韓 洋， 馬雨水， 符 達(dá)， 叢憲玲， 余 飛， 呂中偉

(1. 同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，上海 200072; 2.吉林大學(xué)附屬中日聯(lián)誼醫(yī)院皮膚科，長春 130031)

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·基礎(chǔ)研究·

TGFβR2作為非小細(xì)胞肺癌伴隨診斷分子的探討

韓 洋1， 馬雨水1， 符 達(dá)1， 叢憲玲2， 余 飛1， 呂中偉1

(1. 同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，上海 200072; 2.吉林大學(xué)附屬中日聯(lián)誼醫(yī)院皮膚科，長春 130031)

轉(zhuǎn)化生長因子受體2； 非小細(xì)胞肺腫瘤； 伴隨診斷； 熒光定量PCR

非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer， NSCLC)是原發(fā)肺癌最常見的類型，占肺癌的85%左右[1]。隨著分子生物學(xué)和表觀遺傳學(xué)的不斷進(jìn)展，證實EGFR、KRAS、ALK、MEK、PI3K、BRAF等驅(qū)動突變導(dǎo)致NSCLC發(fā)生發(fā)展[2-4]。檢測驅(qū)動基因，針對性抑制藥物進(jìn)行干預(yù)治療，從而改善治療效果及預(yù)后；提供驅(qū)動基因信息并指導(dǎo)臨床靶向治療的診斷稱為伴隨診斷[5]。評估潛在的伴隨診斷分子，有助于針對性靶向治療。TGFβ信號通路與NSCLC的進(jìn)行進(jìn)展有密切的關(guān)系。目前，使用反義寡核苷酸AP 12009靶向抑制TGFβR2作為有前景的治療手段治療惡性膠質(zhì)瘤和TGFβR2過表達(dá)的其他高侵襲性腫瘤[6]。本研究采用RT-qPCR探索TGFβR2在NSCLC中表達(dá)水平，Kaplan-Meier單因素生存分析研究TGFβR2表達(dá)對NSCLC總生存期和無病進(jìn)展期的影響。

1 材料與方法

1.1 一般資料

2011至2013年接受外科切除手術(shù)的NSCLC患者的新鮮組織樣本，組織樣本來自于吉林大學(xué)組織樣本庫。樣本包括90例癌組織及40例癌旁組織，均通過病理明確診斷，TGFβR2在NSCLC的表達(dá)量與臨床特征之間的關(guān)系見表1。所有NSCLC癌患者均根據(jù)第七版美國癌癥聯(lián)合會(NJCC)TNM分期系統(tǒng)進(jìn)行了分期[7]，且所有患者的信息皆于2014年9月30日前收集完整。本研究遵循協(xié)議并且經(jīng)吉林大學(xué)組織樣本庫倫理委員會批準(zhǔn)。本研究遵循協(xié)議并且經(jīng)同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 實驗試劑

DEPC水(Sigma公司)，TRIzol(Invitrogen公司)，Prime Script TM RT-PCR試劑盒(Takara公司)，無水乙醇、氯仿、異丙醇(上海聯(lián)試化工試劑有限公司)，SYBR Premix Ex Taq試劑盒(Takara公司)，實時熒光定量PCR引物(上海華大基因公司)，Real-time PCR擴(kuò)增儀(Invitrogen公司)，無RNAase槍頭及EP管(Axygen公司)，微量移液器、電動移液器(美國Eppendorf公司)。按照使用說明書推薦的條件和步驟進(jìn)行操作。

表1 TGFβR2在NSCLC的表達(dá)量與臨床特征之間的關(guān)系

1.3 實時熒光定量PCR法檢測TGFβR2表達(dá)水平

將研磨好的NSCLC和癌旁肺組織標(biāo)本置于無酶EP管內(nèi)，加入適量Trizol提取總RNA，按TaKaRa公司PrimeScript TM RT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，將cDNA保存于-20℃。使用Real-time PCR擴(kuò)增儀，按TaKaRa公司SYBR Premix Ex Taq Kit進(jìn)行實驗，反應(yīng)條件： Stage1 預(yù)變性95℃ 2min1 Cycle；Stage2 PCR反應(yīng)95℃ 30s、Taopt. 15s 72℃ 10s 收集熒光；Stage3熔解曲線分析95℃ 15s、65℃ 15s、95℃ 15s熒光采集模式40Cycle。引物序列(表2)。應(yīng)用2-ΔΔCt法對目的基因表達(dá)的相對定量。

表2 實時熒光定量PCR引物序列

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1TGFβR2在NSCLC癌組織和癌旁肺組織的表達(dá)分析

利用RT-qPCR在NSCLC患者癌組織(n=90)及癌旁組織(n=40)檢測了TGFβR2的mRNA表達(dá)水平。實驗結(jié)果顯示，TGFβR2的表達(dá)在NSCLC腫瘤組織(3.19±4.28)較癌旁組織(1.01±0.41)顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義P=0.002(表3)。

表3 TGFβR2在NSCLC和水平癌旁組織的表達(dá)水平

圖1 TGFβR2在NSCLC腫瘤組織與癌旁組織表達(dá)量的比較Fig.1 TGFβR2 expression between NSCLC and adjacent non-cancerous tissues

2.2TGFβR2的高表達(dá)是NSCLC患者伴隨診斷分子標(biāo)志物

利用Kaplan-Meier對不同TGFβR2表達(dá)水平的NSCLC進(jìn)行生存分析。結(jié)果顯示，高表達(dá)的TGFβR2的患者其預(yù)后較低表達(dá)患者生存時間明顯縮短。NSCLC患者中，TGFβR2高表達(dá)與OS及PFS有顯著負(fù)相關(guān)。TGFβR2的高表達(dá)明顯使OS減少(P<0.001，圖2A)PFS降低(P=0.001，圖2B)。根據(jù)生存分析模型，在NSCLC患者中，高表達(dá)的TGFβR2可認(rèn)為是生存期縮短的一個預(yù)測標(biāo)志物。在個體化靶向治療中，可以作為一個潛在的伴隨診斷分子標(biāo)志物。

圖2 臨床數(shù)據(jù)單因素生存分析TGFβR2在NSCLC表達(dá)與OS和DFS的關(guān)系Fig.2 Univariate survival analysis in NSCLC by TGFβR2 expression base on the clinical data as determined by Kaplan-Meier plots estimates

3 討 論

伴隨診斷是發(fā)現(xiàn)驅(qū)動基因最重要的手段，對于靶向治療，效果事半功倍；伴隨診斷的主要方法是RT-qPCR(實時熒光定量PCR)技術(shù)，IHC(免疫組織化學(xué))技術(shù)和FISH(熒光原位雜交)技術(shù)。FISH和RT-qPCR結(jié)果判斷客觀。CFDA已經(jīng)批準(zhǔn)RT-qPCR應(yīng)用在臨床檢測。本研究采用快速、簡便易行的RT-qPCR定量分析檢測方法。個體化治療靶向藥物的臨床應(yīng)用需要伴隨診斷分子標(biāo)志物提供基因信息，從而進(jìn)行臨床決策[5]。

NSCLC臨床分子病理學(xué)的相關(guān)機(jī)制尚不明確。體外實驗證明反義寡核苷酸AP 12009抑制TGFβR2過表達(dá)的腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，被用于治療高侵襲行為腫瘤，比如胰腺癌、惡性黑色素瘤、惡性膠質(zhì)瘤[6，8]。然而，沒有伴隨診斷標(biāo)志物針對性地預(yù)測哪些分子類型惡性腫瘤可以進(jìn)行靶向抑制治療。2013年美國三所學(xué)會聯(lián)合發(fā)布EGFR、ALK酪氨酸激酶抑制劑治療指南[9]，NSCLC靶向治療將會根據(jù)分子靶點的確定進(jìn)行臨床決策和管理。所以，發(fā)現(xiàn)新的伴隨診斷分子標(biāo)志物可以進(jìn)一步明確分子靶點，通過靶點檢測技術(shù)早期診斷并開發(fā)靶向藥物治療NSCLC，使TGFβR2陽性患者從相應(yīng)的靶向藥物抑制劑治療中獲益，提高臨床應(yīng)用和療效。

在研究中發(fā)現(xiàn)TGFβR2在肺癌組織中的表達(dá)量明顯高于相對應(yīng)的正常肺的癌旁組織，研究結(jié)果與之前Chen[10]的研究結(jié)果并不一致。盡管特定的分子機(jī)制還不明確，但是明確的是TGFβR2使TGFβR1磷酸化，被激活的TGFβR1使下游的靶基因Smad2和Smad3磷酸化，磷酸化的Smad2和Smad3與Smad4形成復(fù)合物，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核并調(diào)節(jié)靶基因持續(xù)表達(dá)[11-12]。TGFβR2的過表達(dá)可能會導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展。與之前研究結(jié)果不一致的原因可能是： 我們選擇的是癌和相對應(yīng)的癌旁組織，而且本研究的樣本量也較大，選擇90例癌組織和40例相對應(yīng)的癌旁組織，Chen樣本量只有60例。

本研究發(fā)現(xiàn)，在NSCLC患者組織中(n=90，3.19±4.28)TGFβR2 mRNA的表達(dá)顯著高于癌旁肺組織(n=40，1.01±0.41)。二者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。生存分析顯示，TGFβR2高表達(dá)的NSCLC患者預(yù)后不良，OS和PFS明顯降低。過表達(dá)的TGFβR2患者總生存時間明顯縮短，TGFβR2可以作為NSCLC潛在的伴隨診斷分子標(biāo)志物。

進(jìn)一步研究了與TGFβR2表達(dá)相關(guān)的臨床病理特征，TGFβR2的表達(dá)與腫瘤的分化程度具有相關(guān)性，在低分化NSCLC組織中TGFβR2的表達(dá)量明顯高于中等分化和分化較好的NSCLC組織(P<0.05，表1)，分化程度越差，TGFβR2表達(dá)量越高，這預(yù)示TGFβR2在NSCLC進(jìn)展中起重要作用。此外，TGFβR2在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和肺膜侵襲的患者中顯著高表達(dá)(P<0.05，表1)，這一結(jié)果預(yù)示TGFβR2過表達(dá)可能與肺癌的轉(zhuǎn)移和侵襲有密切的關(guān)聯(lián)。

伴隨診斷分子反應(yīng)特定藥物的靶點，在于一些治療無關(guān)的非特異性的藥物，為未來的靶向治療提高與新的潛在的標(biāo)志物造福臨床[3，13]，通過分子生物學(xué)和表觀遺傳分析，在基因組學(xué)和蛋白組學(xué)等技術(shù)的支持下，對大樣本人群和特定的腫瘤疾病進(jìn)行腫瘤分子標(biāo)志物，檢測分析[14]，通過IHC、FISH和RT-qPCR等技術(shù)驗證鑒定，找到腫瘤的原因和治療靶點，把相關(guān)分子病理亞型精確分類，最終實現(xiàn)靶向診斷和個體化治療，提高生存時間和治愈效果[15-16]。

本實驗通過腫瘤樣本驗證差異表達(dá)和生存分析，研究了TGFβR2的表達(dá)對NSCLC生存預(yù)后的影響，但仍有許多問題沒有揭開，相關(guān)的分子機(jī)制還不清楚，本課題只是在mRNA水平上驗證表達(dá)，還缺少蛋白水平的驗證，下一步將在擴(kuò)大樣本量的同時，進(jìn)一步通過免疫組織化學(xué)、Elisa等方法在蛋白水平驗證，結(jié)合臨床信息繼續(xù)闡釋。接下來的研究中將構(gòu)建TGFβR2的過表達(dá)細(xì)胞系，再結(jié)合基因，敲除小鼠進(jìn)行動物實驗，在此基礎(chǔ)上研究腫瘤發(fā)生、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移的相關(guān)機(jī)制，并對癌組織中TGFβR2測序，希望最終可以找到治療晚期肺癌的一個新的靶標(biāo)。

以上結(jié)果表明，TGFβR2可能成為一種新的分子標(biāo)志物應(yīng)用于臨床實驗和臨床診斷，改善靶向治療臨床決策和治療效果，具有潛在的臨床應(yīng)用價值，嘗試發(fā)現(xiàn)一個新的，基于信號通路和基因，具有對個體化治療指導(dǎo)意義的，作為評估NSCLC生存預(yù)后的驅(qū)動基因，通過評價NSCLC中TGFβR2的表達(dá)與臨床特征之間的關(guān)系，嘗試能夠發(fā)現(xiàn)用于預(yù)測生存預(yù)后的新的腫瘤生物標(biāo)志物。

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TGFβR2 as a bio-maker for companion diagnostics of non-small cell lung cancer

HANYang1，MAYu-shui1，F(xiàn)UDa1，CONGXian-ling2，YUFei1，LVZhong-wei1

(1. Dept. of Nuclear Medicine， Tenth People’s Hospital， Tongji University， Shanghai 200072， China; 2. Dept. of Dermatology， China Japan Union Hospital， Jilin University， Changchun 130031， China)

Objective To determine the expression levels of transforming growth factor receptor 2(TGFβR2) in non-small cell lung cancer(NSCLC) and its significance. Methods Total RNA was extracted from NSCLC tissue(n=90) and adjacent non-cancerous tissue(n=40)， Real-Time quantitative PCR was performed. The 2-ΔΔCTmethod was used to quantify the expression levels ofTGFβR2. Independentt-test was performed to examine differences between two groups， Kaplan-Meier curves were used to determine overall survival(OS) and progression-free survival(PFS) of patients. ResultsTGFβR2 expression in NSCLC tissue was significantly higher than that in adjacent non-cancerous tissue(3.19±4.28vs1.01±0.41，P<0.05). Kaplan-Meier survival analysis demonstrated that prognosis was worse in patients with high expression ofTGFβR2. Expression ofTGFβR2 was significantly associated with decreased OS and PFS in NSCLC patients. ConclusionTGFβR2 might be used as a bio-marker for companion diagnostics of non-small cell lung cancer.

TGFβR2； NSCLC； companion diagnostics； RT-qPCR

10.16118/j.1008-0392.2015.06.004

2015-06-23

國家自然科學(xué)基金(81371595)

韓 洋(1987—)，男，碩士.E-mail： hymedicine@126.com

呂中偉.E-mail： hymedicine@163.com

R 15165

A

1008-0392(2015)06-0019-05