朱曜，劉爽，張旭輝，唐書澤

(1.暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系，廣東 廣州 510632；2.廣東省疾病預(yù)防控制中心，廣東 廣州 510300)

近年來發(fā)生的突發(fā)性引用水污染事件中，人為飲用水投毒難以被及時發(fā)現(xiàn)[1–2]。建立飲用水有毒有害物質(zhì)預(yù)警的在線檢測系統(tǒng)，及時切斷被污染水源，減少事故損失[3–4]，對飲用水安全應(yīng)急管理具有重要意義。秋水仙堿是一種毒性極強(qiáng)的生物堿，LD50 僅為4mg/kg[5]，存在于百合科水仙的球莖、種子以及食品鮮黃花菜中。秋水仙堿中毒事件頻頻發(fā)生，如2004年揚(yáng)州大學(xué)副教授秋水仙堿投毒案和2013年秋水仙堿外遇投毒案，但因規(guī)模較小并未引起足夠重視。目前測定秋水仙堿含量的方法很多，主要有熒光光度法、比色法、薄層色譜掃描法、高效液相色譜法等[6–8]，但上述方法大都操作復(fù)雜，靈敏度較低，且必須間斷式采集樣品進(jìn)樣，無法實(shí)現(xiàn)對飲用水中秋水仙堿的快速檢測。近年來，流動注射化學(xué)發(fā)光法以其儀器簡單、靈敏度高、操作方便等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用到食品、藥品、環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域[9–12]。該方法可連續(xù)進(jìn)樣，實(shí)時采集飲用水樣品檢測，故可以對飲用水水質(zhì)進(jìn)行在線監(jiān)測。筆者研究秋水仙堿含量對魯米諾–鐵氰化鉀流動注射化學(xué)發(fā)光體系發(fā)光強(qiáng)度的影響[13–15]，采用響應(yīng)面優(yōu)化法得到最優(yōu)的檢測條件[16]，并結(jié)合在線監(jiān)測報警技術(shù)[17]建立了一種對飲用水中秋水仙堿預(yù)警的方法[18–20]，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

主要儀器：IFIS–C 型智能流動注射進(jìn)樣器；RFL–1 型超微弱化學(xué)發(fā)光/生物發(fā)光檢測儀(西安瑞邁電子科技有限公司)；DHG–9145A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；PHS–3C 數(shù)字式 pH 計(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；EL104 電子天平(梅特勒–托利多儀器有限公司)；微量移液槍0.1 ～ 1.0mL、0 ～100 μL(德國BRAND 公司)；超聲波儀(西安科導(dǎo)超聲波儀器有限公司)。

主要試劑：魯米諾粉末(Sigma 公司)；鐵氰化鉀(咸陽市化學(xué)試劑廠)；秋水仙堿(銘旺生物公司)；氫氧化鈉(分析純，廣州市大茂化學(xué)試劑廠)；氯化鈣(廣州市裕達(dá)化學(xué)試劑廠)；乙二胺四乙酸二鈉(咸陽化學(xué)試劑廠)；超純水。

1.2 進(jìn)樣方法

按圖1 連接整個分析流路，A 通道注入秋水仙堿溶液，B 通道注入魯米諾溶液，C 通道注入鐵氰化鉀溶液，其中B、C 通道溶液先在三通閥處混合，形成具有化學(xué)發(fā)光效果的魯米諾–鐵氰化鉀體系，再與A 通道溶液混合，進(jìn)入反應(yīng)池F 中反應(yīng)，廢液進(jìn)入廢液池W。反應(yīng)所產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號由檢測儀檢測，通過光電倍增管D 將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?，并在放大器中放大，變化的電流連接報警裝置M，進(jìn)行實(shí)時報警，并最終由計算機(jī)軟件呈現(xiàn)出峰線圖。

圖1 在線監(jiān)測預(yù)警示意圖 Fig.1 Chart of the FL–CL on-line monitoring and early warning system

1.3 反應(yīng)機(jī)理分析

通過試驗分析秋水仙堿—魯米諾–鐵氰化鉀化學(xué)發(fā)光體系的作用機(jī)理。

1.4 檢測條件的優(yōu)先

1.4.1 單因素試驗

分別考察秋水仙堿溶液質(zhì)量濃度0.05mg/L 時泵速、魯米諾溶液pH，魯米諾溶液濃度、鐵氰化鉀溶液濃度對相對化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響。

1) 魯米諾溶液pH 為13.00、魯米諾溶液濃度2×10–4mol /L、鐵氰化鉀溶液濃度2×10–4mol /L保持不變，改變泵速，比較泵速分別為0.8、1.0、1.20、1.40、1.60mL/min 時的相對化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。

2) 泵速1.0mL/min、魯米諾溶液濃度2×10–4mol/L、鐵氰化鉀溶液濃度2×10–4mol/L 保持不變，改變魯米諾pH，比較魯米諾pH 分別為12.20、12.60、13.00、13.40、13.80 時的相對化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。

3) 泵速1.0mL/min、魯米諾溶液pH 為13.00、鐵氰化鉀溶液濃度2×10–4mol /L 保持不變，改變魯米諾濃度，比較魯米諾濃度分別為 0.5×10–4、1.0×10–4、2.0×10–4、3.0×10–4、4.0×10–4mol /L 時的相對化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。

4) 泵速1.0mL/min、魯米諾溶液pH 為13.00、魯米諾溶液濃度2×10–4mol/L 保持不變，改變鐵氰化鉀溶液濃度，比較鐵氰化鉀溶液濃度分別為0.5×10–4、1.0×10–4、2.0×10–4、3.0×10–4、4.0×10–4mol/L 時的相對化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。

1.4.2 響應(yīng)面優(yōu)化檢測試驗

根據(jù)Box–Behnken 中心組合設(shè)計原理，進(jìn)行四因素三水平(表1)響應(yīng)面優(yōu)化檢測試驗，并用Design Expert 8.0 軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析。

表1 響應(yīng)面優(yōu)化檢測試驗的因素和水平 Table 1 Factors and levels of response surface design

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制和精密度及檢出限的確定

采用梯度稀釋法，配制0.005、0.010、0.050、0.100、0.500、1.000mg/L 的秋水仙堿溶液，在優(yōu)化后的試驗條件下，測定相對化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。以秋水仙堿濃度為橫坐標(biāo)，以相對化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算精密度和檢出限。

1.4.4 干擾試驗和加標(biāo)回收

在優(yōu)化試驗條件下進(jìn)行干擾影響試驗，秋水仙堿質(zhì)量濃度為0.05mg/L，加入常見的干擾離子，觀測化學(xué)相對發(fā)光強(qiáng)度變化。

在優(yōu)化后的試驗條件下，測定實(shí)驗室自來水、宿舍自來水、怡寶純凈水中秋水仙堿含量，之后進(jìn)行秋水仙堿0.05mg/L 的加標(biāo)回收試驗。

1.5 報警系統(tǒng)原理圖設(shè)計

為了對突發(fā)事件進(jìn)行在線實(shí)時預(yù)警，在監(jiān)測系統(tǒng)中加入報警器來提醒檢測人員，以便從理論上設(shè)計出一套相對完整的檢測報警系統(tǒng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)機(jī)理

試驗結(jié)果表明，75 s 時在魯米諾–鐵氰化鉀體系中注入0.05mg/L 的秋水仙堿溶液對發(fā)光強(qiáng)度有明顯抑制作用，其抑制程度即相對化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與秋水仙堿溶液濃度呈正相關(guān)關(guān)系。體系的反應(yīng)機(jī)理可能是魯米諾被鐵氰化鉀氧化成為激發(fā)態(tài)的3–氨基鄰苯二甲酸根陰離子，其化學(xué)發(fā)光的最大波長為425 nm。同時秋水仙堿是一種有機(jī)胺類生物堿，可被鐵氰化鉀氧化，與魯米諾產(chǎn)生競爭性抑制，從而抑制了體系的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。

2.2 檢測條件的優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 單因素試驗結(jié)果

1) 泵速的選取。當(dāng)體系的流動注射速率一定時，在較低濃度范圍內(nèi)，載流泵速和相對化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度成正相關(guān)，在泵速超過1.00mL/min 時相對發(fā)光強(qiáng)度最大；當(dāng)泵速較高時，相對化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度降低并趨于穩(wěn)定，故選取泵速為1.00mL/min。

2) 魯米諾溶液pH 的選取。在堿性環(huán)境中魯米諾溶液有較好的化學(xué)發(fā)光特性，隨著pH 的升高，相對化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度不斷增強(qiáng)，在pH 為13.00 時相對發(fā)光強(qiáng)度最大，之后隨著pH 的升高相對發(fā)光強(qiáng)度下降，故選取魯米諾pH 為13.00。

3) 魯米諾溶液濃度的選取。魯米諾溶液濃度較低時，相對化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度較弱，當(dāng)濃度達(dá)到2×10–4mol /L 時，相對發(fā)光強(qiáng)度顯著增高，之后隨著濃度的升高，發(fā)光強(qiáng)度呈降低的趨勢，故選取魯米諾溶液濃度為2×10–4mol/L。

4) 鐵氰化鉀溶液濃度的選取。鐵氰化鉀溶液濃度增大時，相對化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度也隨之增強(qiáng)，在濃度為2×10–4mol /L 時化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度最大，隨后隨著濃度的增大，相對化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度趨于平穩(wěn)?？紤]到成本因素，確定鐵氰化鉀溶液濃度為2×10–4mol /L。

2.2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果

根據(jù)中心復(fù)合模型，采用29個試驗點(diǎn)(5個中心點(diǎn))進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗，其中共有24個析因點(diǎn)，自變量取值在各因素構(gòu)成的三維頂點(diǎn)；5個重復(fù)零點(diǎn)是區(qū)域的中心點(diǎn)，用以估計試驗誤差，響應(yīng)值是相對發(fā)光強(qiáng)度(表2)。相對發(fā)光強(qiáng)度(y)和各因素變量（x1、x2、x3、x4分別表示因素A、B、C、D）的二次回歸方程為：y=610.40–47.33x1+64.50x2+76.67x3+ 16.67x4+

表2 響應(yīng)面法試驗結(jié)果 Table 2 Results of response surface experiment

2.2.3 回歸方程的顯著性檢驗

從表3 可以看出，回歸方程的失擬項較小，說明該方程對試驗擬合情況較好，誤差小，所以，可以用該回歸方程代替試驗真實(shí)點(diǎn)對結(jié)果進(jìn)行預(yù)測和分析。由表3 還可以看出，魯米諾溶液濃度(x3)、魯米諾溶液pH(x2)、泵速(x1)、鐵氰化鉀溶液濃度(x4)對相對發(fā)光強(qiáng)度的影響依次減小。

2.2.4 響應(yīng)面法分析結(jié)果

由圖2 可知：魯米諾溶液濃度對相對化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響最大，表現(xiàn)為曲面彎折度較大；其次為魯米諾溶液pH，再次為泵速，而鐵氰化鉀溶液濃度對結(jié)果的影響不明顯，表現(xiàn)為曲面較為平滑，其中，圖f 的曲面最陡，表明魯米諾溶液pH 和魯米諾溶液濃度的交互作用對結(jié)果的影響最大。

圖2 4 因素交互作用的響應(yīng)面分析結(jié)果 Table 2 Results of response surface analysis from the interactive effects among four factors

2.2.5 最優(yōu)檢測條件的預(yù)測與驗證

根據(jù)以上結(jié)果，結(jié)合軟件最優(yōu)化預(yù)測功能，預(yù)測得到秋水仙堿的最優(yōu)檢測條件：泵速 0.92mL/min；魯米諾溶液pH 13.20；魯米諾溶液濃度3.08×10–4mol/L；鐵氰化鉀溶液濃度 2.56×10–4mol/L；相對發(fā)光強(qiáng)度為654.735。

根據(jù)結(jié)果進(jìn)行驗證試驗，檢驗試驗結(jié)果是否與真實(shí)情況相一致。綜合考慮實(shí)際條件后對最佳工藝條件進(jìn)行修正：泵速1mL/min；魯米諾溶液pH 13.20；魯米諾溶液濃度3.00×10–4mol/L；鐵氰化鉀溶液濃度3.00×10–4mol/L。3次平行試驗的相對化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度平均值為645.580，相對誤差較理論最優(yōu)值偏低1.3%，重復(fù)性好，說明優(yōu)化結(jié)果可信。

2.2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線和精密度及檢出限

秋水仙堿質(zhì)量濃度為0.005～0.050mg/L 和0.05～ 1.00mg/L 時，秋水仙堿濃度和相對化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度呈較好的線性關(guān)系，其回歸方程分別為y=3 044.3x+ 198.05 (R2=0.994 7)和 y=304.96x+334.82 (R2=0.997 8)。對0.05mg/L 的試樣進(jìn)行11次平行測定，測出相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.78%。根據(jù)IUPAC 的相關(guān)規(guī)定，計算檢出限為3.01×10–5mg/L。

2.2.7 干擾掩蔽試驗和加標(biāo)回收試驗結(jié)果

干擾允許限為±5%時，1 000 倍的K+、Na+、Cl–、PO3–、NO3–對試驗無干擾；4 倍的 Mg2+、Ca2+和 1 倍的 Fe3+、Fe2+、Cu2+對發(fā)光體系有略微促進(jìn)作用。通過加入體積分?jǐn)?shù)2.5%的0.2 mol/L 乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)對其掩蔽，掩蔽效果良好(表4)。

表4 飲用水秋水仙堿0.05mg/L 的加標(biāo)回收試驗結(jié)果 Table 4 Colchicine detection with 0.05mg/L standard addition in drinking water

2.3 報警系統(tǒng)工作原理

報警器與流動注射化學(xué)發(fā)光法儀的光電倍增管相連，當(dāng)檢測到引起相對化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度變化的物質(zhì)時，熒光信號會在光電倍增管中轉(zhuǎn)化成變化的電流信號，進(jìn)而通過比較電路轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的電壓差，這種電壓差通過單態(tài)觸發(fā)器和多諧振蕩器使報警器工作(圖4)。

圖3 報警器工作原理 Fig. 3 Operating principle of the alarm apparatus

3 結(jié)論

利用秋水仙堿能顯著抑制魯米諾–鐵氰化鉀化學(xué)發(fā)光體系發(fā)光的特點(diǎn)，建立了一種在線飲用水中秋水仙堿預(yù)警的方法，該方法經(jīng)響應(yīng)面法優(yōu)化后，檢出限可達(dá)3.01×10–5mg/L，線性范圍為0.005～0.05mg/L 和0.05～1.00mg/L。本方法具有靈敏度高、操作方便、實(shí)時預(yù)警等特點(diǎn)，能夠及時測出飲用水中秋水仙堿含量并報警，從而可避免大規(guī)模飲用水安全事故的發(fā)生。

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