孫 超 屈愛桃 李 洋 劉翔宇 牧 丹 于 西

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010059)

山茶花(CameLLia japonica L.)為山茶科山茶屬植物，始載于《本草綱目》，又名茶花，小茶花，山茶，耐冬等。具有抗癌、抗菌、抗骨質(zhì)疏松及抑制心腦血管疾病等功效［1］。同時(shí)，山茶花味辛苦、涼，無毒，還具有涼血、止血、散瘀、消腫之功能，用于治療吐血、血崩，腸風(fēng)、血痢、血淋、跌撲損傷、燙傷等［2］。在尋找其藥理作用的同時(shí)，對其進(jìn)行化學(xué)成分研究時(shí)發(fā)現(xiàn)其含有大量咖啡因。因此，本實(shí)驗(yàn)利用紫外分光光度法對山茶花樣品中咖啡因含量進(jìn)行提取和含量測定。

1 儀器、藥品和試劑

1.1 試驗(yàn)儀器: 圓底燒瓶(若干)、容量瓶200mL(若干)、容量瓶50mL(若干)、移液(若干)、量筒、鐵架臺等。ZKB-1 -4 型循環(huán)水多用真空泵(山東省鄄城華魯電熱儀器有限公司);紫外可見分光光度計(jì)(TU -1901，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);水浴鍋(上海亞榮生化儀器廠);分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 試驗(yàn)藥品與試劑: 山茶花(不同批次，天立藥業(yè)有限公司，經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥用植物教研室喬俊纏教授鑒定為山茶科山茶屬山茶花);對照品: 咖啡因(上海試劑二廠)乙酸鉛: 天津市化學(xué)試劑六廠(批號20091208);濃硫酸: 呼和浩特市化學(xué)試劑廠(批號XK13 -001 -0304009II);鹽酸: 北京化工廠(批號20111209)。

2 方法與結(jié)果

2.1 咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備: 精密稱取咖啡因?qū)φ掌?.00mg，置于100mL 容量瓶，加蒸餾水定容至刻度，搖勻，得到濃度為50μg·mL-1的咖啡因?qū)φ掌啡芤?，備用?/p>

2.2 測定波長的選擇: 將紫外可見分光光度計(jì)的掃描波長定為200 ～400nm，取2 份蒸餾水樣進(jìn)行基線掃描，待基線平穩(wěn)后，分別取供試品溶液和對照品溶液在紫外分光光度計(jì)上于200 ～400nm 波長處進(jìn)行掃描，結(jié)果對照品與供試品溶液在273nm 處均有最大吸收，故確定273nm 為檢測波長(圖1，圖2)。

3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制: 精密移取咖啡因?qū)φ掌啡芤?.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL 的對照品溶液至25mL 容量瓶中，分別加蒸餾水定容至刻度，得到濃度分別為4.0、8.0、12.0、16.0、20.0μg·mL-1的咖啡因?qū)φ杖芤阂姳?。對咖啡因的對照品溶液進(jìn)行測定，以吸收度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)得到咖啡因的濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為A =0.0502x-0.0011 ，r=0.9998，線性范圍為4 ～20μg·mL-1，結(jié)果見圖3。

表1 不同濃度咖啡因?qū)φ掌啡芤旱奈舛?/p>

3.4 供試品提取條件的考察及結(jié)果分析: 為了確保提取質(zhì)量，以控制樣品咖啡因的含量為指標(biāo)，選出提取時(shí)間，提取溫度，料液比例3 個(gè)提取因素，每個(gè)因素3 個(gè)水平(表2)的L9(34)正交設(shè)計(jì)方案，經(jīng)9 次試驗(yàn)得出最佳提取條件。

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析: 對正交試驗(yàn)有關(guān)數(shù)據(jù)作極差分析，結(jié)果見表2、3，影響因素中，提取溫度影響最大、其次是料液比、提取時(shí)間影響最小，提取工藝各因素對咖啡因提取率影響程度依次為C3 ＞A3 ＞B2，因此，料液比為1: 150，提取時(shí)間為1.5h，提取溫度為95℃時(shí)為山茶花中咖啡因提取的最優(yōu)條件，為山茶花的供試品溶液制備提供了依據(jù)。正交設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。

表2 水平與因素

表3 正交試驗(yàn)L9(34)

3.5 供試品溶液的制備: 稱取山茶花粉末約1.0g，精密稱定。加150mL 蒸餾水于圓底燒瓶中在95℃水浴鍋中加熱1.5h，立即趁熱抽濾，轉(zhuǎn)移至200mL 容量瓶中并加蒸餾水至刻度，從容量瓶中精密吸取12.0mL 溶液，加入50mL 的容量瓶中，再向其中精密加入0.01mol HCl5.0mL 及50%的醋酸鉛1.0mL，加蒸餾水定容至刻度，搖勻，靜置抽濾。在濾液中滴入3 滴濃硫酸，再次靜置抽濾。精密吸取濾液25.0mL 轉(zhuǎn)移至50mL 容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，得供試品溶液。

3.6 方法學(xué)考察

3.6.1 穩(wěn)定性試驗(yàn): 精密吸取同一份供試品溶液，每隔2h測定其吸光度，觀察吸光度的變化并記錄數(shù)據(jù)，結(jié)果見表4。測定結(jié)果其RSD 為1.18%，說明該藥品溶液在12h 內(nèi)穩(wěn)定。

表4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

3.6.2 精密度試驗(yàn): 精密吸取供試品溶液5.0mL 到10mL的容量瓶中，定容，在最大波長處測定其吸光度，平行測定6 份，結(jié)果見表5。測定結(jié)果其RSD 為0.58%，說明實(shí)驗(yàn)精密度良好。

表5 精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

3.6.3 重現(xiàn)性試驗(yàn): 對同一批樣品分別制備樣品供試液，測定并計(jì)算咖啡因含量，結(jié)果見表6，RSD 為1.67%。表明同批樣品經(jīng)多次測定，重現(xiàn)性良好。

表6 重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果(n=5)

3.6.4 回收率試驗(yàn): 精密稱取已知咖啡因含量的山茶花細(xì)粉(同一批次)0.5g，6 份，分別加入咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品適量，按“3.5”方法平行制備。測定結(jié)果見表7。平回收率為100.9%，RSD 為1.06%，在有效范圍內(nèi)，說明該實(shí)驗(yàn)回收率較高［3］。

表7 加標(biāo)回收率結(jié)果(n=6)

3.7 含量測定: 稱取山茶花粉末約1.0g，精密稱定。按“3.5 供試品溶液的制備”方法制備溶液，在測定波長處進(jìn)行含量測定，依該法分別對3 批山茶花藥材進(jìn)行含量測定，得出的數(shù)據(jù)見表8。

表8 不同批次樣品溶液的吸光度及咖啡因含量

3 討 論

本試驗(yàn)所用山茶花已經(jīng)確定含有咖啡因，對照品和供試品都在273nm 波長處有最大吸收，與文獻(xiàn)基本一致［4］，所以確定供試品在273nm 的吸收峰為咖啡因的吸收峰?？Х纫蛟跍囟却笥?00℃時(shí)具有升華的性質(zhì)［5］，所以對于試驗(yàn)溫度應(yīng)控制在100℃以下，所以參考文獻(xiàn)選擇了85℃，90℃，95℃三個(gè)溫度進(jìn)行正交試驗(yàn)，并通過試驗(yàn)確定最優(yōu)溫度為95℃。在對供試品溶液進(jìn)行光譜掃描所得的曲線峰值均為268 ～274nm，說明干擾雜質(zhì)已基本除去，不影響峰形，保證了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

本實(shí)驗(yàn)對山茶花中咖啡因的提取方法進(jìn)行了研究，通過正交試驗(yàn)確定其最佳的提取條件，用此最優(yōu)條件提取山茶花種的咖啡因進(jìn)行含量測定實(shí)驗(yàn)，確定山茶花中咖啡因的含量。同時(shí)進(jìn)行一系列的檢測性試驗(yàn)，如精密度試驗(yàn)、重現(xiàn)性試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)及加樣回收率實(shí)驗(yàn)，以確定此次試驗(yàn)的精確度及準(zhǔn)確度。

山茶花作為民族民間藥材可用于燙傷、止血與涼血作用［6］。而適量的咖啡因具有興奮利尿作用，臨床上用作利尿劑、強(qiáng)心劑和復(fù)醒劑，同時(shí)也是配制復(fù)方乙酰水楊酸和氨非咖片等的主要原料。本次試驗(yàn)對山茶花提取方法及咖啡因含量進(jìn)行了測定，為深度開發(fā)山茶花藥材資源提供依據(jù)。

［1］李斌，羅永明. 山茶屬植物化學(xué)成分及生物活性研究［J］.江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2000，12(1): 44 -47.

［2］江蘇新醫(yī)學(xué)院. 中藥大辭典［M］. 上海: 上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2000.

［3］劉臣，唐長波，姚麗萍，等.高效液相色譜法測定碧螺春茶葉中的咖啡因含量［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，28(4): 877 -879.

［4］楊言言，張鐵銘.紫外分光光度法測定安徽羅漢尖老茶中咖啡因含量［J］.安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，31(3): 72-73.

［5］徐鳳英.茶葉中咖啡因提取方法與工藝［J］. 寧夏農(nóng)林科技，2012，53(11): 102 -103.

［6］任全進(jìn)，于金平.止血涼血山茶花［J］. 植物與保健(冬末版)，2009.54 -55.