張 霞， 宋志旺， 朱蕾蕾， 高 勇， 董春燕

(1. 同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院腫瘤科，上海 200120； 2. 同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院放療科，上海 200120)

?

·基礎(chǔ)研究·

乳腺癌lncRNAs表達(dá)譜的檢測(cè)

張 霞1， 宋志旺1， 朱蕾蕾2， 高 勇1， 董春燕1

(1. 同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院腫瘤科，上海 200120； 2. 同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院放療科，上海 200120)

目的 初步探討人乳腺癌lncRNAs基因表達(dá)譜的篩選。方法 在EBI數(shù)據(jù)庫中的Array Express子數(shù)據(jù)庫選取兩組代表乳腺癌基因表達(dá)的基因芯片數(shù)據(jù)，從一組數(shù)據(jù)下載原始CEL數(shù)據(jù)文件，運(yùn)用RMA(RobustMultichip Average)方法對(duì)原始CEL文件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化及背景校正。得到乳腺癌與癌旁組織中的探針表達(dá)譜矩陣，將其與NetAffx 注釋文件結(jié)合。提取出RefSeq轉(zhuǎn)錄本 ID和(或)Ensembl基因ID的探針集。對(duì)于Refseq ID的探針集，只保留那些NR者(代表非編碼RNA)。對(duì)于Ensembl 基因 ID的探針集，只保留注釋為LncRNA，加工過的 轉(zhuǎn)錄本或“misc_RNA”。對(duì)上述步驟得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，得到存在差異表達(dá)的lncRNA數(shù)量，將這一結(jié)果在另一組乳腺癌芯片數(shù)據(jù)中進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果 共篩選出表達(dá)差異顯著且方向一致的18個(gè)LncRNA，其中2種LncRNAs表達(dá)明顯上調(diào)，16種LncRNAs表達(dá)明顯下調(diào)。 結(jié)論 篩選出與乳腺癌相關(guān)的差異表達(dá)lncRNAs，為進(jìn)一步研究其在乳腺癌中的作用奠定基礎(chǔ)。

乳腺腫瘤； lncRNAs； 芯片分析

長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA, lncRNA)是一組內(nèi)源性、長度超過200 個(gè)核苷酸、缺少特異完整的開放閱讀框和無蛋白質(zhì)編碼功能的RNA。越來越多的證據(jù)顯示，lncRNAs能夠廣泛地參與基因組調(diào)節(jié)，如X染色體沉默、基因組印記以及染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾、核內(nèi)運(yùn)輸?shù)?，從而廣泛參與調(diào)控個(gè)體的生長發(fā)育以及細(xì)胞凋亡、增殖、分化等生命活動(dòng)[1-2]。有研究報(bào)道，一些 lncRNAs 參與了人類乳腺癌發(fā)生，發(fā)展以及轉(zhuǎn)移。本研究通過對(duì)EBI數(shù)據(jù)庫中的芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，篩選出與乳腺癌相關(guān)的LncRNAs，從而為進(jìn)一步探討其在乳腺癌中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 芯片數(shù)據(jù)

在EBI數(shù)據(jù)庫中的Array Express子數(shù)據(jù)庫中使用關(guān)鍵詞“breast cancer”關(guān)鍵詞檢索。納入標(biāo)準(zhǔn)為人類及臨床樣本。通過檢索選取了兩組代表乳腺癌基因表達(dá)的數(shù)據(jù)，分別為GSE42568和GSE3744，這些數(shù)據(jù)均來自于Affymetrix HG-U133 Plus 2.0 芯片。GSE42568為104例腫瘤組織vs17例正常組織，其中104例乳腺癌患者的資料如下： 年齡31～89歲(平均58歲)；腫瘤大小0.6～8.0cm(平均2.79cm)，T1(最大徑<2cm)分期18例，T2(2～5cm)分期83例，T3(>5cm)分期3例；浸潤性導(dǎo)管癌82例，浸潤性小葉癌17例，特殊類型(小管癌和黏液癌)5例；病理分期： Ⅰ期11例，Ⅱ期40例，Ⅲ期53例；腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移59例,無腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移45例；ER受體陽性： 67例，陰性： 34例，ER不確定3例。術(shù)后接受TAM內(nèi)分泌治療69例，未接受TAM內(nèi)分泌治療26例。接受術(shù)后輔助化療(CMF+/-阿霉素)55例，未接受術(shù)后輔助化療45例。術(shù)后治療不詳9例。平均隨訪時(shí)間： 1887d，最長隨訪時(shí)間： 3026d。對(duì)GSE42568代表的乳腺癌基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，將結(jié)果在GSE3744數(shù)據(jù)中驗(yàn)證。

1.2 數(shù)據(jù)校正及注釋

從GSE42568中下載原始CEL數(shù)據(jù)文件，運(yùn)用RMA(RobustMultichip Average)方法對(duì)原始CEL文件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化及背景校正。得到乳腺癌與癌旁組織中的探針表達(dá)譜矩陣。然后將Affymetrix HG-U133 Plus 2.0芯片探針集與NetAffx 注釋文件進(jìn)行匹配，注釋信息包括探針I(yè)D，基因名字縮寫，基因名字，Ensemble基因ID, RefSeq轉(zhuǎn)錄本ID以及一些其他注釋項(xiàng)目。將探針表達(dá)譜矩陣與注釋文件結(jié)合。提取出RefSeq轉(zhuǎn)錄本ID和(或)Ensembl基因ID的探針集。對(duì)于Refseq ID的探針集，只保留那些NR者(NR在Refseq 數(shù)據(jù)庫中代表非編碼RNA)。對(duì)于Ensembl 基因ID的探針集，只保留注釋為LncRNA，加工過的 轉(zhuǎn)錄本或“misc_RNA”。然后對(duì)上述步驟得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，將假基因，rRNA，microRNA和其他短RNA包括rRNAs、snRNAs和 snoRNAs過濾掉。最后，得到注釋過的LncRNAs轉(zhuǎn)錄本數(shù)量。

1.3 通過GSE3744數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證進(jìn)一步篩選出差異表達(dá)的LncRNA

將從GSE42568中得到的差異表達(dá)的Lnc-RNA，采用GSE3744數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證，這個(gè)數(shù)據(jù)同樣來自于Affymetrix HG-U133 Plus 2.0 芯片，由47例乳腺癌患者組成的基因表達(dá)數(shù)據(jù)。是由同上的方法對(duì)該數(shù)據(jù)進(jìn)行解析，得到差異表達(dá)的LncRNA，然后將對(duì)GSE42568和GSE3744得到的兩個(gè)數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，從中篩選出差異表達(dá)顯著且方向一致的LncRNA。

2 結(jié) 果

2.1 從GSE42568數(shù)據(jù)庫篩選的差異表達(dá)的LncRNA

從GSE42568數(shù)據(jù)庫得到5486個(gè)注釋過的LncRNAs轉(zhuǎn)錄本，其中存在差異表達(dá)的lncRNA214個(gè)(圖1、圖2)。

2.2 通過GSE3744數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證進(jìn)一步篩選出差異表達(dá)的LncRNA

對(duì)GSE42568和GSE3744得到的兩個(gè)數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，從中篩選出差異表達(dá)顯著且方向一致的18個(gè)LncRNA，其中BC032347和AK027294在乳腺癌中顯著高表達(dá)，達(dá)2倍以上(表1)。

圖1 GSE42568中214個(gè)差異表達(dá)的LncRNA的分布圖Fig.1 Distribution of 214 long non-coding RNAs differentially expressed in experimental data set GSE42568

圖2 104例乳腺癌vs正常乳腺中214個(gè)差異表達(dá)的LncRNA的聚類熱圖；(每一列代表一個(gè)樣本，每一行代表一個(gè)LncRNA；深藍(lán)： 高表達(dá)。淺藍(lán)： 低表達(dá))Fig.2 Clustering heatmap of 104 paired samples based on the 214 differentially expressed long non-coding RNAs. Each column represents one sample and each row represents one long non-coding RNA. Gene expression levels are indicated as follows： dark blue, high expression; light blue, low expression

GSE42568ParametricP-valueFDRFold-changeUniqueIDGSE3744ParametricP-valueFDRFold-change<1e-07<1e-070.21AF0750270.0007660.01340.32<1e-07<1e-070.43AF075039<1e-07<1e-070.460.0001130.000280.29AJ4205530.0001110.003740.157.00E-062.30E-050.3AK0001062.09E-050.001090.21<1e-07<1e-070.12AK023330<1e-07<1e-070.17<1e-07<1e-070.12AK0236310.0009590.01520.72<1e-07<1e-073.41AK0272940.00015380.004742.783.00E-071.35E-060.38AK0937323.86E-050.001730.75<1e-07<1e-070.13AK0938784.2E-060.0003160.63<1e-07<1e-070.28AK094292<1e-07<1e-070.34<1e-07<1e-070.37AK098506<1e-07<1e-070.50<1e-07<1e-070.042AK129753<1e-07<1e-070.23<1e-07<1e-070.18BC0307641.43E-050.0007890.29<1e-07<1e-073.81BC0323470.00051660.01052.86<1e-07<1e-070.28BC062365<1e-07<1e-070.41<1e-07<1e-070.26BX6482330.0007420.01330.56<1e-07<1e-070.39BX6488362.06E-050.001080.43<1e-07<1e-070.031CR7494651E-071.25E-050.11

3 討 論

人類基因組大部分為非編碼RNA，廣泛參與人體生理、病理活動(dòng)，與眾多腫瘤密切相關(guān)。大量研究顯示，人類基因組中僅有2%產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄本可編碼RNA，剩余98%均為非編碼RNA(Non-coding RNAs)。這類非編碼RNA 通常被分為管家ncRNAs 和調(diào)節(jié)性ncRNAs 兩類。在調(diào)節(jié)性ncRNAs 中，至少存在著兩種類型： 短鏈非編碼RNA(包括siRNA、miRNA和piRNA)和長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA，LncRNA)。miRNA 已經(jīng)被證明參與了一系列重要的生物過程并且在人類疾病的發(fā)生發(fā)展中其重要作用。然而，事實(shí)上miRNAs 僅僅占了非編碼RNA 中的很小一部分，而LncRNA 占了ncRNA 的80%。LncRNA廣泛參與調(diào)控個(gè)體的生長發(fā)育以及細(xì)胞凋亡、增殖、分化等生命活動(dòng)，并參與包括腫瘤在內(nèi)的許多疾病的病理過程[3-4]。研究表明，長非編碼RNA(LncRNA)與乳腺癌的關(guān)系也愈來愈受到關(guān)注。反式調(diào)控LncRNA HOTAIR 在乳腺癌中表達(dá)上調(diào)。乳腺癌中HOTAIR的表達(dá)水平和乳腺癌的轉(zhuǎn)移和生存預(yù)后相關(guān)。Gupta等[5]研究發(fā)現(xiàn)HOTAIR 在乳腺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶中表達(dá)顯著升高，并認(rèn)為HOTAIR 是預(yù)測(cè)腫瘤轉(zhuǎn)移和預(yù)后的重要指標(biāo)。HOTAIR過表達(dá)可以輔助異常Polycomb抑制復(fù)合物2(polycomb repressive complex 2，PRC2)募集到靶基因的基因組位置處表觀抑制PRC2的靶基因，從而促進(jìn)乳腺癌的侵襲[6-8]。反式調(diào)控LncRNA GAS5 通過與糖皮質(zhì)激素受體(GR)的DNA結(jié)合域結(jié)合，影響GR活性，從而影響細(xì)胞對(duì)凋亡的敏感性。母本印跡表達(dá)基因3(MEG3)是位于染色體14q32的印跡基因，編碼lncRNA[9-11]，該基因具有腫瘤抑制功能，通過其基因轉(zhuǎn)錄下調(diào)及DNA甲基化的方式達(dá)到抑制乳腺癌細(xì)胞增殖的目的。MEG3還參與抑癌基因p53的活化，共同誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]。此外，類固醇激素受體RNA激活因子(the steroid receptor RNA activator，SRA)是一種能夠激活人性激素受體并與乳腺癌的發(fā)生密切相關(guān)的長非編碼RNA，可以調(diào)節(jié)類固醇受體和其他轉(zhuǎn)錄因子的RNA表達(dá)水平，以及調(diào)節(jié)類固醇受體RNA激活蛋白(SRAP)水平的表達(dá)[13-14]。兩種基因關(guān)聯(lián)實(shí)體之間的平衡由內(nèi)含子-1的剪切調(diào)控，其影響SRAP的閱讀框。完全拼接的SRAP編碼子和含有內(nèi)含子-1的SRA-RNAs在乳腺癌細(xì)胞中均有存在。在乳腺癌中，相對(duì)于SRAP編碼子, 非蛋白編碼子SRA-intron-1相對(duì)高表達(dá)(P<0.003)[13]。編碼/非編碼SRA轉(zhuǎn)錄子之間的平衡不僅表征了特定的腫瘤表型，而且還可能調(diào)節(jié)了乳腺癌發(fā)生和發(fā)展中特定基因的表達(dá)[15-16]。應(yīng)激誘導(dǎo)長非編碼轉(zhuǎn)錄5(LSINCT5)是一種長度約2.6kb的應(yīng)激反應(yīng)性IncRNA，它在乳腺癌中過表達(dá)[17]，在癌來源的細(xì)胞株中敲除LSINCT5后，導(dǎo)致細(xì)胞增殖降低，同時(shí)伴隨多種基因的表達(dá)下調(diào)，據(jù)此推測(cè)LSINCT5可能是通過調(diào)節(jié)下游靶基因，促進(jìn)癌細(xì)胞增殖，發(fā)揮致癌作用。BC200，一種神經(jīng)元特異性的LncRNA，在侵襲性乳腺癌中高表達(dá)，和乳腺癌分期相關(guān)，因此，推測(cè)該LncRNA可能促進(jìn)了乳腺癌的轉(zhuǎn)移[18]。lncRNAs研究已成為現(xiàn)代分子生物學(xué)領(lǐng)域的新熱點(diǎn)，研究乳腺癌相關(guān)的lncRNAs，尋找特異性和靈敏度高的lncRNAs標(biāo)志物；通過調(diào)節(jié)特定lncRNA的表達(dá)來影響某些抑癌基因的轉(zhuǎn)錄，最終達(dá)到抑制癌癥發(fā)生的目的但目前了解到的LncRNA只是冰山一角，絕大部分的LncRNA 的功能及其與腫瘤尤其乳腺癌的關(guān)系仍然是不清楚的。

LncRNA芯片技術(shù)是一種快速有效的分析LncRNA表達(dá)譜的方法。為尋找新的乳腺癌基因并探討與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，本研究在EBI數(shù)據(jù)庫中的Array Express子數(shù)據(jù)庫中，對(duì)來自于Affymetrix HG-U133 Plus 2.0芯片的GSE42568乳腺癌基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行處理分析，得到214個(gè)在乳腺癌和正常乳腺組織中差異表達(dá)的LncRNA(見圖1，圖2)，通過在GSE3744乳腺癌基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫中驗(yàn)證，最終得到18個(gè)表達(dá)差異顯著且方向一致的LncRNA，其中BC032347和AK027294在乳腺癌中顯著高表達(dá)(P<0.01，見表1)。結(jié)果豐富了乳腺癌的LncRNA差異表達(dá)譜，為進(jìn)一步研究LncRNA在乳腺癌發(fā)生中的作用及機(jī)制提供了更多依據(jù)。

LncRNA通過對(duì)靶基因的表達(dá)調(diào)控而發(fā)揮作用。因此，存在表達(dá)差異的LncRNA需要運(yùn)用生物信息學(xué)手段尋找其靶基因，并用分子生物學(xué)技術(shù)加以驗(yàn)證，明確其在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的生物學(xué)功能，從生物學(xué)角度解釋其上調(diào)或下調(diào)的原因。 將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)對(duì)本實(shí)驗(yàn)中篩選到的乳腺癌相關(guān)LncRNA加以驗(yàn)證，并運(yùn)用生物信息學(xué)手段和分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)一步研究其生物學(xué)功能。

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A preliminary Study of LncRNA Expression Profile in Breast Cancer

ZHANGXia1,SONGZhi-wang1,ZHULei-lei2,GAOYong1,DONGChun-yan1

(1. Dept．of Oncology，East Hospital，Tongji University， Shanghai 200120， China；2. Dept．of Radiotherapy，East Hospital，Tongji University， Shanghai 200120， China)

Objective To investigate the expression patterns of long non-coding RNAs (lncRNAs) in breast cancer. Methods Two publicly available human exon arrays for breast cancer and data for the corresponding normal tissue were downloaded from the ArrayExpress Microarray Database at EBI. We re-annotated the probes of the human exon arrays and retained the probes uniquely mapping to lncRNAs at the gene level. LncRNA expression profiles were generated by using robust multi-array average method in affymetrix power tools. The normalized data were then analyzed with a Bioconductor package linear models for microarray data and genes with adjusted P-values below 0.01 were considered differentially expressed. An independent data set was used to validate the results. Results we identified 18 lncRNAs that were differentially expressed in breast cancer： two LncRNAs genes were up-regulated and 16 LncRNAs genes were down-regulated. Conclusion We identified a set of lncRNAs differentially expressed in breast cancer, providing useful information for discovery of new biomarkers and therapeutic targets in breast cancer.

breast cancer; Long non-coding Rcroarray analysis; Data mining

10.16118/j.1008-0392.2015.06.006

2015-08-09

國家自然科學(xué)基金(81573008)

張 霞(1983—)，女，講師，碩士.E-mail： zhangxia 10203@126.com

董春燕.E-mail： 13370029736@163.com

R 737.9

A

1008-0392(2015)06-0031-05