潘先良, 鐘 明, 馮務(wù)群

(1. 岳陽新華達(dá)制藥有限公司, 湖南 岳陽 414000; 2. 湖南理工學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院, 湖南 岳陽 414006; 3. 湖南中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校, 湖南 株洲 412012)

乙氧基白屈菜紅堿與人血清白蛋白的相互作用

潘先良1,2, 鐘 明2, 馮務(wù)群3

(1. 岳陽新華達(dá)制藥有限公司, 湖南 岳陽 414000; 2. 湖南理工學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院, 湖南 岳陽 414006; 3. 湖南中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校, 湖南 株洲 412012)

采用熒光光譜法研究了乙氧基白屈菜紅堿(ECHE)與人血清白蛋白(HSA)相互作用的機(jī)制. 在模擬人體生理條件下, 根據(jù)二者相互作用的光譜學(xué)特征, 采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)方程和熱力學(xué)方程計算了三個溫度下ECHE與HAS的結(jié)合參數(shù). 結(jié)果表明: 在290K, 300K, 310K時ECHE與人血清白蛋白的結(jié)合常數(shù)分別為1.595×105L·mol-1, 1.718×105L·mol-1, 1.680×105L·mol-1; 結(jié)合位點(diǎn)數(shù)分別為1±0.06; 二者之間的主要作用力為靜電作用力. 研究表明ECHE與人血清白蛋白之間作用生成了無熒光效應(yīng)的復(fù)合物, 屬靜態(tài)猝滅.

乙氧基血根堿; 人血清白蛋白; 熒光猝滅

白屈菜紅堿(Chelerythrine, CHE) 是一種具有抗菌、抗病毒及抑制腫瘤細(xì)胞等活性的苯并菲啶類生物堿[1], 通?？蓮睦浰诳浦参锶绨浊?、血水草、博落回中提取出來, 其分子式為C21H18NO4+, 結(jié)構(gòu)式如圖1A所示. CHE是蛋白激酶C(PKC)的選擇性抑制劑, 它的許多生物學(xué)活性都與PKC有關(guān)[2～7], 宗永立等人的研究也表明[3], CHE體外抗腫瘤作用較強(qiáng), 能明顯抑制宮頸癌細(xì)胞、癌肉瘤、食道癌WHC-05、白血病HL-60細(xì)胞、鼻咽癌KB細(xì)胞、L1210細(xì)胞、P388細(xì)胞和胃癌細(xì)胞等的生長, 其作用機(jī)理是抑制細(xì)胞周期、抑制細(xì)胞中蛋白激酶C活性、并能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等, 因此它也是一種很有前途的細(xì)胞毒性抗腫瘤化合物. 由于乙醇是CHE重結(jié)晶過程中的常用溶劑, 而乙醇中的乙氧基在結(jié)晶過程中易于接到CHE分子的六號位上, 故大多數(shù)情況下所得的CHE實(shí)為其乙氧基化合物(Ethoxychelerythine, ECHE), 其分子結(jié)構(gòu)見圖1B. 二者結(jié)構(gòu)上的差異使得ECHE的生物活性較CHE的性質(zhì)會發(fā)生相應(yīng)的改變. 由于藥物在人體中的運(yùn)輸主要是借助人體血漿中的血清白蛋白(HSA)實(shí)現(xiàn)的, 因此深入探討ECHE與HSA的相互作用對于研究白屈菜紅堿的抗腫瘤機(jī)制具有極為重要的意義[8～10].

本實(shí)驗在模擬人體生理條件(pH值為7.4)下, 采用熒光光譜研究了ECHE與HSA結(jié)合作用的光譜特征, 獲得了二者相互結(jié)合的熱力學(xué)參數(shù). 可為乙氧基白屈菜紅堿在人體內(nèi)的運(yùn)輸和代謝過程及藥理藥效研究提供有益的參考.

圖1 CHE(A)與ECHE(B)的分子結(jié)構(gòu)式

1 實(shí)驗部分

1.1 儀器與試劑

主要儀器為LS-55熒光分光光度計(美國珀金埃爾默公司, PerkinElmer)及金壇市天竟實(shí)驗儀器公司的高精度超級恒溫循環(huán)水浴鍋, 梅特勒精密電子分析天平. 上海精密儀器廠生產(chǎn)的PH-3S型pH計. CHE標(biāo)準(zhǔn)品及實(shí)驗用的ECHE樣品均為湖南理工學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院天然藥物實(shí)驗室提供, 被配制成濃度為1.0×10-3mol/L的儲備液, 于4℃的暗處保存. 配制濃度為0.1mol· L-1的Tris-HC1緩沖溶液, pH為7.4, 并以此溶液配制濃度為1×10-5mol/L的HAS儲備液, 儲存在冰箱中備用. 其它試劑均為分析純.

1.2 實(shí)驗方法

控制溫度為290K, 用移液管精密移取3ml 2×10-6mol/L的HSA溶液于比色皿中, 加入5 Lμ的ECHE待測液, 混勻, 反應(yīng)5min后測定其熒光, 并在同步掃描模式下記錄. 然后再通過微量進(jìn)樣器加入5 Lμ的ECHE待測液, 處理同上, 共加入9次的ECHE待測液. 設(shè)置激發(fā)波長為280nm, 記錄發(fā)射光譜的掃描范圍為200～500nm. 儀器的熒光同步掃描波長差 (λΔ)分別設(shè)置15nm和60nm, 掃描范圍調(diào)整為240～320nm. 用同樣的方法掃描在300K, 310K時反應(yīng)產(chǎn)物的發(fā)射光譜及同步熒光, 記錄相應(yīng)的熒光光譜.

2 結(jié)果與討論

2.1 ECHE對HSA 的熒光猝滅光譜

HAS是人血清中最重要的載體蛋白,它的分子中含有三種具有熒光效應(yīng)的氨基酸殘基, 包括色氨酸(Trp), 酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe). HSA的內(nèi)源熒光主要是由這三種蛋白引起的, 但由于Phe殘基的量子產(chǎn)率很低, Tyr殘基易電離或遇到-NH2、-COOH時易猝滅, 因此Trp殘基熒光對HSA的內(nèi)源熒光貢獻(xiàn)最大. 由于藥物與HSA 結(jié)合的時候可以形成無熒光效應(yīng)的復(fù)合物, 因此隨著藥物的不斷加入, HSA分子的熒光能被顯著地猝滅. 圖2是按1.2節(jié)的實(shí)驗方法測得ECHE對HSA 的熒光猝滅光譜(310K).

圖2 ECHE對HSA 的熒光猝滅光譜(310K)

由圖2可見, 隨著ECHE濃度的增加, HSA的熒光強(qiáng)度從到486減弱到266, 顯示出ECHE對HAS分子的熒光具有強(qiáng)烈的猝滅作用. 隨著ECHE濃度的增加, 熒光強(qiáng)度的降低越來越小, 但ECHE不能完全猝滅HSA的熒光, 卻使得其熒光發(fā)射峰的位置稍稍紅移. 由于分子構(gòu)象與熒光發(fā)射峰的性質(zhì)直接相關(guān), 由此可見, ECHE與HSA的結(jié)合影響了HAS的分子構(gòu)象, 使得HAS的熒光特性發(fā)生了相當(dāng)?shù)母淖?

藥物對HAS熒光的猝滅可能是動態(tài)猝滅, 也可能是靜態(tài)猝滅. 如果是動態(tài)猝滅, 則遵循Stem-volmer方程[7]:

其中Kq為雙分子猝滅過程速率常數(shù), τ0為猝滅劑不存在時物質(zhì)的熒光壽命, 生物大分子的動態(tài)猝滅常數(shù)最大為2×1010L/mol-1s-1, Ksv為動態(tài)猝滅常數(shù), [Q]是ECHE的濃度, F0和F分別為未加ECHE和加入ECHE時HSA的熒光強(qiáng)度. 圖3為對[Q]所作的Stem-Volmer曲線, 計算出的直線斜率即為K.

sv

對圖3中的三條直線進(jìn)行擬合, 得到290K, 300K, 310K時的速率常數(shù)分別為1.202×1013, 1.015×1013, 1.049×1013, 通過Stern-Volmer方程得出的HSA與ECHE非共價結(jié)合的猝滅常數(shù)隨溫度升高呈下降趨勢,且遠(yuǎn)大于生物大分子的最大動態(tài)猝滅常數(shù), 這表明ECHE對HSA的猝滅過程不是動態(tài)猝滅過程, 而是靜態(tài)猝滅.

2.2 結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)的確定

對于靜態(tài)猝滅過程[8], HAS的熒光激發(fā)強(qiáng)度與藥物濃度的關(guān)系可通過方程式(2)來描述:

圖3 不同溫度下ECHE與HSA 相互作用的Stem-Volmer圖

圖4 不同溫度下ECHE猝滅HSA的雙對數(shù)方程圖

根據(jù)圖4中三條直線的截距和斜率可以求算不同溫度下的K和n值, 見表1. 由表1可以知ECHE與HSA有較強(qiáng)的結(jié)合力. 二者結(jié)合位點(diǎn)數(shù)為1±0.06, 可認(rèn)為二者之間的結(jié)合方式為1:1 結(jié)合.

表1 不同溫度下ECHE與HSA的結(jié)合常數(shù)與結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

2.3 ECHE與HSA之間作用力的確定

小分子藥物與蛋白的結(jié)合可能存在著多種作用力, 如范德華力、疏水作用, 還有靜電作用及氫鍵等等,通過藥物—蛋白結(jié)合反應(yīng)的熱力學(xué)參數(shù)可以衡量二者之間的作用力類型. Ross[10]等人根據(jù)反應(yīng)前后熱力學(xué)熵變ΔS和焓變ΔH的相對大小, 得出了可以判斷藥物與蛋白質(zhì)之間的主要作用力類型的熱力學(xué)規(guī)律:當(dāng)ΔH＞0, 且ΔS＞0時, 是疏水作用力; 當(dāng)ΔH＜0, 且ΔS＞0時, 是靜電作用力; 當(dāng)ΔH＜0, 且ΔS＜0時, 是范德華力和氫鍵.

由于本實(shí)驗所選溫度范圍在290～310K之間, 這個溫差之內(nèi)的HAS在結(jié)構(gòu)上的改變可完全忽略, 故ΔH 可看作常數(shù), 根據(jù)范德霍夫方程

可計算不同溫度下藥物與HSA結(jié)合的ΔH與ΔS. 其中K1、K2分別為T1、T2下對應(yīng)的結(jié)合常數(shù). 結(jié)果見表2.

由表2中數(shù)據(jù)可以看出ECHE與HSA之間的作用力主要為靜電作用力, 反應(yīng)過程是一個放熱的過程, 溫度的升高不利于反應(yīng)的進(jìn)行.ΔG＜0說明ECHE與HSA的結(jié)合反應(yīng)是自發(fā)的.

表2 ECHE與HSA相互作用的熱力學(xué)參數(shù)

2.4 同步熒光測定藥物ECHE構(gòu)象的影響

HAS周圍環(huán)境的極性變化對其熒光效應(yīng)影響很大, 通常若色氨酸殘基附近的極性增大, 則HSA的疏水性降低, 蛋白的結(jié)構(gòu)就變得疏松, 導(dǎo)致熒光發(fā)射光譜紅移; 如果殘基所處環(huán)境的極性降低, 則熒光效應(yīng)相反. 因此環(huán)境的極性變化會影響蛋白質(zhì)的構(gòu)象, 并直接體現(xiàn)在HAS殘基的最大發(fā)射波長的變化. 當(dāng)選擇波長差Δλ=15nm 時, 測得的是Try殘基的熒光光譜, 而選擇波長差Δλ=60nm 時只表現(xiàn)色Trp的光譜特征. 由圖5(A)、圖5(B)可以看出, 由于ECHE與HSA分子的作用, Trp殘基和Tyr殘基所處的環(huán)境疏水性降低, 這可能是ECHE分子中的苯環(huán)插入到了HAS的疏水性空腔中, 使得HSA鏈有所伸展所致.

圖5 ECHE猝滅HSA的同步熒光光譜λΔ=60nm(A), λΔ=15nm(B)

3 結(jié)論

考察了三個溫度下ECHE與HSA相互作用方式, 利用熒光光譜得到了ECHE與人血清白蛋白的結(jié)合常數(shù)()Ka, 分別為1.595×105L·mol-1(290K), 1.718×105L·mol-1(300K), 1.680 ×105L·mol-1(310K), 結(jié)合位點(diǎn)數(shù)()n是1±0.06; 二者靠靜電作用力結(jié)合; 反應(yīng)的GΔ＜0, 說明結(jié)合過程是自發(fā)的. 實(shí)驗證明, ECHE與HSA結(jié)合生成了無熒光效應(yīng)的基態(tài)復(fù)合物, 導(dǎo)致了HSA內(nèi)源熒光的猝滅, 該猝滅屬于靜態(tài)猝滅. 同步熒光結(jié)果表示, ECHE與HSA降低了HSA中Trp殘基周圍環(huán)境的極性, 增強(qiáng)了疏水性, 使其蛋白結(jié)構(gòu)就變得疏松. 隨著ECHE濃度的增大, HAS中肽鏈的伸展程度也增大. 本研究為ECHE的藥理研究提供了可靠的實(shí)驗依據(jù).

[1] 劉素彥, 祝仕清, 牛長群. LC-MS法測定犬血漿中白屈菜紅堿的濃度[J]. 中國臨床藥學(xué)雜志, 2006, 15(6): 377～379

[2] 宗永立, 劉艷平. 白屈菜紅堿誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)理綜述[J]. 時珍國醫(yī)國藥, 2006, 17(10): 2068～2071

[3] 宗永立, 劉艷平. 白屈菜紅堿對人胃癌BGC823細(xì)胞的增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用[J]. 中草藥, 2006, 36(7): 1054～1056

[4] John T. Fong, Wutigri Nimlamool, Matthias M. Falk. EGF induces efficient Cx43 gap junction endocytosis in mouse embryonic stem cell colonies via phosphorylation of Ser262, Ser279/282, and Ser368[J]. FEBS Letters, 2014, 588(5): 836～844

[5] 郭 明, 何 玲, 魯小旺. 5-羥甲基糠醛與不同血清白蛋白的結(jié)合反應(yīng)機(jī)制研究[J]. 藥學(xué)學(xué)報, 2012, 47 (3): 385～392

[6] Savina A A,Tolkachev O N, Sheichenko V I. Disproportionation of the alkaloid sanguinarine on silica gel[J]. Pharmaceutical Chemistry Journal, 1999, 33(4): 196～199

[7] F Martín, L Mora, ML Laorden and MV Milanés. Protein kinase C phosphorylates the cAMP response element binding protein in the hypothalamic paraventricular nucleus during morphine withdrawal [J]. BRITISH JOURNAL OF PHARMACOLOGY, 2011, 163(4): 857～875

[8] 劉雪雪. 光譜法研究小分子與核酸的相互作用及同時測定酚類物質(zhì)[D]. 鄭州: 鄭州大學(xué)碩士學(xué)位論文, 2013

[9] Zhang Q Z. Study of interaction between the nucleobase-modified nucleoside and serum albumin[D].Xinxiang: HenanNormal University, 2008(in Chinese).

[10] Ni Yongnian, Lin Daiqin, Serge K. Synchronous Fluorescence and UV-vis Spectrometric Study of the Compitive Interaction of Chlorpromazine Hydrochloride and Neutral Redwith DNA Using Chemometrics Approaches [J]. Talanta, 2005, 65: 1295～1302

The Interaction of Human Serum Albumin with Ethoxychelerythine

PAN Xian-liang1,2, ZHONG Ming2, FENG Wu-qun3
(1.Yueyang Xinhuada Pharmaceuticals Ltd. Yueyang, 414000, China 2. College of Chemistry and Chemical Engineering, Hunan Institute of Science and Technology, Yueyang, 414006, China 3. Hunan Traditional Chinese Medical College, Zhuzhou412012, China)

Fluorescence spectrophotometry was employed to investigate the interaction of human serum albumin (HSA) with ethoxysaguinarine (ECHE). According to Lineweaver-Burk equation and thermodynamic equation, the binding constants and binding sites at different temperatures for the interaction of HSA with ethoxysaguinarine were obtained. The binding constants at three temperatures were 1.595×105Lmol-1(290K), 1.718×105L·mol-1(300K) and 1.680×105L·mol-1(310K) respectively. The binding-site was about 1±0.06. The intermolecular forces between them were electrostatic forces. It was shown that ECHE quenches the fluorescence of HAS by forming the ECHE-BSA complex. The quenching mechanism in the experiment was mainly attributed to static quenching.

ethoxysanguinarine; human serum albumin; fluorescence quenching

O561.3; O629.7

A

1672-5298(2015)03-0069-04

2015-07-02

國家自然科學(xué)基金項目(21276071); 湖南省科技計劃項目(2013FJ3007); 湖南省教育廳高校創(chuàng)新平臺開放基金項目(2015); 岳陽市產(chǎn)學(xué)研結(jié)合創(chuàng)新平臺立項建設(shè)科技攻關(guān)項目(2013)

潘先良(1966- ), 男, 湖南岳陽人, 岳陽新華達(dá)制藥有限公司研發(fā)中心工程師. 主要研究方向: 新產(chǎn)品開發(fā)

鐘 明(1966- ), 男, 湖南岳陽人, 湖南理工學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院教授. 主要研究方向: 天然產(chǎn)物