方志存，李如丹，劉少春*，高欣欣，樊仙，刀靜梅，鄧軍，張躍彬，郭家文

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所，云南 開遠(yuǎn) 661699；2.云南省甘蔗遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 開遠(yuǎn) 661699)

甘蔗(Saccharum officinarum L.)是全球種植面積和產(chǎn)量最大的糖料作物。中國(guó)甘蔗種植面積約1.55×106hm2，居全球第3 位[1–2]。目前，中國(guó)制糖甘蔗原料的收獲主要依靠手工作業(yè)，而收獲用工占整個(gè)甘蔗原料生產(chǎn)用工量的55%，其中剝?nèi)~用工占整個(gè)收獲用工量的65%[3]。甘蔗葉鞘剝離的難易程度不僅是影響收獲甘蔗效率的一個(gè)重要因素，而且葉鞘剝離的干凈率直接影響到制糖甘蔗原料的含雜率[4]。選育自然脫葉性狀好的品種不僅可以節(jié)省大量的勞動(dòng)力投入，還可減少制糖甘蔗原料的含雜率，提高制糖甘蔗原料的質(zhì)量。植物葉片脫落是植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)、代謝調(diào)控和基因表達(dá)等多種變化協(xié)同作用的結(jié)果[5]。有研究[6–9]表明，與植物器官脫落相關(guān)的酶類主要有纖維素酶(EG)、果膠(甲)酯酶(PME)、過(guò)氧化物酶(POD)等。POD 作為一種重要的多功能代謝酶，參與植物生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞分裂與分化、器官脫落調(diào)節(jié)等多種生理活動(dòng)[10–11]。POD 與禾本科作物、葉類蔬菜植物的器官衰老脫落密切相關(guān)[12–13]。有研究表明，POD 的主要作用機(jī)制為通過(guò)氧化吲哚乙酸(IAA)來(lái)促進(jìn)細(xì)胞的脫落分化，加速離區(qū)細(xì)胞衰老，促進(jìn)離層細(xì)胞的脫落[14]。甘蔗葉片自然脫落與蔗葉POD 活性的相關(guān)性少見報(bào)道。本研究中選擇自然脫葉性狀不同的甘蔗栽培品種為材料，測(cè)定成熟期各個(gè)階段蔗葉、葉鞘和葉痕的POD 活性，探討自然脫葉率的動(dòng)態(tài)變化，分析蔗葉POD 活性和甘蔗自然脫葉的相關(guān)性，以期明確影響甘蔗自然脫葉性狀的關(guān)鍵酶類，為選育自然脫葉性良好的甘蔗品種提供理論依據(jù)。

1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于云南省開遠(yuǎn)市北郊云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所試驗(yàn)基地(103°15′E，23°42′N)，海拔1 055 m，年均降水740 mm，年均氣溫19.8℃。試驗(yàn)地土壤有機(jī)質(zhì)含量為20.5g/kg，全氮含量1.64g/kg，全磷含量0.67g/kg，全鉀含量13.7g/kg，堿解氮含量80.79mg/kg，速效磷含量9.81mg/kg，速效鉀含量112.78mg/kg，pH 6.0。

2 材料與方法

2.1 材料

供試甘蔗品種有自然易脫葉型品種云蔗03–194、云蔗01–1413；自然難脫葉型品種桂糖02–467、云蔗99–91。上述材料均由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所提供。

2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每1個(gè)不同脫葉性狀的甘蔗品種為1個(gè)處理，每個(gè)小區(qū)面積36 m2，3次重復(fù)，材料播種時(shí)間2013年3月15日。田間管理按大田生產(chǎn)管理進(jìn)行，保持正常生長(zhǎng)。

2.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

2.3.1 蔗葉POD 活性的測(cè)定

從甘蔗生長(zhǎng)進(jìn)入成熟期早期(2013年11月15日)開始第1次采樣，依次設(shè)成熟前期、成熟中期、成熟中后期、成熟后期共4個(gè)成熟階段，每個(gè)成熟階段間隔20 d 采樣1次。每個(gè)小區(qū)每次采樣選擇生長(zhǎng)正常的甘蔗植株5 株，形態(tài)學(xué)上完全展開葉為+1葉，往下整取+2 葉的葉片、葉鞘、葉痕(葉痕基線上下各1 cm 的蔗莖組織)各部位的樣品。樣品取后迅速用液氮速凍，帶回實(shí)驗(yàn)室，保存于-80℃超低溫冰箱，用于POD 活性測(cè)定。

分別取不同葉位葉痕、葉鞘、葉片樣品各1.000g，0～4℃冰浴，用0.05 mol/L 磷酸緩沖液(pH 5.5)研磨提取，提取液完全轉(zhuǎn)移到15mL 離心管中，用緩沖液定容至10mL，搖勻，采用Eppendorf 5417R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)離心(5 000 r/min，4℃離心8min)，取上清液，4℃保存，作為過(guò)氧化物酶粗提液。重復(fù)3次。過(guò)氧化物酶活性測(cè)定參照劉萍等[16]的方法：取具塞管2 支，1 支作為對(duì)照(混合液中的1mL 酶液用緩沖液代替)，1 支加入4mL 混合液(2mL 濃度0.05 mol/L 緩沖液、1mL 濃度0.05 mol/L愈創(chuàng)木酚、1mL 過(guò)氧化物酶粗提液)和2% H2O21mL，搖勻(計(jì)時(shí))，在波長(zhǎng)470 nm 下每0.5min 記錄光密度值，以每0.5min光密度值變化表示活性大小。

2.3.2 甘蔗脫葉率調(diào)查

分別在甘蔗成熟前期、成熟中期、成熟中后期、成熟后期共4個(gè)階段調(diào)查植株的自然展開總?cè)~位數(shù)和自然脫葉數(shù)，計(jì)算脫葉率。脫葉率=自然脫葉數(shù)/總?cè)~數(shù)×100%。

2.4 數(shù)據(jù)分析

采用 Microsoft Excel 2003 整理數(shù)據(jù)，用SPSS18.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析(ANOVA)和處理間的顯著性檢驗(yàn)(Duncan)。

3 結(jié)果與分析

3.1 甘蔗成熟期葉片、葉鞘和葉痕的POD 活性

3.1.1 葉片的POD 活性

從圖1 可以看出，云蔗03–194 葉片的POD 活性最高，極顯著高于云蔗01–1413 桂糖02–467 和云蔗99–91。在成熟前期、成熟中期、成熟中后期，云蔗 01–1413 葉片 POD 活性極顯著高于桂糖02–467 和云蔗99–91，其中，在成熟前期，云蔗03–194 POD 活性最高，達(dá)3 527.47 U/(g·min)，比云蔗99–91 葉片POD 活性432.07 U/(g·min)高8.2倍。與中后期比，成熟后期4個(gè)品種葉片POD 活性迅速升高。

圖1 不同成熟時(shí)期供試品種葉片的POD 活性 Fig. 1 Changes of POD activity of leaf among experimental sugarcane cultivars in various stages of maturity

3.1.2 葉鞘的POD 活性

由圖2 可見，在不同的成熟階段，云蔗03–194葉鞘的POD 活性最高，極顯著高于云蔗01–1413、桂糖02–467 和云蔗99–91。在成熟前期、成熟中期、

圖2 不同成熟時(shí)期供試品種葉鞘的POD 活性 Fig.2 Changes of POD activity of leaf sheath among experimental sugarcane cultivars in various stages of maturity

成熟后期，云蔗01–1413 葉鞘的POD 活性極顯著高于桂糖02–467 和云蔗99–91，其中，在成熟前期云蔗03–194 葉鞘POD 活性最高，達(dá)755.87 U/(g·min)；在成熟中后期云蔗99–91 的POD 活性最低達(dá)，為40.00 U/(g·min)。與中后期比較，成熟后期4個(gè)品種葉鞘POD 活性大幅度升高。

3.1.3 葉痕的POD 活性

從圖3 可見，在不同的成熟階段，易脫葉型品種云蔗03–194 葉痕的POD 活性極顯著高于難脫葉型品種云蔗99–91 和桂糖02–467(P＜0.01)。4個(gè)甘蔗品種在成熟后期葉痕的POD 活性均高于成熟中后期，云蔗03–194 葉痕的POD 活性最高，為428 U/(g·min)。成熟后期云蔗99–91 葉痕的POD 活性為成熟中后期的34.2 倍。

圖3 不同成熟時(shí)期供試品種葉痕的POD 活性 Fig.3 Changes of POD activity of leaf scar among experimental sugarcane cultivars in various stages of maturity

3.2 甘蔗成熟期不同品種的自然脫葉率

由表1 可以看出，在不同成熟階段，自然脫葉率從高到低的品種依次為云蔗 03–194、云蔗01–1413、桂糖02–467、云蔗99–91，自然易脫葉型品種云蔗03–194 和云蔗01–1413 的脫葉率極顯著高于自然難脫葉型品種云蔗 99–91 和桂糖02–467。在成熟后期，云蔗03–194 脫葉率高達(dá)52.12%，而云蔗99–91 的脫葉率僅為12.70%。

表1 不同品種的自然脫葉率 Table 1 Defoliation rate of different sugarcane varieties

3.3 蔗葉POD 活性與自然脫葉率的相關(guān)性分析

相關(guān)分析結(jié)果(表2)顯示，在甘蔗整個(gè)成熟時(shí)期，葉鞘、葉片、葉痕的POD 活性與蔗葉脫葉率的相關(guān)性呈逐漸遞減的趨勢(shì)。在甘蔗成熟后期，葉片、葉鞘和葉痕POD 活性與自然脫葉率相關(guān)性均達(dá)顯著或極顯著正相關(guān)。在整個(gè)成熟過(guò)程，葉鞘的POD 活性與甘蔗的自然脫葉率呈顯著正相關(guān)或極顯著正相關(guān)。

表2 蔗葉的POD 活性與自然脫葉率的相關(guān)分析結(jié)果 Table 2 Correlation analysis between abscission rate of sugarcane leaf and POD activity

4 結(jié)論與討論

POD是一種廣譜性酶，由細(xì)胞核內(nèi)對(duì)應(yīng)的DNA轉(zhuǎn)錄生成mRNA，之后以mRNA 為模板在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)合成，并轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞壁、液泡內(nèi)，可在質(zhì)外體間運(yùn)輸，參與植物生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞分裂與分化，促使植物器官脫落[10–11,16]。Marja 等[17]研究了歐洲赤松松針脫落過(guò)程中POD 活性的變化表明，POD 活性的增加能夠促進(jìn)松針的脫落。棉花棉幼鈴、柑橘幼果脫落過(guò)程中，POD 活性隨之上升[18–19]。本研究結(jié)果表明，在不同成熟階段，易脫葉型品種云蔗03–194 的葉片、葉鞘、葉痕的POD 活性均極顯著高于難脫葉型品種桂糖02–467 和云蔗99–91，在成熟前期、成熟中期和成熟后期，易脫葉型品種云蔗01–1413 葉片、葉鞘的POD 活性也極顯著高于難脫葉型品種桂糖 02–467 和云蔗 99–91，而云蔗03–194、云蔗01–1413、桂糖02–467、云蔗99–91的自然脫葉率呈逐漸遞減的趨勢(shì)，易脫葉型品種葉片、葉鞘、葉痕較高的POD 活性與其較高的自然脫葉率相對(duì)應(yīng)。在整個(gè)成熟過(guò)程，葉鞘POD 活性與甘蔗自然脫葉率呈顯著或極顯著正相關(guān)，這表明葉鞘POD 活性的高低更能真實(shí)反映甘蔗自然脫葉的難易程度。

植物不同器官的POD活性存在較大差異，一般來(lái)說(shuō)植物幼嫩組織的POD活性高于衰老部位。對(duì)黃花菜花序POD酶活性的研究表明，花梗上的POD 活性高于外花瓣的POD 活性[20]。馬建萍等[21]對(duì)粟根、莖、葉、鞘和穗的POD活性研究表明，穗的酶活性最強(qiáng)，葉鞘的酶活性最弱，菊花嫩葉的POD酶同工酶帶最多，其次為老葉，再次為嫩莖，而木質(zhì)化莖的酶帶最少[22]。本研究結(jié)果表明，在不同成熟階段，相同葉位葉片、葉鞘和葉痕的POD活性存在極顯著差異，葉片的POD活性極顯著高于葉鞘和葉痕。在4個(gè)成熟時(shí)期，云蔗03–194、云蔗01–1413、云蔗03–194的葉片、葉鞘、葉痕的POD活性呈遞減趨勢(shì)，桂糖02–467在成熟后期葉片、葉痕、葉鞘的POD活性也呈遞減趨勢(shì)，這表明甘蔗葉片可能是POD酶合成的主要部位，POD由葉片細(xì)胞合成后，通過(guò)質(zhì)外體運(yùn)輸?shù)饺~鞘、葉痕等部位，但甘蔗葉片POD轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理尚不清楚。

前人對(duì)多種作物的研究[23–26]表明，在低溫脅迫的條件下，草莓、落葵、西瓜、黃瓜等POD 活性也相應(yīng)升高。本研究結(jié)果表明，與甘蔗成熟中后期比，在甘蔗成熟后期，4個(gè)供試甘蔗品種葉片、葉鞘和葉痕POD 的活性呈規(guī)律性大幅度升高，這可能與這一時(shí)期試驗(yàn)田間出現(xiàn)了低溫霜凍(–2 )℃天氣脅迫有關(guān)。

有研究[3]報(bào)道甘蔗葉鞘內(nèi)源纖維素酶對(duì)脫葉發(fā)生有調(diào)控作用。本研究結(jié)果表明，甘蔗葉鞘的POD活性與甘蔗自然脫葉率呈顯著正相關(guān)。下一步將探索內(nèi)源乙烯、脫落酸(ABA)、果膠酶等激素和酶對(duì)甘蔗脫葉的影響，進(jìn)一步從生理水平上明確調(diào)控甘蔗脫葉的關(guān)鍵酶類和激素。

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