周利婷，張四喜，曲曉宇，宋燕青

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院 藥學(xué)部，吉林 長春 130000)

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高糖對血管內(nèi)皮功能的影響研究

周利婷，張四喜，曲曉宇，宋燕青

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院 藥學(xué)部，吉林 長春 130000)

目的 探究高糖對人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vascular endothelial cells，HUVECs)內(nèi)皮功能的影響。方法 體外培養(yǎng)HUVECs并分為正常對照組(NG)、低濃度葡萄糖組(LG)、中濃度葡萄糖組(MG)和高濃度葡萄糖組(HG)，各組培養(yǎng)液中葡萄糖的終濃度分別為5.5、10 、20、30 mmol/L。分別在孵育0、24、48 h后采用MTT法測定細胞活力；Griess法檢測培養(yǎng)液中NO分泌量；收集細胞，western blot法測定內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)的表達。結(jié)果 培養(yǎng)24 h后，與同時間點NG組相比，LG組和MG組細胞活力及 NO含量均顯著降低(P<0.05)，但eNOS的表達無顯著差異；HG組細胞活力、NO含量及eNOS的表達均顯著下降(P<0.01)。培養(yǎng)48 h后，與同時間點NG組相比，LG和MG eNOS的表達分別顯著下降了11.91%(P<0.05)和25.72%(P<0.01)；而HG組細胞活力顯著下降(P<0.05)，NO含量顯著下降(P<0.01)，eNOS的表達下降了34.50%(P<0.01)。細胞培養(yǎng)48 h內(nèi)，NG、LG和MG組的細胞活力呈上升趨勢，而HG的細胞活力呈顯著下降趨勢。結(jié)論 高糖可顯著影響HUVECs的細胞活力，且在高糖環(huán)境下，eNOS表達受到抑制，從而導(dǎo)致NO生成量減少，造成內(nèi)皮細胞功能障礙。

高糖；人臍靜脈內(nèi)皮細胞；內(nèi)皮細胞功能障礙；內(nèi)皮型一氧化氮合酶

心腦血管疾病死亡率居我國所有疾病死亡人數(shù)之首[1]。伴糖尿病的冠心病患者較不伴糖尿病的患者具有更高冠狀動脈疾病的發(fā)病率、致殘率和病死率[2-3]。研究表明，心腦血管疾病和糖尿病具有共同的病理基礎(chǔ)：血管內(nèi)皮功能障礙[4]。而一氧化氮(NO)生物利用度低是造成內(nèi)皮功能障礙的一個重要因素[5]。正常情況下，血管系統(tǒng)中的NO主要源于內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)，具有強烈的舒血管作用，同時具有抑制血小板在血管內(nèi)皮黏附和聚集、抑制平滑肌細胞增殖和抑制內(nèi)皮-單核細胞黏附的作用[6-7]。高血糖環(huán)境下，血管內(nèi)皮細胞發(fā)生病變，其分泌活性隨之改變[4]。因此，本實驗采用不同濃度的葡萄糖誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vascular endothelial cells, HUVECs)內(nèi)皮功能損傷，通過測定細胞活力、NO分泌量及eNOS表達量，探究高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞功能障礙與eNOS相關(guān)的損傷機制。

1 材料與方法

1.1 主要實驗試劑與儀器 原代人臍靜脈內(nèi)皮細胞、內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基及胰蛋白酶/EDTA均購自美國ScienCell公司；D-(+)-葡萄糖(含量98%)購自北京百靈威科技有限公司；eNOS抗體購自Santa Cruz，GAPDH購自杭州賢至；辣根酶標記山羊抗兔IgG及辣根酶標記山羊抗小鼠IgG均購自北京中杉金橋；NO檢測試劑盒購自碧云天生物科技有限公司。預(yù)染蛋白Marker購自MBI公司，ECL發(fā)光液購自Thermo公司。酶標儀(Biotek)；電泳儀(DYCZ-24DN，北京六一儀器廠)；轉(zhuǎn)膜儀(DYCZ-40D，北京六一儀器廠)。

1.2 HUVEC培養(yǎng)及給藥 取生長狀態(tài)良好的3-5代HUVECs均勻接種于6孔板，分為以下4組：①正常對照組(NG)，正常生長于內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)液葡萄糖濃度為5.5 mmol/L；②低濃度葡萄糖組(LG)，培養(yǎng)液中葡萄糖終濃度為10 mmol/L；③中濃度葡萄糖組(MG)，培養(yǎng)液中葡萄糖終濃度為20 mmol/L；④高濃度葡萄糖組(HG)，培養(yǎng)液中葡萄糖終濃度為30 mmol/L。每組重復(fù)數(shù)為6，培養(yǎng)48 h。

1.3 MTT法檢測細胞活力 收集對數(shù)期細胞，調(diào)整細胞懸液濃度并接種于96孔板，5% CO2，37 ℃孵育，至細胞單層鋪滿孔底，加入濃度梯度的葡萄糖溶液。繼續(xù)孵育16～48 h，倒置顯微鏡下觀察。每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL，即0.5% MTT)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入150 μL二甲基亞砜，低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm處測量各孔的吸光值(OD值)。各組細胞存活率=OD實驗組/ODNG組×100%。

1.4 Griess法檢測NO含量 按照其使用說明書操作：①取出Griess Reagent I和II，使回復(fù)室溫。②用待測樣品所用溶液稀釋標準品(1～100 μM)。③按50 μL/孔，在96孔板中加入標準品及樣品。④按50 μL/孔，在各孔中加入室溫Griess Reagent I。⑤按50 μL/孔，各孔中加入室溫Griess Reagent II。⑥540 nm 測定吸光度。

1.5 免疫印跡實驗檢測eNOS表達 抽提細胞樣品，PBS緩沖液清洗3次，然后加入0.3 mL RIPA裂解液。充分裂解后14000 g，20 min 4 ℃。取上清蛋白變性，于-80 ℃保存待用。

將保存的蛋白進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳-濕法轉(zhuǎn)膜-抗體孵育-曝光和顯影，得到的圖片經(jīng)凝膠圖像分析成像系統(tǒng)進行掃描分析，得出條帶灰度值。用目標條帶除以內(nèi)參GAPDH蛋白條帶的灰度值即為目標蛋白的相對表達量

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測高糖對細胞活力的影響 由表1可知，細胞培養(yǎng)24 h后，與同時間點NG組相比， LG和MG組的細胞活力均顯著下降(P<0.05)，而HG組細胞活力下降最顯著(P<0.01)；細胞培養(yǎng)48 h后，NG組細胞活力顯著增加(P<0.05)，與NG組相比，LG、MG組細胞活力沒有顯著差異，而HG組細胞活力均顯著下降(P<0.01)。

表1 高糖對細胞活力的影響Tab.

*P<0.05，與同時間點NG組比較，compared with normal group at same time point

2.2 高糖對HUVECs中NO含量的影響 由圖1可知，細胞培養(yǎng)24 h后，與同時間點NG組相比， LG組的NO的含量均顯著下降(P<0.05)，MG和HG組NO含量分別顯著下降了25.82%和30.59%(P<0.01)；細胞培養(yǎng)48 h后，與NG組48 h相比，LG組NO分泌量無顯著差異，MG和HG組NO含量分別顯著下降了24.96和52.63%(P<0.01)。

圖1 高糖對NO含量的影響(n=6)*P<0.05，**P<0.01，與同時間點NG組相比Fig.1 Effect of high glucose on the content of NO(n=6)* P<0.05,**P<0.01, compared with normal group at same time point

2.3 高糖對HUVECs eNOS表達的影響 由圖2可知，細胞培養(yǎng)24 h后，與NG組相比，HG組eNOS的表達顯著下降(P<0.01)，而LG和MG組差異無統(tǒng)計學(xué)意義；細胞培養(yǎng)48 h后，與NG組相比，LG組eNOS的表達顯著下降了11.91%(P<0.05)，MG和HG組eNOS的表達分別下降了25.72%和34.50%(P<0.01)。

圖2 高糖對eNOS表達的影響* P<0.05，**P<0.01，與同時間點NG組相比A.HUVECs培養(yǎng)24和48 h后各組目的蛋白eNOS和內(nèi)參蛋白GAPDH的免疫印跡條帶；B.HUVECs培養(yǎng)24和48 h后各組eNOS的表達量變化Fig.2 Effect of high glucose on the expression of eNOS* P<0.05, **P<0.01,compared with normal group at same time pointA.The representative western immunoblots of eNOS and GAPDH at 24 and 48 h time points after HUVECs were cultured；B.The statistical analysis of mean relation protein expression of eNOS at 24 and 48 h time points after HUVECs were cultured

3 討論

研究表明，高糖是導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙的主要因素之一，血管內(nèi)皮細胞功能障礙不但是動脈粥樣硬化致心血管疾病的主要原因，亦是糖尿病血管并發(fā)癥的使動環(huán)節(jié)[8-9]。因此，研究高糖狀態(tài)下內(nèi)皮細胞的功能變化，對深入探究心腦血管疾病及糖尿病動脈粥樣硬化的機理具有十分重要的意義。正常人的空腹血糖維持在3.3～6.1 mmol/L，故本課題以5.5 mmol/L為正常對照組，比較4組不同葡萄糖濃度影響下的細胞活力、NO生成量和HUVECs的eNOS的表達。

在高糖培養(yǎng)HUVECs 48 h內(nèi)，30 mmol/L 高糖組與同時間點的5.5 mmol/L的正常對照組相比，其細胞活力顯著下降，并且eNOS的表達量減少，NO的生成量顯著降低。NO是由內(nèi)皮細胞產(chǎn)生的有效的血管擴張劑，在保護內(nèi)皮細胞功能上承擔著至關(guān)重要的作用。NO可抑制血管平滑肌的增殖，還可以抑制血小板的凝集，以及抑制白細胞黏附于血管壁高血糖在體外降低內(nèi)皮源性NO的產(chǎn)生[10-11]。近年來研究表明，糖尿病患者血管內(nèi)皮細胞功能障礙是由 eNOS脫偶聯(lián)引起的，從而使eNOS介導(dǎo)產(chǎn)生超氧陰離子而非 NO，減弱了內(nèi)皮細胞eNOS 的活性其釋放 NO 的能力[12-14]。

在高糖培養(yǎng)HUVEC 48 h內(nèi)，與同時間點的NG組相比，LG和MG組NO生成量及eNOS的表達量均顯著降低， 但是其細胞活力與NG組呈相同趨勢，均顯著增加，三組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。因此，可知，高濃度葡萄糖通過降低eNOS的表達量從而使NO的分泌量減少，引起內(nèi)皮細胞功能失調(diào)。

本實驗闡明在不同濃度葡萄糖影響下，HUVECs的細胞活力發(fā)生顯著變化，且在高糖環(huán)境下，HUVECs的eNOS表達受到抑制，從而導(dǎo)致NO生成量減少，可能是高糖造成血管內(nèi)皮功能障礙的原因之一，為臨床上解釋高血糖患者心血管疾病發(fā)病率高的現(xiàn)象提供理論基礎(chǔ)，但其相關(guān)分子機制仍有待進一步研究。

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(編校：譚玲)

Effect of high glucose on endothelial function

ZHOU Li-ting, ZHANG Si-xi, QU Xiao-yu, SONG Yan-qing

(Department of Pharmacy, First Hospital of Jilin University, Changchun 130000, China)

ObjectiveTo investigate effect of high glucose on the function of endothelial and the underlying mechanisms in human umbilical vascular endothelial cells (HUVECs).MethodsThe experiment was divided into 4 groups: normal group (NG), low dose group (LG), middle dose group (MG) and high dose group (HG).The concentration of glucose in the culture medium was 5.5, 10, 20, 30 mmol/L in the 4 groups, respectively.The HUVECs was cultured for 0, 24, 48 h.At different time point, the cell viability were measured by MTT.The secretary content of nitric oxide (NO) in the supernatant were detected using test kit.The extraction of protein were extracted for Western blot analysis to detect the expression of endothelial nitric oxide synthase (eNOS).ResultsCompared with normal group at same time point (cultured for 24 h), the cell viability and the content of NO were significantly decreased in LG, MG(P<0.05).The expression of eNOS in HG were markedly reduced (P<0.01).Compared with normal group at same time point (cultured for 48 h), the cell viability decreased significantly in HG (P<0.05).The expression of eNOS were markedly decreased 11.91, 25.72 and 34.50% in LG, MG and HG, respectively.A rising trend of cell viability were found in NG, LG and MG, but a descending trend were found in HG within 48 h.ConclusionThe cell viability were significantly affected by high glucose.The endothelial dysfunction induced by high glucose may be associated with the reduction of eNOS and NO production.

high glucose; vascular endothelial dysfunction; endothelial nitric oxide synthase

周利婷,女，碩士，主管藥師，研究方向：藥理學(xué)，E-mail：343383824@qq.com。

R587.1

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1005-1678(2015)07-0029-03