝，置-20 ℃ 冰箱避光保存?zhèn)溆?。取對?shù)生長期細胞，分別換用含有30、60、120 mg/L根皮素的培養(yǎng)液培養(yǎng)至預定時間，記為低、中、高濃度處理組。

1.2.3 細胞形態(tài)學觀察 取對數(shù)生長期形態(tài)比較規(guī)則的細胞，濃度為4.0×105個/孔接種于6孔板，每孔2 mL細胞懸液，孵育12 h，待細胞貼壁融合后，每孔換用含有不同濃度根皮素的培養(yǎng)液處理24 h，并設對照組(用DMSO處理，終濃度≤0.05%)。在倒置相差顯微鏡下觀察其形態(tài)并拍照。

1.2.4 AO/EB復染 6孔板每孔換用含有不同濃度根皮素的培養(yǎng)液處理24 h，并設對照組，然后將培養(yǎng)液棄去，換入新的培養(yǎng)液，每孔2 mL，并將細胞吹打混勻，制成細胞懸液，每孔加入AO、EB各6 μL，并混勻，常溫避光孵育5 min，在共聚焦顯微鏡下觀察其形態(tài)并拍照。

1.2.5 Annexin V-FITC/PI雙標記法檢測凋亡率

Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術分析凋亡率：收集對照組和處理組細胞，(1～5)×105細胞/樣品，每個樣加入100 μL的PBS懸浮細胞，同時加入5 μL AnnexinV-FITC和5 μL PI，混勻。室溫避光孵育7～12 min，400目篩網(wǎng)過濾，流式細胞儀定量檢測。實驗重復3次。

細胞周期檢測：收集對照組和處理組細胞，調(diào)整細胞濃度為(1～5)×105個/樣品，于4 ℃，70% 無水乙醇中孵育12 h。離心去乙醇，PBS漂洗，加入0.5 mL PI染液，4 ℃避光孵育20 min。流式細胞儀上機檢測。實驗重復3次。

線粒體膜電位檢測：收集對照組和處理組細胞，1.0×106個/樣品，加入0.5 mL JC-1染色液，在CO2培養(yǎng)箱避光孵育12 min，用預熱的PBS洗滌，每個樣品加入0.5 mL PBS。過濾，流式細胞儀上機檢測。實驗重復3次。

細胞內(nèi)鈣離子濃度的測定：收集對照組和處理組細胞，調(diào)整細胞濃度至 (1～2)×106個/ mL。加入Fluo-3/Am至終濃度為8～10 μM，于5% CO2、37 ℃，避光孵育20～40 min，搖勻，并設置陰性對照 (不加Fluo-3/Am)。離心，去掉多余染料，用無鈣PBS洗滌2次，然后用無鈣PBS重懸至0.5 mL，流式細胞儀上機檢測。實驗重復3次。

2 結果

2.1 細胞形態(tài)學觀察結果 對照組細胞貼壁生長，排列緊密，細胞立體性好，胞漿飽滿。根皮素處理24 h后，低濃度處理組(30 mg/L)細胞萎縮，胞體縮小，并有碎片；中濃度處理組(60 mg/L)細胞形態(tài)變的模糊不清，凋亡細胞與鄰近細胞脫離；高濃度處理組(120 mg/L)細胞裂解成小的碎片，細胞膜皺縮，胞體縮小，細胞形態(tài)發(fā)生重大變化，出現(xiàn)細胞壞死，見圖1。

圖1 根皮素作用SMMC-7721細胞24 h細胞形態(tài)(×40)Fig.1 Morphology of SMMC-7721 cells after 24 h treatment by phloretin(×40)

2.2 AO/EB復染結果 根據(jù)AO，EB染料性質(zhì)的不同，可見早期凋亡細胞和晚期凋亡細胞。早期凋亡細胞的胞膜通透性較低，溴乙錠不易進入細胞內(nèi)部，細胞呈淡黃色，核染色質(zhì)呈圓珠狀或固縮狀；晚期凋亡的細胞胞膜通透性增大，但未破裂，細胞呈橘紅色，染色濃一些，有些晚期凋亡的細胞已接近壞死，見圖2。

圖2 根皮素作用SMMC-7721細胞24 h后細胞形態(tài)(AO/EB復染，×40)Fig.2 Morphology of SMMC-7721 cells after 24 h treatment by phloretin(AO/EB counterstain，×40)

2.3 Annexin V-FITC/PI雙標記法檢測凋亡率結果 Annexin V-FITC/PI雙標記結合流式細胞術法能夠定量分析細胞凋亡，并可定量分析早期凋亡細胞、晚期凋亡細胞、活細胞和壞死細胞。(12、36、48 h凋亡率數(shù)據(jù)未提供)，隨著根皮素作用時間的延長和濃度的增大，促凋亡效果越顯著，呈現(xiàn)濃度依賴性和時間依賴性，見圖3。

圖3 根皮素作用SMMC-7721細胞凋亡率(n=3)**P<0.01，與對照組相比Fig.3 Apoptosis rate of SMMC-7721 after treatment by phloretin(n=3)**P<0.01，compared with control group

2.4 細胞周期的檢測結果 隨著根皮素濃度的增大，與對照組相比,G1期細胞數(shù)百分比增大(P<0.05)，S期細胞百分比下降(P<0.01)，G2期細胞百分比下降(P<0.05)，表明細胞經(jīng)根皮素處理后增殖停滯在G1期，DNA合成受到阻，這種關系隨著根皮素劑量的增大越明顯，呈現(xiàn)顯著的劑量依賴性。見表1。

組別細胞周期G1(%)S(%)G2(%)對照組53.38±7.3136.83±3.629.8±2.64低濃度處理組(30mg/L)66.49±8.0125.35±2.89**7.95±1.60中濃度處理組(60mg/L)73.77±9.04*13.18±3.76**9.04±2.98高濃度處理組(120mg/L)74.82±9.89*17.18±4.78**6.00±2.04

*P<0.05，**P<0.01，與對照組比較，compared with control group

2.5 細胞線粒體膜電位的檢測結果與對照組比較 各處理組SMMC-7721細胞線粒體膜電位均顯著下降(P<0.01)。見圖4。

圖4 根皮素作用SMMC-7721細胞24 h的線粒體膜電位變化圖**P<0.01，與對照組相比Fig.4 Mitochondrial membrane potential of SMMC-7721 cells after 24 h treatment by phloretin**P<0.01,compared with control group

2.6 細胞內(nèi)鈣離子濃度的測定結果 與對照組比較，各濃度處理組SMMC-7721細胞內(nèi)Ca2+濃度均顯著增大(P<0.01)。見圖5。

圖5 根皮素作用SMMC-7721細胞24 h后Ca 2+濃度變化**P<0.01，與對照組相比Fig.5 Concentrations of intracellular calcium of SMMC-7721 cells after 24 h treatment by phloretin**P<0.01，compared with control group

3 討論

根皮素是一種類黃酮化合物，是一種具有治療腫瘤潛能的天然化合物，根皮素可抑制腫瘤細胞增殖，誘導腫瘤細胞凋亡[8]。根皮素可通過干擾Ⅱ型葡萄糖轉運蛋白來誘導肝癌細胞凋亡[9]。根皮素能夠以線粒體途徑誘導BEL-7402細胞凋亡，且呈現(xiàn)濃度依賴性；能夠干預肝癌細胞粘附、運動及侵襲能力，從而抑制腫瘤細胞轉移[10-11]。

根皮素為芳香環(huán)結構，可插入到DNA雙螺旋分子中，從而阻止 DNA合成，影響細胞周期的分布，使細胞發(fā)生凋亡。通過檢測根皮素作用后細胞周期的分布情況，發(fā)現(xiàn)細胞發(fā)生了G1期阻滯，G2期細胞減少，進入M期的細胞數(shù)量減少，進而抑制了細胞增殖。這為今后開展根皮素誘導肝癌細胞凋亡機理的研究提供了重要實驗依據(jù)。

線粒體與細胞凋亡過程中的許多重要事件密切相關[12]，發(fā)揮著重要作用，線粒體膜電位下降，膜通透性轉運孔開放，通透性增加，致使線粒體內(nèi)的細胞色素C，凋亡誘導因子AIF等進入細胞質(zhì)，啟動凋亡程序[13]。

線粒體膜電位的下降是細胞凋亡早期的標志性事件。根皮素是一種解偶聯(lián)試劑，可以抑制線粒體的氧化磷酸化作用[14]，ATP 合成受阻，能量缺乏，促使細胞凋亡。本研究采用 JC-1標記結合流式細胞儀檢測線粒體膜電位變化，發(fā)現(xiàn)經(jīng)根皮素作用后的SMMC-7721細胞的線粒體膜電位降低。由此可以推測SMMC-7721細胞在經(jīng)根皮素作用后有線粒體膜電位的變化。

在正常細胞中Ca2+主要與蛋白質(zhì)結合封存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體中，游離的Ca2+很少，只是在受到外界刺激時才被釋放出來充當信號分子。幾乎所有細胞的反應，從收縮、胞吐到基因表達、細胞凋亡都被細胞質(zhì)內(nèi)局部或全部游離Ca2+濃度的變化控制。有研究表明游離 Ca2+在細胞內(nèi)的過度積累可以直接導致細胞凋亡的發(fā)生[15]。當根皮素誘導SMMC-7721細胞凋亡時，細胞質(zhì)內(nèi)游離鈣離子濃度升高，Ca2+穩(wěn)態(tài)發(fā)生變化，表明適當濃度的根皮素有較好的誘導 SMMC-7721 細胞凋亡的效果。鈣信號可能是通過線粒體鈣超載和鈣依賴的酶這2種方式來控制凋亡的。

綜上所述，根皮素是通過抑制細胞 DNA 合成，降低線粒體膜和干擾鈣離子穩(wěn)態(tài)來誘導 SMMC-7721 細胞凋亡的。根皮素誘導肝癌細胞凋亡及其機制有待從相關基因及蛋白方面進一步研究。

[1] 趙文靜.三羥基苯甲酸抗肝癌作用及機制研究[D].吉林大學，2009.

[2] 趙瑞杰.紫草素誘導肝癌細胞凋亡及其機制的初步探討[D].西北農(nóng)林科技大學，2010.

[3] 譚飔，周志欽．根皮苷研究進展[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2013，39(8)：182-186.

[4] Setala Kai ME.Composition and method for rational treatment of cancer[P]USA: 4555806,1986-01-21.

[5] Park SY,Kim EJ, Shin HK,et al.Induction of apoptosis in HT-29 colon cancer cells by phloretin[J].J Med Food,2007,10(4):581-586.

[6] Kobori M,Iwashita K,Shinmoto H,et al.Phloretin-induced apoptosis in B16 melanoma 4A5 and HL60 human leukemia cells.[J].Biosci Bioteehnol Bioehem,1999,63(4):719-725.

[7] Kobori M, Shinmoto H,Tsushida T,et al.Phloretin-induced apoptosis in B16 melanoma 4A5 cell by inhibition of glucose transmembrane transport[J].Cancer Lett, 1997,119(2):207-212.

[8] Zhang HT,Feng ZL,Wu J,et al.Sodium butyrate-induced death-associated protein kinase expression promote Ra ji cell morphological change and apoptosis by reducing FAK protein levels[J].Acta Pharmacol Sin,2007,28(11): 1783-1790.

[9] Wu CH,Ho YS, Tsai CY et al.In vitro and in vivo study of phloretininduced apoptosis in human l iver cancer cells involving inhibition of type II glucose transporter[J].Int J Cancer,2009,124(9): 2210-2219.

[10] 羅輝，汪亞君，陳杰．根皮素誘導肝癌 BEL-7402 細胞凋亡[J].南方醫(yī)科大學學報，2008，28(7)：1249-1251.

[11] 羅輝，汪亞君，陳杰．根皮素抑制肝癌細胞惡性表型的研究[J].中藥材，2008，31(7)： 1019-1021.

[12] Amstrong JS.Mitochondrial membrane permeabilization: the sine qua non for cell death[J].Bioessays,2006,28(3): 253-260.

[13] Mohamad N,Gutierrez A,Nunez M.Mitochondrial apoptotic pathways[J].Biocell,2005,29(2): 149-161.

[14] Jonge PD,Wieringa T,Van Putten JP.Phloretin- an uncoupler and an inhibitor of mitochondrial oxidative phosphorylation[J].Biochim Biophys Acta,1983,722(1): 219-225.

[15] Breckenridge DG,Stojanovic M,Marcellus RC,et al.Caspase cleavage product of BAP31 induces mitochondrial fission through endoplasmic reticulum signals,enhancing cytochrome release to the cytosol[J].J Cell Biol,2003,160(7): 1115-1127.

(編校：王冬梅)

Mechanism of phloretin induced the apoptosis of hepatoma carcinoma cell SMMC-7721

WANG Hui, WU Han-dong, LIU Zheng

(College of Food Science and Engineering, Liaoning Medical University, Jinzhou 121001, China)

ObjectiveTo investigate effect of phloretin on apoptotic of hepatoma carcinoma cells SMMC-7721,and explore its mechanisms.MethodsLogarithmic phase of hepatoma carcinoma cells SMMC-7721 were cultured separately with 30, 60, 120 mg/L phloretin, morphological alterations of apoptotic were observed by phase contrast microscopy and AO/EB double fluorescence staining method was used to observe were low，medium and high concentration trentment group,respectively.the cells treated by phloretin.Apoptotic rates, cell cycle progression, mitochondrial trans-membrane potential and intracellular calcium homeostasis were detected by flow cytometry.ResultsCells appeared typical apoptosis morphological alterations.Phloretin induced SMMC-7721 cell line apoptosis in a dosage and duration dependent manner.Cell cycle was arrested at G1 phase, mitochondrial trans-membrane potential decreased, intracellular free Ca2+increased.ConclusionPhloretin induce apoptosis of SMMC-7721 by affecting cell cycle progression, reducing mitochondrial trans-membrane potential and changing intracellular calcium homeostasis.

phloretin; human hepatoma cells SMMC-7721; apoptosis

王會，男，博士，講師，研究方向：細胞凋亡，E-mail：yxlwhx077@163.com。

R735.7

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1005-1678(2015)06-0025-04