姜云水，李劍波，高孟，任皎，金素鳳，陳剛，吳潔，莊昉成，田厚文

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人乳頭瘤病毒16型L2E7融合蛋白的優(yōu)化表達(dá)、制備及其對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用

姜云水1，李劍波1，高孟1，任皎2，金素鳳1，陳剛1，吳潔1，莊昉成1，田厚文2

1 浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒病研究所浙江省醫(yī)學(xué)生物工程疫苗研究開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州 310052 2 中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所，北京 102206

姜云水, 李劍波, 高孟, 等. 人乳頭瘤病毒16型L2E7融合蛋白的優(yōu)化表達(dá)、制備及其對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用. 生物工程學(xué)報(bào), 2015, 31(4): 566–576.Jiang YS, Li JB, Gao M, et al. Optimized expression, preparation of human papillomavirus 16 L2E7 fusion protein and its inhibitory effect on tumor growth in mice. Chin J Biotech, 2015, 31(4): 566–576.

為提高人乳頭瘤病毒(HPV) 16型治療性融合蛋白疫苗HPV16 L2E7在大腸桿菌中的表達(dá)量，根據(jù)大腸桿菌偏愛(ài)密碼子，對(duì)HPV16基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，優(yōu)化后的基因分別插入到pGEX-5X-1、pQE30和pET41a表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化JM109、JM109 (DE3) 和BL21 (DE3) 表達(dá)菌，篩選出高表達(dá)菌株pET41a-HPV16s/BL21 (DE3)，目的蛋白從占全菌蛋白的10%以下提高到約28%，優(yōu)化接種量、IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時(shí)間，獲得最佳表達(dá)條件；通過(guò)15 L發(fā)酵罐發(fā)酵，SP Sepharose Fast Flow、Q Sepharose Fast Flow和Superdex 200 pg純化及復(fù)性HPV16 L2E7融合蛋白，制備的融合蛋白純度可達(dá)95%以上，經(jīng)SDS-PAGE、Western blotting鑒定證實(shí)，制備的HPV16 L2E7蛋白加CpG佐劑對(duì)小鼠移植瘤生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用，有75% (6/8) 的小鼠不成瘤，為后續(xù)的疫苗產(chǎn)業(yè)化奠定基礎(chǔ)。

人乳頭瘤病毒16型，優(yōu)化表達(dá)，發(fā)酵，純化，宮頸癌，疫苗

根據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，宮頸癌是當(dāng)前造成婦女癌癥死亡的主要因素之一，嚴(yán)重威脅婦女健康[1-3]。分子流行病調(diào)查結(jié)果證實(shí)，生殖道的高危型人乳頭瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)感染與宮頸癌有著十分密切的關(guān)系，高危型HPV的慢性、持續(xù)性感染被認(rèn)為是宮頸癌及其癌前病變的主要原因，HPV16、18型是最常見(jiàn)的型別，其中約55%的宮頸癌與HPV16型感染相關(guān)[2,4-5]。目前對(duì)宮頸癌的治療主要采用放化療和手術(shù)治療，副作用大、復(fù)發(fā)率較高且花費(fèi)較大。采用特異性的免疫方法即疫苗接種的辦法預(yù)防和治療HPV的感染是有效預(yù)防宮頸癌的重要手段之一。目前預(yù)防性疫苗研究已取得較大進(jìn)展，在美國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家已經(jīng)上市使用，但其僅用于沒(méi)有感染過(guò)HPV的人群[6-7]，針對(duì)已有的HPV持續(xù)性感染和宮頸癌及癌前病變患者，尚未有十分有效的免疫治療方法用于臨床，因此，研制高效、廉價(jià)的而且具備治療作用的HPV疫苗迫在眉睫。

由于HPV在體外難于培養(yǎng)及其致癌性，完整的病毒顆粒不大可能發(fā)展為疫苗，只能研制基因工程疫苗。病毒的次要衣殼蛋白L2同時(shí)具有中和抗體表位和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞 (Cytotoxin T lymphocyte，CTL) 表位，腫瘤相關(guān)抗原E7是誘導(dǎo)和維持癌細(xì)胞惡性表型所必需的蛋白，L2與E7融合后免疫機(jī)體能產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫[8-9]。本課題組選擇HPV16型L2蛋白融合已去除轉(zhuǎn)化活性的E7蛋白作為治療性疫苗的靶抗原，通過(guò)密碼子優(yōu)化、表達(dá)載體及菌株的篩選，利用基因工程技術(shù)獲得了1株高效表達(dá)HPV16 L2E7融合蛋白的工程菌株；然后通過(guò)優(yōu)化表達(dá)菌的培養(yǎng)誘導(dǎo)條件，摸索高密度發(fā)酵工藝、層析純化和復(fù)性工藝，制備了純度≥95%的HPV16 L2E7融合蛋白，復(fù)性后的蛋白在初步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中顯示了顯著的腫瘤抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌株

質(zhì)粒pET41a、pGEX-5X-1、pQE30和大腸埃希桿菌JM109、JM109 (DE3)、BL21 (DE3)由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。pET30a-質(zhì)粒由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所應(yīng)急技術(shù)中心提供，含HPV16 L2完整的編碼區(qū)序列及經(jīng)修飾的完整E7編碼區(qū) 序列。

1.1.2 主要試劑

限制性?xún)?nèi)切酶、T4 DNA連接酶購(gòu)自TaKaRa公司，Ex酶購(gòu)自Invitrogen公司。DNA marker購(gòu)自天為時(shí)代公司。羊抗鼠IgG辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記物購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。HPV16型L2單抗和E7單抗均由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所應(yīng)急技術(shù)中心饋贈(zèng)。胰蛋白胨和酵母提取物購(gòu)自O(shè)XOID公司。SP Sepharose Fast Flow、Q Sepharose Fast Flow和Superdex 200 pg均購(gòu)自GE Healthcare公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

C57BL/6(H-2b)小鼠，雌性，6?8周齡，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育中心。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的設(shè)計(jì)與合成

以pET30a-質(zhì)粒中基因?yàn)槟０?，在保持編碼的產(chǎn)物蛋白氨基酸序列不變的前提下，結(jié)合大腸桿菌優(yōu)勢(shì)密碼子及mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，利用基因密碼子簡(jiǎn)并性原則，設(shè)計(jì)出適合在大腸桿菌中表達(dá)HPV16 L2E7融合蛋白的核苷酸序列，命名為HPV16。設(shè)計(jì)好的基因序列交予上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成并插入pGEM-T Easy載體中，命名為pGEM-T-HPV16。

1.2.2重組表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)載體序列分別設(shè)計(jì)3套引物，引物中加入RⅠ和Ⅰ酶切位點(diǎn)序列，采用PCR方法從pGEM-T-HPV16擴(kuò)增出HPV16片段。PCR產(chǎn)物和載體pGEX-5X-1、pQE30、pET41a分別用核酸內(nèi)切酶RⅠ和Ⅰ酶切。酶切后的載體和HPV16s基因片段用T4 DNA連接酶連接。連接后的產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化感受態(tài)JM109、JM109 (DE3) 和BL21 (DE3)：pGEX-HPV16s、pQE30-HPV16轉(zhuǎn)化JM109，pET41a-HPV16轉(zhuǎn)化JM109 (DE3)和BL21 (DE3)?？剐院Y選出來(lái)的克隆以PCR法驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果陽(yáng)性的克隆進(jìn)行基因測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.3 高表達(dá)菌株的篩選

將上述篩選出的陽(yáng)性克隆菌株pGEX-HPV16/JM109、pQE30-HPV16/ JM109、pET41a-HPV16/BL21 (DE3)、pET41a-HPV16/JM109 (DE3)以及對(duì)照菌株pET30a- HPV16/BL21 (DE3) 根據(jù)載體的抗性分別接種于含抗生素Amp和Kana (100 μg/mL) 的LB培養(yǎng)基中，37 ℃、300 r/min振蕩培養(yǎng)至600達(dá)0.6?1.0時(shí)，加入IPTG至終濃度0.5 mmol/L，37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)3 h。表達(dá)菌進(jìn)行SDS-PAGE分析，根據(jù)表達(dá)量的高低篩選出目的菌株用于后續(xù)研究。

1.2.4 HPV16 L2E7融合蛋白的表達(dá)條件優(yōu)化

篩選出的高表達(dá)菌株pET41a-HPV16/ BL21 (DE3) 分別進(jìn)行接種量和誘導(dǎo)條件的優(yōu)化。表達(dá)條件的優(yōu)化采用搖瓶試驗(yàn)方法，接種量分別選擇0.5%、2%和4%，IPTG濃度分別選擇終濃度為0.1、0.5和1.0 mmol/L，誘導(dǎo)溫度選擇30 ℃和37 ℃，誘導(dǎo)時(shí)間分別選擇2、4、6和8 h，接種量比較采取每小時(shí)取樣比濁法檢測(cè)菌液600值；誘導(dǎo)條件比較采用離心收集菌體，進(jìn)行8% SDS-PAGE，并用Quantity One軟件分析蛋白表達(dá)量的百分比。高密度發(fā)酵條件以搖瓶摸索的結(jié)果為基礎(chǔ)進(jìn)一步優(yōu)化。

1.2.5 HPV16 L2E7融合蛋白的發(fā)酵

高表達(dá)菌株pET41a-HPV16/BL21 (DE3) 經(jīng)LB搖床培養(yǎng)至600達(dá)0.8?1.0時(shí)，以5%的接種比例接種至含TB培養(yǎng)基的15 L發(fā)酵罐中 (德國(guó)B.BRAUN，Biostat C plus) 中，發(fā)酵溫度37 ℃，攪拌速度300?700 r/min，pH維持在7.0左右，溶氧保持在20%以上，期間恒定流加補(bǔ)料A (酵母粉100 g/L，檸檬酸5 g/L，氯化鎂5 g/L，氯化鈣2 g/L)，定時(shí)取樣監(jiān)測(cè)菌體密度，當(dāng)600達(dá)25左右時(shí)，降溫至30 ℃，加入IPTG至終濃度1.0 mmol/L進(jìn)行誘導(dǎo)，期間根據(jù)發(fā)酵液中的葡萄糖濃度、pH值和溶氧反饋流加補(bǔ)料B (蛋白胨150 g/L，酵母粉100 g/L，葡萄糖250 g/L)，誘導(dǎo)4 h后下罐離心收獲。離心后的菌體–20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 HPV16 L2E7融合蛋白的純化及柱上復(fù)性

發(fā)酵收獲的菌體經(jīng)高壓勻漿破碎后，離心收獲包涵體沉淀，包涵體經(jīng)洗滌后用變性緩沖液 (20 mmol/L Tris-Cl，8 mol/L尿素，5 mmol/L DTT，2 mmol/L EDTA-2Na，pH 8.0) 溶解，離心收集上清。層析柱SP Sepharose Fast Flow用平衡緩沖液 (20 mmol/L Tris-Cl，8 mol/L尿素，2 mmol/L DTT，pH 8.0) 平衡，離心上清上柱吸附，用緩沖液B沖洗平衡后用緩沖液C (20 mmol/L Tris-Cl，8 mol/L尿素，2 mmol/L DTT，1 mol/L NaCl，pH8.0) 梯度洗脫，收集目的蛋白峰。層析柱Q Sepharose Fast Flow用緩沖液D (20 mmol/L Tris-Cl，8 mol/L 尿素，10 mmol/L GSH，1 mmol/LGSSG，pH 8.0) 平衡，目的蛋白峰收集液稀釋后上柱吸附，用緩沖液D沖洗平衡至基線后，線性梯度緩慢增加緩沖液E (20 mmol/L Tris-Cl， 1 mol/L尿素，10 mmol/L GSH，1 mmol/L GSSG，pH 8.0) 濃度至100%，最后用緩沖液F (20 mmol/L Tris-Cl，1 mol/L尿素，10 mmol/L GSH，1 mmol/L GSSG，1 mol/L NaCl，pH 8.0) 線性梯度洗脫，收集目的蛋白峰。復(fù)性后的目的蛋白在層析柱Superdex 200 pg上進(jìn)一步純化及替換緩沖液，復(fù)性后的蛋白最終替換至緩沖液G (20 mmol/L Tris-Cl，0.1 mol/L精氨酸，pH 7.5) 中保存。最終純化產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE、Western blotting、N端測(cè)序等鑒定。

1.2.7 HPV16 L2E7融合蛋白的腫瘤生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)分為PBS對(duì)照組、HPV16 L2E7+CpG組 (CpG 10 μg/只，HPV16 L2E7分別為30 μg/只、60 μg/只、90 μg/只)，每組8只小鼠，將1.2×104個(gè)TC-1腫瘤細(xì)胞于C57BL／6小鼠腹股溝皮下注射，第二天經(jīng)肌肉分別注射PBS和不同劑量的HPV16 L2E7蛋白+CpG佐劑，100 μL/只，兩周后相同劑量蛋白加強(qiáng)免疫，每周觀察腫瘤生長(zhǎng)情況。

2 結(jié)果

2.1 密碼子優(yōu)化、表達(dá)載體的構(gòu)建及高表達(dá)菌株的篩選

密碼子優(yōu)化后的大小為1 713 bp的全基因片段插入pGEM-T Easy質(zhì)粒中，獲得質(zhì)粒pGEM-T-HPV16，HPV16密碼子優(yōu)化序列經(jīng)測(cè)序與設(shè)計(jì)的理論序列完全相符。以質(zhì)粒pGEM-T-HPV16為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物端添加RⅠ和Ⅰ內(nèi)切酶位點(diǎn)，獲得 1 731 bp的PCR產(chǎn)物，經(jīng)RⅠ和Ⅰ雙酶切后插入表達(dá)載體pGEX-5X-1、pQE30、pET41a中，成功構(gòu)建HPV16 L2E7的原核表達(dá)載體pGEX-HPV16、pQE30-HPV16、pET41a- HPV16，構(gòu)建好的表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化感受態(tài)JM109、JM109 (DE3) 和BL21 (DE3) 篩選得到表達(dá)菌pGEX-HPV16/JM109、pQE30- HPV16/JM109、pET41a-HPV16/JM109 (DE3)、pET41a-HPV16/BL21 (DE3)。表達(dá)菌經(jīng)PCR法驗(yàn)證，擴(kuò)增出與理論值相符的約 1.7 kb的產(chǎn)物片段 (圖1)，表達(dá)載體經(jīng)測(cè)序證明目的基因插入正確，序列未發(fā)生堿基突變。

IPTG誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果 (圖2) 顯示，與基因密碼子優(yōu)化前的對(duì)照菌株pET30a-HPV16/BL21 (DE3)相比，菌株pET41a-HPV16/BL21 (DE3) 目的蛋白的表達(dá)量得到了明顯提高，目的蛋白從占全菌蛋白的10%以下提高到約28%，因此確定pET41a-HPV16/BL21 (DE3) 作為最優(yōu)菌株用于后續(xù)的蛋白制備研究。

圖1 不同表達(dá)菌株的PCR鑒定

2.2 HPV16 L2E7融合蛋白的表達(dá)條件優(yōu)化與發(fā)酵

前期研究表明本菌株繁殖30代 (10?15 h)內(nèi)質(zhì)粒保有率≥95%，因此整個(gè)發(fā)酵周期控制在10?15 h內(nèi)。不同接種量600檢測(cè)結(jié)果顯示2%、4%和6%的接種量培養(yǎng)4 h內(nèi)均已進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，而0.5%的接種量進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的時(shí)間明顯推遲 (圖3)；不同IPTG濃度不同時(shí)間誘導(dǎo)結(jié)果顯示0.5和1.0 mmol/L的IPTG濃度誘導(dǎo)的目的蛋白表達(dá)量明顯高于0.1 mmol/L，誘導(dǎo)2 h和4 h，目的蛋白表達(dá)百分比保持穩(wěn)定，6 h后開(kāi)始下降 (圖4)；30 ℃和37 ℃誘導(dǎo)，目的蛋白的表達(dá)量未見(jiàn)明顯差異 (圖5)。高密度發(fā)酵條件以搖瓶摸索的結(jié)果為基礎(chǔ)進(jìn)行優(yōu)化，接種量以5%和10%進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，10%接種量獲得的菌體總量比5%高，但是目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量低于5%，而且發(fā)酵后期細(xì)菌增長(zhǎng)過(guò)快造成補(bǔ)料添加速度跟不上，因此選擇5%的接種量；誘導(dǎo)則采用 1.0 mmol/L IPTG濃度37 ℃誘導(dǎo)4 h。15 L發(fā)酵罐的發(fā)酵工藝為：搖瓶活化的菌種當(dāng)600達(dá)0.8?1.0時(shí)，以5%的接種量接種，37 ℃培養(yǎng)約 5 h左右，600達(dá)到25以上，降溫至30 ℃，加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)4 h后下罐收獲發(fā)酵液約10 L，離心后收獲菌體濕重約800 g。

2.3 HPV16 L2E7融合蛋白的純化及復(fù)性

HPV16 L2E7在大腸桿菌內(nèi)主要以不溶的包涵體形式存在，發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)高壓勻漿破碎離心后獲得包涵體、包涵體經(jīng)洗滌去除大量雜蛋白 (圖6A)、8 mol/L尿素變性溶解后經(jīng)SP Sepharose Fast Flow初步純化，Q Sepharose Fast Flow柱上復(fù)性，Superdex 200 pg精細(xì)純化后獲得純度≥95%目的蛋白的純化產(chǎn)物 (圖6B)。純化產(chǎn)物Western blotting結(jié)果顯示，在相對(duì)分子量約97 kDa處可見(jiàn)與L2和E7的抗體反應(yīng)帶 (圖6C)。純化產(chǎn)物SDS-PAGE割膠純化后的蛋白質(zhì)N端測(cè)序結(jié)果顯示與理論序列相符。

圖2 不同表達(dá)菌株表達(dá)量的SDS-PAGE分析

圖3 接種量對(duì)重組表達(dá)菌株pET41a-HPV16sl2e7/ BL21 (DE3) 生長(zhǎng)的影響

圖5 誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)HPV16 L2E7融合蛋白表達(dá)量的影響

2.4 HPV16 L2E7融合蛋白對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用

PBS對(duì)照組在接種腫瘤細(xì)胞后28 d內(nèi)全部成瘤，抑瘤率 (0/8，0%)，HPV16 L2E7+CpG 30 μg組有2只小鼠不成瘤，抑瘤率 (2/8，25%)，HPV16 L2E7+CpG 60 μg和90 μg組有6只小鼠不成瘤，抑瘤率 (6/8，75%) (圖7)。與PBS對(duì)照組相比，HPV16 L2E7+CpG 30 μg組的抑瘤率雖有不同，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (=0.13)，HPV16 L2E7+CpG 60 μg和90 μg組則差異性極顯著 (＜0.01)，而HPV16 L2E7+CpG 30 μg組和60 μg、90 μg組則差異顯著 (0.05＞＞0.01)。

3 討論

治療性疫苗的作用機(jī)制主要是誘發(fā)強(qiáng)的CTL反應(yīng)，從而識(shí)別并殺傷被病毒感染的細(xì)胞。HPV治療性疫苗的靶抗原主要為衣殼蛋白和早期與腫瘤相關(guān)的蛋白。主要衣殼蛋白L1和次要衣殼蛋白L2中含有中和抗原表位和CTL表位，其與腫瘤相關(guān)抗原E6或E7融合后能刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫[8]，E6、E7基因在癌前病變和宮頸癌中是持續(xù)表達(dá)的，它們通過(guò)失活PRb和P53抑癌蛋白，破壞細(xì)胞周期調(diào)控，從而導(dǎo)致上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化[10-12]，L1或L2融合去除轉(zhuǎn)化活性的E6和或E7蛋白可作為治療性疫苗的靶抗原[13-15]。相對(duì)于型特異性的L1基因，L2全長(zhǎng)或L2 N端高度保守序列能誘發(fā)產(chǎn)生廣泛交叉保護(hù)作用的中和抗體[16-19]；E7序列較E6更為保守，而且更容易獲得高水平的表 達(dá)[20]，因此選擇L2和E7蛋白作為HPV16治療性疫苗的靶抗原。

大腸桿菌由于其遺傳背景清楚、成本低廉、生產(chǎn)率高、操作簡(jiǎn)單成為克隆和表達(dá)外源基因的首選[21-22]，但是由于種屬特異性等原因，外源蛋白在大腸桿菌中表達(dá)往往存在表達(dá)量低、表達(dá)產(chǎn)物活性低或者以無(wú)活性的包涵體形式存在，給后續(xù)的純化和復(fù)性帶來(lái)了極大的挑戰(zhàn)[23]。經(jīng)過(guò)幾十年的發(fā)展，大量商用的表達(dá)載體及配套菌株可供選擇，為了獲得高表達(dá)的具有活性的目的蛋白用于后續(xù)的研究以及產(chǎn)業(yè)化，需要考慮多方面的因素，包括密碼子的偏好性、表達(dá)載體和表達(dá)宿主菌的篩選、表達(dá)條件的優(yōu)化 等[22,24]。合作單位前期構(gòu)建了表達(dá)系統(tǒng)pET30a-HPV16/BL21(DE3)，表達(dá)的蛋白經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明了具有抗腫瘤移植的作用[25]。但是表達(dá)量偏低，難以滿足產(chǎn)業(yè)化的要求，因此，本研究首先進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，用大腸桿菌的偏愛(ài)密碼子替換了原始密碼子，從基因?qū)用嫔咸岣吡嗣艽a子的適應(yīng)性。表達(dá)載體及菌株的選擇也是影響蛋白表達(dá)的因素之一，優(yōu)化后的基因分別選用3個(gè)不同體系的表達(dá)載體和相應(yīng)的菌株來(lái)進(jìn)行表達(dá)量的篩選，篩選的結(jié)果顯示：與基因密碼子優(yōu)化前的原始菌株pET30a- HPV16/BL21 (DE3) 相比，菌株pET41a- HPV16/BL21 (DE3) 目的蛋白的表達(dá)量得到了明顯的提高。

獲得高表達(dá)菌株pET41a-HPV16/ BL21 (DE3) 后，本實(shí)驗(yàn)在搖瓶上選擇接種量、IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時(shí)間幾個(gè)參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，為后續(xù)的高密度發(fā)酵提供了初步依據(jù)。接種量的大小直接影響發(fā)酵周期，采用稍大的接種量可以縮短菌體生長(zhǎng)的遲滯期，明顯縮短發(fā)酵時(shí)間，但太大的接種量會(huì)因?yàn)閹脒^(guò)多的代謝廢物，反而影響菌體的生長(zhǎng)。從圖3結(jié)果可以看出，除了0.5%的接種量，2%、4%和6%的接種量菌體的生長(zhǎng)速度差不多，培養(yǎng)4 h內(nèi)均已進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，因此在發(fā)酵罐上進(jìn)一步摸索5%和10%的接種量，以期通過(guò)提高接種量在一定的時(shí)間內(nèi)獲得更高的菌體密度，最終提高產(chǎn)物的比生產(chǎn)率 (單位體積單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)物的產(chǎn)量)，但是發(fā)現(xiàn)過(guò)高的菌體密度造成了目的蛋白相對(duì)表達(dá)量的降低，同時(shí)增大了發(fā)酵體系的負(fù)擔(dān)，因此選擇5%的接種量。IPTG為異丙 基-β-D-硫代半乳糖苷，是一種十分有效的乳糖操縱子的誘導(dǎo)劑，可與阻遏物結(jié)合促進(jìn)基因的表達(dá)。以IPTG作為誘導(dǎo)劑，其作用是與阻遏物結(jié)合，起解阻遏作用。因此當(dāng)所加入的IPTG量足以封閉所有阻遏物位點(diǎn)時(shí)，即為理論上的最佳濃度。IPTG濃度過(guò)高時(shí)，對(duì)菌體具有一定的毒性作用，影響細(xì)胞的繁殖和生長(zhǎng)。對(duì)于帶普通T7啟動(dòng)子載體，終濃度為0.4 mmol/L的IPTG可以實(shí)現(xiàn)完全誘導(dǎo)，而帶有T7啟動(dòng)子的載體則需要終濃度為1 mmol/L的IPTG才能完全誘導(dǎo)。pET-41a為帶有T7啟動(dòng)子的載體，理論上需要1 mmol/L的IPTG才能完全誘導(dǎo)。搖瓶實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明0.5和1.0 mmol/L的IPTG濃度誘導(dǎo)的目的蛋白表達(dá)量明顯高于0.1 mmol/L，綜合考慮發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)的菌體密度較高，所以選擇終濃度為 1 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)時(shí)間則根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果定為4 h。

HPV16 L2E7蛋白是以不溶的包涵體形式表達(dá)的，表達(dá)的蛋白因?yàn)殄e(cuò)誤折疊、二硫鍵錯(cuò)配等原因需要變性溶解后復(fù)性獲得活性蛋白，盡管37 ℃和30 ℃誘導(dǎo)的總表達(dá)量無(wú)明顯差異，但是30 ℃誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白從包涵體純度、變性容易程度以及復(fù)性率上高于37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白，這可能是由于37 ℃誘導(dǎo)蛋白表達(dá)速率過(guò)高，造成蛋白錯(cuò)誤折疊率高有關(guān)，低溫誘導(dǎo)有利于提高蛋白的折疊率從而提高蛋白的可溶性及活性。后期進(jìn)行的25 ℃、30 ℃和37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果表明，30 ℃和37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白還是以包涵體為主，25 ℃誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白則呈現(xiàn)膠體狀，需要長(zhǎng)時(shí)間的離心才能分離，蛋白的可溶性和純度明顯提高，但是25 ℃誘導(dǎo)在得率上降低明顯，而且誘導(dǎo)時(shí)間大大延長(zhǎng)，不利于后期產(chǎn)業(yè)化的工藝。大腸桿菌表達(dá)的變性蛋白的復(fù)性方法有透析復(fù)性、稀釋復(fù)性和層析柱上復(fù)性等[26-27]，近年來(lái)層析柱上復(fù)性由于效率高且兼具純化作用而成為研究熱點(diǎn)[28]，本實(shí)驗(yàn)通過(guò) Q Sepharose Fast Flow陰離子交換層析柱上復(fù)性的方法，獲得了可溶的具有免疫活性的目的蛋白，但是復(fù)性率偏低，未復(fù)性的蛋白在柱上沉淀吸附，今后將進(jìn)一步優(yōu)化復(fù)性條件以提高復(fù)性得率。

本實(shí)驗(yàn)制備的蛋白在小鼠荷瘤模型上顯示出特異性的抑制腫瘤作用且具有劑量效應(yīng)，與PBS對(duì)照組和HPV16 L2E7+CpG 30 μg組相比，HPV16 L2E7+CpG 60 μg以上即具有顯著的抑瘤效果，但是最終還是有25%的小鼠誘發(fā)腫瘤，說(shuō)明單獨(dú)免疫一定劑量的融合蛋白疫苗誘發(fā)的免疫反應(yīng)有限，今后進(jìn)一步加大劑量以及與病毒載體疫苗等其他類(lèi)型的疫苗聯(lián)合免疫將有助于提高免疫效果。

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(本文責(zé)編郝麗芳)

Optimized expression, preparation of human papillomavirus 16 L2E7 fusion protein and its inhibitory effect on tumor growth in mice

Yunshui Jiang1, Jianbo Li1, Meng Gao1, Jiao Ren2, Sufeng Jin1, Gang Chen1, Jie Wu1, Fangcheng Zhuang1, and Houwen Tian2

1,,,310052,,2,,102206,

HPV16 L2E7 is a fusion protein used for therapeutical vaccine targeting HPV virus. To increase its expression in, we optimized the codon usage of HPV16gene based on its codon usage bias. The optimized gene of HPV16was cloned into three different vectors: pGEX-5X-1, pQE30, ET41a, and expressed in JM109, JM109 (DE3) and BL21 (DE3) lines separately. A high expression line was selected with pET41a vector in BL21 (DE3) cells. After optimization of the growth condition, including inoculation amount, IPTG concentration, induction time and temperature, the expression levelof HPV16 L2E7 was increased from lessthan 10% to about 28% of total protein. HPV16 L2E7 protein was then purified from 15L culture by means of SP Sepharose Fast Flow, Q Sepharose Fast Flow and Superdex 200 pg. After renaturing, HPV16 L2E7 protein with ≥95% purity was achieved, which was confirmed via SDS-PAGE gel and Western blotting. The combined use of purified HPV16 L2E7 and CpG helper has shown clear inhibition of tumor growth in mice injected with tumor cells, with six out of eight mice shown no sign of tumor. Thisstudy lays a solid foundation for a new pipeline of large-scale vaccine production.

human papillomavirus 16, optimized expression, fermentation, purification, uterine cervica cancer, vaccines

July 23, 2014; Accepted:September 22, 2014

Fangcheng Zhuang. Tel/Fax: +86-571-88861601; E-mail: fczhuang@163.com Houwen Tian. Tel/Fax: +86-10-58900881; E-mail:houwent@126.com

Supported by:National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2006AA02Z490), Science and Technology Planning Project of Zhejiang Province (No. 2012F10005).

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網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2014-10-10

http://www.cnki.net/kcms/doi/10.13345/j.cjb.140390.html