汪勇良，竇雁

(浙江省舟山市普陀區(qū)市場監(jiān)督管理局 藥品醫(yī)療器械監(jiān)管科，浙江 舟山 316100)

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高效液相色譜法測定便通膠囊中柚皮苷和新橙皮苷的含量

汪勇良Δ，竇雁

(浙江省舟山市普陀區(qū)市場監(jiān)督管理局 藥品醫(yī)療器械監(jiān)管科，浙江 舟山 316100)

目的 建立便通膠囊中柚皮苷和新橙皮苷的含量測定方法。方法 使用C18色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)，以乙腈-0.1 %磷酸溶液(20:80)為流動相，檢測波長為283 nm，流速1.0 mL/min，柱溫為30 ℃。結(jié)果 液相色譜圖中各組分分離度良好，柚皮苷進(jìn)樣量在0.1147～2.867 μg，新橙皮苷進(jìn)樣量在0.0807～2.0169 μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。2類成分的加樣回收率分別為98.7 %和98.4 %。結(jié)論 本方法專屬性強(qiáng)，檢測靈敏度高，數(shù)據(jù)重現(xiàn)性好，前處理操作簡便，可作為便通膠囊中柚皮苷和新橙皮苷的質(zhì)量控制方法。

便通膠囊；柚皮苷；新橙皮苷；高效液相色譜法

便通膠囊由白術(shù)、肉蓯蓉、當(dāng)歸、桑葚、枳實和蘆薈共6味中藥組成，具有健脾益腎、潤腸通便的功效。常用于脾腎不足，腸腑氣滯所致的便秘。目前該本品執(zhí)行的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為國家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)WS3- 245(Z - 026)- 2005(Z)，標(biāo)準(zhǔn)含量測定項下僅考察了蘆薈苷一種指標(biāo)成分，測定指標(biāo)相對單一，無法全面、有效地反映制劑的內(nèi)在質(zhì)量。鑒于便通膠囊中所含枳實藥材具有破氣消積，化痰散痞的作用，常用于治療積滯內(nèi)停，痞滿脹痛，大便不通，痰滯氣阻等癥，是方中君藥。因此，本研究使用高效液相色譜法建立便通膠囊中柚皮苷和新橙皮苷的含量測定方法，以期作為本制劑質(zhì)量控制的分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑：便通膠囊(武漢健民藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，批號：141108、150330、150513)。

柚皮苷對照品(批號：110722-201312，純度94.7 %)，新橙皮苷對照品(批號：111857-201102，純度99.6 %)均購于中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純；水為重蒸餾水；其他試劑均為分析純。

1.1.2 儀器：Agilent1260液相色譜系統(tǒng) (美國安捷倫公司)；ME204電子天平(梅特勒-托利多儀器公司)；HWS-24電熱數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海一恒)；UC300超聲波清洗機(jī)(中國科學(xué)院聲學(xué)研究所)。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件

① 色譜柱：Agilent Zorbax Extend C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫：30 ℃；檢測波長：283 nm；流動相：乙腈-0.1 %磷酸溶液(20:80)；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。

② 對照品溶液的制備：精密稱取柚皮苷對照品30.28 mg，置于50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為0.5735 mg/mL的柚皮苷對照品貯備液；精密稱取新橙皮苷對照品20.25 mg，置于50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為0.4034 mg/mL的新橙皮苷對照品貯備液；分別精密量取前述對照品貯備液各1、2、5、10、25 mL，置50 mL的容量瓶中，加70 %甲醇至刻度，搖勻，作為工作對照品溶液1#～ 5#。

③ 供試品溶液的制備[1-3]：取本品內(nèi)容物，混勻、研細(xì)，取0.5 g，精密稱定，置回流瓶中，加入70%甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流30 min，取出，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

1.2.2 空白對照溶液：根據(jù)便通膠囊處方工藝制備缺枳實的空白樣品，按“1.2.1”項下“③”供試品溶液制備方法制備空白對照溶液。

1.2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗：精密吸取“1.2”項下供試品溶液、對照品溶液、空白對照品溶液各10 μL，按“1.2.1”項下“①”色譜條件進(jìn)行測定。

1.2.4 線性關(guān)系考察：精密吸取“1.2.1”項下②對照品溶液1#～ 5#各10 μL，按前述色譜條件，依次注入高效液相色譜儀，以對照品的進(jìn)樣量(μg)為x軸，相應(yīng)的色譜峰峰面積為y軸，用最小二乘法進(jìn)行線性回歸。

1.2.5 精密度試驗：取同一份便通膠囊供試品溶液(批號：150330)，按前述色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣5次，測定供試品溶液中柚皮苷和新橙皮苷的峰面積，并計算各色譜峰的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

1.2.6 穩(wěn)定性試驗：按前述色譜條件，取同一份供試品溶液(批號：150330)，分別于制備后的0、2、4、8、12、24 h時進(jìn)樣，測定柚皮苷和新橙皮苷的峰面積，計算RSD。

1.2.7 重復(fù)性試驗：稱取同一批便通膠囊(批號：150330)內(nèi)容物0.5 g為1份，共取6份，按供試品制備方法制備，并按要求分別進(jìn)樣，測定柚皮苷和新橙皮苷的峰面積，計算RSD。

1.2.8 加樣回收試驗：取批號為150330供試品0.25 g為1份，共取9份，精密稱定，分別按比例加入工作對照品溶液5#適量，按前述供試品溶液制備方法制備，依次進(jìn)樣測定柚皮苷和新橙皮苷的色譜峰峰面積，計算加樣回收率。

1.2.9 樣品測定：對所收集到的不同批號供試品進(jìn)行處理，制備成相應(yīng)的供試品溶液，精密吸取上述供試品溶液和工作對照品溶液4#各10 μL分別注入高效液相色譜儀，依法測定，計算各批號供試品中柚皮苷和新橙皮苷的含量。

2 結(jié)果

2.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗 供試品色譜圖中，在與柚皮苷、新橙皮苷對照品色譜峰相同的位置上，顯示相同保留時間的色譜峰，而陰性對照溶液在該保留時間處出無色譜峰出現(xiàn)，說明陰性對照溶液對柚皮苷和新橙皮苷的測定無干擾，供試品色譜中目標(biāo)色譜峰的分離度均不低于1.5，理論板數(shù)按柚皮苷峰計算為4957，說明方法的系統(tǒng)適應(yīng)性良好。見圖1。

圖1 便通膠囊的高效液相色譜圖 1：柚皮苷；2：新橙皮苷Fig.1 HPLC Chromatograms of Biantong Capsule1：naringin; 2：neonaringin

2.2 線性關(guān)系考察 柚皮苷和新橙皮苷的回歸方程分別為y = 2.517×103x+3.694(r=0.9994)，y=3.048×103x+2.811(r=0.9997)。結(jié)果表明，柚皮苷的進(jìn)樣量在0.1147～ 2.867 μg范圍內(nèi)，新橙皮苷的進(jìn)樣量在0.0807～ 2.0169 μg范圍內(nèi)與其色譜峰峰面積呈一定的線性關(guān)系。

2.3 精密度試驗 2組分峰面積的RSD分別為1.4 %和0.9 %，表明試驗所用儀器的精密度符合要求。

2.4 穩(wěn)定性試驗 供試品溶液中柚皮苷和新橙皮苷色譜峰面積RSD分別為1.7 %和1.3 %。證明處理后的供試品溶液中的目標(biāo)成分在制備后的24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 重復(fù)性試驗 測得柚皮苷和新橙皮苷的平均含量分別為7.75 mg/g和5.41 mg/g，RSD值分別為1.1 %，1.7 %，說明本方法的重復(fù)性符合要求。

2.6 加樣回收試驗 其中，柚皮苷平均加樣回收率為 98.7 %(RSD為0.76 %)，新橙皮苷為98.4 %(RSD為0.89 %)，說明本方法準(zhǔn)確度較高，測定結(jié)果可靠。見表1。

表1 回收率試驗(n=9)Tab.1 Results of recovery test (n=9)

2.7 樣品測定 各批號供試品中柚皮苷和新橙皮苷的含量。見表2。

表2 樣品測定結(jié)果(n=3)Tab.2 Results of sample determination(n=3)

3 討論

3.1 提取溶劑及方法的選擇 分別考察了乙醇、50 %乙醇、甲醇、70%甲醇等4種溶劑作為提取溶媒，并考察了加熱回流提取[4]和超聲提取[5]2種提取方式，發(fā)現(xiàn)選用70%甲醇作為提取溶媒時，供試品中柚皮苷和新橙皮苷的含量均較高，表明70%甲醇的提取效率稍高于其他3種溶劑；而加熱回流的提取效果要優(yōu)于超聲提取，故選擇了以70%甲醇為溶劑，采用加熱回流提取對供試品進(jìn)行處理。同時，對加熱回流提取的時間進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)供試品中的柚皮苷和新橙皮苷在加熱回流0.5，1.0和1.5 h時的含量均較接近，表明2種成分在加熱回流0.5 h后即能基本提取完全，故最終確定加熱回流處理30 min。

3.2 色譜條件的選擇和優(yōu)化 考察了甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1 %磷酸溶液2種液相色譜洗脫系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)乙腈- 0.1%磷酸溶液系統(tǒng)可有效縮短供試品中柚皮苷和新橙皮苷的出峰時間，且各色譜峰分離效果理想，色譜峰峰形對稱，故采用乙腈- 0.1 %磷酸溶液作為試驗所使用流動相系統(tǒng)。鑒于柚皮苷和新橙皮苷同屬二氫黃酮類化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，通過二極管陣列檢測器在190～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行全波長掃描，發(fā)現(xiàn)柚皮苷和新橙皮苷在283 nm附近均有最大吸收，而目標(biāo)色譜峰周圍其他雜質(zhì)色譜峰較小，故選用283 nm作為試驗測定波長。

3.3 檢測指標(biāo)的選擇 《中國藥典》將蕓香科植物酸橙和其栽培變種，以及甜橙的干燥幼果統(tǒng)稱為枳實[6]，張越穎通過比較發(fā)現(xiàn)采用酸橙枳實配制的制劑在治療功能性消化不良脾虛氣滯癥的療效優(yōu)于甜橙枳實[7]，這可能與2者所含化學(xué)成分不同有關(guān)，其中新橙皮苷在酸橙中含量豐富，在甜橙中卻無該成分[8]。而其他研究發(fā)現(xiàn)，枳實中以柚皮苷、新橙皮苷為代表的黃酮類成分均可改善功能性消化不良大鼠的胃排空和小腸推進(jìn)[9]，且藥代動力學(xué)研究結(jié)果也證實了枳實黃酮提取物中柚皮苷與新橙皮苷在吸收環(huán)節(jié)存在相互促進(jìn)的作用[10]，在本次試驗中所收集的3批便通膠囊樣品中也均檢出新橙皮苷成分，表明制劑中所使用的是酸橙枳實。因此，選擇以柚皮苷和新橙皮苷作為檢測指標(biāo)，可保證相關(guān)制劑在臨床使用過程中的效果。

綜上本方法專屬性強(qiáng)，檢測靈敏度高，數(shù)據(jù)重現(xiàn)性好，前處理操作簡便，可作為便通膠囊中柚皮苷和新橙皮苷的質(zhì)量控制方法。

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(編校：王冬梅)

Determining the content of naringin and neonaringin in Biantong Capsule by HPLC

WANG Yong-liangΔ, DOU Yan

(Department of Medical Device Supervision, Zhejiang Zhoushan Putuo Market Supervisory Authority, Zhoushan 316100, China)

ObjectiveTo establish an HPLC method for the determination of naringin and neonaringin in Biantong Capsule.MethodsThe HPLC analysis was performed on a Zorbax Extend C18Column(250 mm×4.6 mm，5 μm), Acetonitrile-0.1 % phosphoric acid (20:80)as mobile phase, the detective wavelength was at 283 nm, flow rate was 1.0 mL/min, the column temperature was 30 ℃.ResultsNaringin and neohes peridin showed a good linear relationship with range in 0.1147-2.867 μg, 0.0807-2.0169 μg, respectively. The recovery were 98.7 % and 98.4 %. ConclusionThe method is simple, rapid, accurate and reliable. And it can be applied to control the quality of Biantong Capsule.

Biantong Capsule; naringin; neonaringin; HPLC

汪勇良，通信作者，男，大專，主管藥師，研究方向：藥品檢測鑒定，E-mail：wangyongliang0606@163.com 。

R927.2

A

1005-1678(2015)12-0174-03