王興春，陳釗，樊娟，何苗苗，韓淵懷，楊致榮

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利用RNA-Seq技術(shù)鑒定擬南芥不定芽再生相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子

王興春1,2，陳釗3，樊娟1，何苗苗1，韓淵懷2,4，楊致榮3

1 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷 030801 2 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究所，山西太谷 030801 3 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)文理學(xué)院，山西太谷 030801 4 農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，山西太原 030031

王興春, 陳釗, 樊娟, 等. 利用RNA-Seq技術(shù)鑒定擬南芥不定芽再生相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子. 生物工程學(xué)報, 2015, 31(4): 552–565.Wang XC, Chen Z, Fan J, et al. Identifying transcription factors involved in Arabidopsis adventious shoot regeneration by RNA-Seq technology. Chin J Biotech, 2015, 31(4): 552–565.

轉(zhuǎn)錄調(diào)控是不定芽再生過程的主要調(diào)控方式之一，但具體機制尚需進(jìn)一步研究。為此，利用基于Illumina HiSeq? 2000測序平臺的RNA-Seq技術(shù)分析了不定芽再生缺陷突變體和野生型WS在愈傷形成和不定芽再生過程以及野生型WS從脫分化向再分化轉(zhuǎn)變過程差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子 (Transcription factor，TF) 編碼基因。結(jié)果表明：與野生型WS相比，在脫分化過程差異表達(dá)的TF編碼基因有155個，其中表達(dá)量上調(diào)的97個，表達(dá)量下調(diào)的58個；在再分化過程差異表達(dá)的TF編碼基因有68個，其中表達(dá)量上調(diào)的40個，表達(dá)量下調(diào)的28個；而在野生型WS從脫分化向再分化轉(zhuǎn)變的過程，總共檢測到231個差異表達(dá)的TF編碼基因，包括160個表達(dá)量上調(diào)的基因和71個表達(dá)量下調(diào)的基因。其中，MYB-related (v-myb禽成髓細(xì)胞瘤病毒癌基因) 家族的不定芽相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因在突變體脫分化階段的表達(dá)量提高了3 217倍，是表達(dá)量上調(diào)最大的TF編碼基因。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，該基因過量表達(dá)導(dǎo)致愈傷形成和不定芽再生缺陷，并抑制了幼苗特別是主根的生長發(fā)育，表明該基因是愈傷形成和不定芽再生過程的一個負(fù)調(diào)控因子。本研究不僅加深了人們對不定芽再生轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制的認(rèn)識，而且為今后不定芽再生相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的研究提供了大量候選基因信息。

不定芽再生，愈傷組織形成，RNA-Seq，轉(zhuǎn)錄因子，轉(zhuǎn)錄調(diào)控，擬南芥

作為植物再生完整植株的主要方式之一，不定芽再生不僅廣泛應(yīng)用于植物快速繁殖，而且是利用生物技術(shù)進(jìn)行作物遺傳改良的前提和基礎(chǔ)[1]。植物激素尤其是細(xì)胞分裂素和生長素是影響不定芽再生的最主要因素。經(jīng)典的擬南芥兩步不定芽再生法即是通過調(diào)控這兩種激素的比例來實現(xiàn)的：第一步，將擬南芥外植體在含有高濃度2,4-D的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基 (Callus induction medium，CIM) 上進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)，即可在外植體中柱鞘部位形成愈傷組織[2]；第二步，將愈傷組織再轉(zhuǎn)移到含有高濃度細(xì)胞分裂素的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基(Shoot induction medium，SIM) 繼續(xù)培養(yǎng)，即可分化出不定芽[3]。因此，人們曾經(jīng)樂觀地認(rèn)為只要合理調(diào)控細(xì)胞分裂素和生長素的比例，所有植物的組織或器官都能經(jīng)過不定芽再生出完整植株。但時至今日，有些植物的離體再生仍非常困難，這極大地限制了基因功能的研究和重要農(nóng)藝性狀基因的應(yīng)用。長期以來，人們普遍認(rèn)為愈傷組織的形成是體細(xì)胞重編程從而回到一種未分化狀態(tài)的過程。但Sugimoto等[4]的研究表明，各種器官形成的愈傷組織基因表達(dá)模式與根頂端分生組織的基因表達(dá)模式類似；而且愈傷組織和側(cè)根的起始受到相同基因的調(diào)控，影響擬南芥?zhèn)雀l(fā)育的基因同樣也會影響植物離體器官發(fā)生。該研究從根本上改變了人們認(rèn)為愈傷組織是未分化的細(xì)胞這一傳統(tǒng)觀念，使人們對不定芽再生機制有了更清晰的認(rèn)識。

上述細(xì)胞分裂素和生長素調(diào)控不定芽再生的過程實質(zhì)上是相關(guān)基因被激活或抑制的過程，在這一過程中轉(zhuǎn)錄因子起著極其重要的作用[5]。LBD (Lateral organ boundaries domain) 家族的、、和位于生長素信號下游，在CIM培養(yǎng)基上被迅速誘導(dǎo)表達(dá)[6]。這4個基因中的任何一個過量表達(dá)都會促進(jìn)愈傷組織的形成；相反，功能缺失后導(dǎo)致愈傷形成能力受阻，表明LBDs轉(zhuǎn)錄因子是愈傷形成所必需的[6]。類似的，細(xì)胞分裂素早期響應(yīng)的關(guān)鍵因子B型ARR在不定芽再生過程也起著關(guān)鍵的作用，而B型ARR是一類MYB轉(zhuǎn)錄因子[7-8]。APETALA2 (AP2) 家族的ESR1 (Enhancer of shoot regeneration 1) 是細(xì)胞分裂素信號下游的調(diào)控因子，過量表達(dá)及其同源基因可以促進(jìn)不定芽的再生[9-11]。對和功能缺失突變體和的分析表明，單突變體不定芽再生能力都明顯下降，而且雙突變體不定芽再生能力比任何一個單突變體都差，暗示了這兩個基因存在功能冗余[11]。AP2家族的另一成員的表達(dá)量在不定芽分化過程中顯著增加，而該基因的突變則影響了芽分生組織特異基因的表達(dá)從而導(dǎo)致不定芽分化頻率降低[12]。LFY (Leafy) 轉(zhuǎn)錄因子是一個調(diào)控植物從營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵因子[13]。當(dāng)基因過量表達(dá)時，擬南芥根外植體可以直接再生出花器官，表明花發(fā)育相關(guān)基因在花器官離體再生過程也同樣起著重要的作用[14]。盡管如此，人們對不定芽再生過程仍缺乏系統(tǒng)深入的認(rèn)識。高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)，使得大規(guī)模系統(tǒng)分離和鑒定不定芽再生相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子成為可能[15-17]。

最近，我們在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了一個編碼糖苷水解酶13家族的() 基因，該基因的EMS點突變體愈傷形成和不定芽再生嚴(yán)重受阻[18]。為了闡明不定芽再生過程的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制，我們利用RNA-Seq技術(shù)檢測了突變體與野生型在愈傷形成和不定芽再生兩個階段以及野生型從脫分化向再分化轉(zhuǎn)變過程差異表達(dá)的基因，從中發(fā)現(xiàn)一大批相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，并對其中一個負(fù)調(diào)控因子() 基因進(jìn)行了深入研究。這些基因可作為不定芽再生轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制研究的候選基因，其分離和鑒定將有助于全面解析不定芽再生調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1 材料與方法

1.1 植物材料和培養(yǎng)條件

RNA-Seq所用的擬南芥材料為Wassilewskija (WS) 野生型和突變體[18-19]。雌激素誘導(dǎo)的條件性過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因種子來自歐洲擬南芥種質(zhì)中心 (European Arabidopsis Stock Centre，NASC) 的TRANSPLANTA種質(zhì)[20]。除非特別說明，擬南芥種子均播種于1/2 MS培養(yǎng)基：2.3 g/L MS基本鹽 (Murashige and Skoog Basal Medium w/Vitamins，PhytoTechnology Laboratories，貨號M519)、2%蔗糖和0.8%的瓊脂粉，pH值5.8。擬南芥幼苗和外植體生長溫度均為22 ℃。采用T8 LED燈管照明，燈管紅、藍(lán)、橙和白光燈珠的比例6∶2∶1∶1。光周期為16 h光照/8 h黑暗交替，光照強度為80?120 μmol/(m2·s)。

1.2 愈傷組織和不定芽的誘導(dǎo)

愈傷組織和不定芽的誘導(dǎo)參照王興春等[17-18]的方法進(jìn)行：用剪刀剪取20?30 μmol/(m2·s)弱光下培養(yǎng)的擬南芥下胚軸，置于CIM培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷，7 d后再轉(zhuǎn)移到SIM培養(yǎng)基誘導(dǎo)不定芽。CIM和SIM的配方詳見王興春等[17-18]的報道。

1.3 總RNA的提取和RNA-Seq高通量測序及測序數(shù)據(jù)分析

RNA-Seq實驗材料為在CIM培養(yǎng)7 d的WS (命名為WS-CIM7) 和(命名為-CIM7) 以及在SIM培養(yǎng)2 d的WS (命名為WS-SIM2) 和(命名為-SIM2)。為了提高實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性并節(jié)約測序費用，我們進(jìn)行了3次生物學(xué)重復(fù)。3次重復(fù)的樣品分別提取RNA，然后等量混合用于RNA-Seq測序，測序反應(yīng)僅進(jìn)行1次。首先稱取100 mg外植體材料，將其放入裝有液氮的研缽中，快速研磨成粉末；然后利用康為世紀(jì)公司含DNaseⅠ的植物RNA提取試劑盒 (貨號CW0559) 提取總RNA，提取步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。RNA-Seq高通量測序利用Illumina HiSeq? 2000測序儀進(jìn)行。測序產(chǎn)生的圖像數(shù)據(jù)首先經(jīng)堿基識別 (Base calling) 轉(zhuǎn)為原始堿基序列數(shù)據(jù)，然后去除含有接頭的序列和低質(zhì)量的序列，產(chǎn)生的數(shù)據(jù)稱之為有效讀段 (Clean reads)。對有效讀段進(jìn)行測序質(zhì)量評估、比對統(tǒng)計、測序飽和度分析和在參考基因上的分布分析，全部分析合格的即可用于基因的差異表達(dá)分析。基因表達(dá)量的計算采用RPKM法進(jìn)行[21]，根據(jù)兩個樣本間基因的RPKM值來篩選差異表達(dá)的基因。差異表達(dá)基因的篩選參照Audic等[22]的方法進(jìn)行，將錯誤發(fā)現(xiàn)率 (False discovery rate，F(xiàn)DR) ≤0.001且差異倍數(shù)不低于2倍即|log2|≥1的視為差異表達(dá)基因。

1.4 不定芽再生相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的篩選和分類

為了篩選差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，我們將所有差異表達(dá)的基因映射到Gene ontology (http://www.geneontology.org/) 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因注釋 (Gene annotation)，然后根據(jù)其參與的生物過程 (Biological process) 進(jìn)行分類，GO term為0001071具有核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性的即為不定芽再生相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。所篩選到的轉(zhuǎn)錄因子根據(jù)PlantTFDB 3.0[23]進(jìn)行分類。

1.5 雌激素誘導(dǎo)基因過量表達(dá)

愈傷形成階段雌激素誘導(dǎo)及觀察方法：在CIM培養(yǎng)基中添加10 μmol/L的17 β-雌二醇 (貨號E-8875，Sigma-Aldrich)，培養(yǎng)7 d。然后，利用Olympus BX51顯微鏡觀察拍照。不定芽再生階段雌激素誘導(dǎo)方法：弱光培養(yǎng)的擬南芥下胚軸在無17 β-雌二醇的CIM培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d，然后再轉(zhuǎn)移到含有10 μmol/L的17 β-雌二醇的SIM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。擬南芥幼苗的雌激素誘導(dǎo)方法：將擬南芥種子播種在含有不同濃度 17 β-雌二醇的1/2 MS培養(yǎng)基，4 ℃低溫春化2 d，取出后置于擬南芥培養(yǎng)間培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA-Seq測序結(jié)果評估

為了解析突變體在愈傷形成和不定芽再生兩個階段以及野生型WS從脫分化向再分化轉(zhuǎn)變過程差異表達(dá)的TF編碼基因，我們選取了在CIM培養(yǎng)7 d的WS (WS-CIM7) 和(-CIM7) 以及在SIM培養(yǎng)2 d的WS (WS-SIM2) 和(-SIM2) 進(jìn)行RNA-Seq分析。經(jīng)測序WS-CIM7、-CIM7、WS-SIM2和-SIM2 4個樣品分別得到10 184 656、10 898 770、9 399 484和9 788 169條有效讀段 (表1和表2，以及王興春等[17]的數(shù)據(jù)，NCBI Sequence Read Archive accession No.分別為SRR1144842、SRR1144843、SRR1144844、和SRR1144845)，其有效讀段分別占99.59%、99.55%、99.55%和99.56%。然后，將WS-CIM7、-CIM7、WS-SIM2和-SIM2樣品的有效讀段分別與擬南芥基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析，結(jié)果表明匹配讀段 (Total mapped reads) 分別占92.96%、92.90%、93.13%和93.02% (表1和表2，以及王興春等[17]的數(shù)據(jù))。測序飽和度分析表明，這4個樣品檢測到的基因數(shù)在測序量較小時均隨著測序量的增加而增加；當(dāng)測序量達(dá)到4 M時，其增長趨于平緩；而當(dāng)測序量達(dá)到8 M時，檢測到的基因數(shù)趨于飽和 (圖1A和1B，以及王興春等[17])。而這4個樣品的測序量均在9 M以上，因此可以認(rèn)為測序基本覆蓋細(xì)胞中表達(dá)的全部基因，具有代表性。隨后，我們又分析了有效讀段在擬南芥參考基因上的分布情況，由圖1C和1D 以及王興春等[17]的數(shù)據(jù)可知這4個樣品的有效讀段分布均勻性較好，表明mRNA是隨機打斷的。綜上所述，這4個樣品測序質(zhì)量較高，可用于下一步差異表達(dá)基因的研究。

2.2 愈傷形成過程差異表達(dá)的TF編碼基因

對CIM培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d的WS和外植體的RNA-Seq數(shù)據(jù)進(jìn)行差異比較分析，共篩選出1 860個差異表達(dá)的基因，其中TF編碼基因為155個，約占總差異表達(dá)基因的8.3% (表3)。這155個TF編碼基因中，外植體中表達(dá)量上調(diào)的有97個，表達(dá)量下調(diào)的有58個。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，這155個轉(zhuǎn)錄因子屬于26個家族，主要涉及激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、脅迫響應(yīng)和根毛或側(cè)根的發(fā)生以及生長發(fā)育的調(diào)控等過程[24-26]。值得一提的是，基因的突變導(dǎo)致(AT1G24590) 基因的表達(dá)量下降了5.05倍。該基因在不定芽再生過程起著重要的作用[11]，但對脫分化的影響還需要進(jìn)一步研究。

表1 樣品be1-CIM7測序讀段與擬南芥參考基因的比對統(tǒng)計結(jié)果

表2 樣品be1-SIM2測序讀段與擬南芥參考基因的比對統(tǒng)計結(jié)果

圖1 RNA-Seq測序質(zhì)量評估

2.3 不定芽再生早期差異表達(dá)的TF編碼基因

為了解析不定芽再生早期的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制，我們比較了野生型WS擬南芥外植體從脫分化 (樣品WS-CIM7) 向再分化 (樣品WS-SIM2) 轉(zhuǎn)變過程差異表達(dá)的基因。如表4所示，共檢測到231個差異表達(dá)的TF編碼基因，其中表達(dá)量下調(diào)的為71個，表達(dá)量上調(diào)的有160個。值得注意的是，和基因的表達(dá)量分別上調(diào)了7.59倍和2.25倍，而這兩個基因已經(jīng)被證明是不定芽再生過程的關(guān)鍵基因[9,12]。除此之外，NAC家族的() 和的表達(dá)量也大幅上調(diào)，分別上調(diào)了8.94倍和5.09倍，這一結(jié)果與Che等[12]的研究是一致的。

為了深入了解不定芽再生早期的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制并解析突變體不定芽再生障礙的原因，我們進(jìn)一步比較了在SIM培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 d的(SIM2) 和WS (WS-SIM2) 外植體中差異表達(dá)的基因。共檢測到832個差異表達(dá)基因，其中68個基因編碼轉(zhuǎn)錄因子，占8.17% (表5)。這些轉(zhuǎn)錄因子涉及20個家族，其中數(shù)目最多的為NAC家族、ERF家族和WRKY家族，分別為13個、9個和8個 (表5)。

2.4 過量表達(dá)基因抑制了不定芽再生

由于擬南芥突變體中柱鞘發(fā)育異常，從而導(dǎo)致外植體愈傷組織形成受阻[18]。我們推測，外植體愈傷形成缺陷的表型可能與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)。為了證實這一推測，并驗證所篩選轉(zhuǎn)錄因子的真實性，我們從表3中選取了一個MYB-related家族的AT3G10590基因進(jìn)行了深入研究。該基因在突變體和野生型外植體中的轉(zhuǎn)錄本數(shù)分別為13和0，RPKM值分別為3.217和0.001，表達(dá)量上升了3 217倍，是所有基因中上調(diào)倍數(shù)最大的一個，故將其命名為() 基因。此外，我們從NASC獲得了基因的兩個雌激素誘導(dǎo)過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系TPT_3.10590.1F和TPT_3.10590.1I。由于TPT_3.10590.1F和TPT_3.10590.1I在所有的實驗中表型類似，只是TPT_3.10590.1I的表型比TPT_3.10590.1F的更強，因此在本文僅給出TPT_3.10590.1I的結(jié)果，并將其命名為(ART1 overexpression)。

表3 愈傷形成過程be1-3與WS野生型相比差異表達(dá)的TF編碼基因

表4 野生型擬南芥外植體從脫分化向再分化轉(zhuǎn)變過程差異表達(dá)的TF編碼基因

為闡明在不定芽再生過程的作用，分別將和Col-0野生型的下胚軸培養(yǎng)在0和10 μmol/L雌二醇的CIM培養(yǎng)基上。培養(yǎng)7 d后，無論是在0還是10 μmol/L雌二醇CIM培養(yǎng)基上培養(yǎng)的Col-0野生型下胚軸頂端和中柱都已經(jīng)膨大形成愈傷組織，且二者無明顯差異 (圖2A和2B)，表明雌二醇對愈傷的形成無顯著影響。與野生型類似，無雌二醇CIM上培養(yǎng)的外植體頂端因形成大量愈傷而膨大成球狀 (圖2C)，而雌二醇培養(yǎng)基上培養(yǎng)的外植體頂端僅稍微變粗 (圖2D)。類似的，外植體中柱鞘部位在無雌二醇時膨大形成了突起 (圖2E)，而在雌二醇培養(yǎng)基上的則無明顯變化 (圖2F)。然后，將無雌二醇CIM培養(yǎng)的外植體分別轉(zhuǎn)到0和10 μmol/L雌二醇的SIM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。14 d后，無論是否有雌二醇，野生型外植體都可以分化出綠芽 (圖2G和2H)，但僅在無雌二醇的培養(yǎng)基上能分化出綠芽，在雌二醇培養(yǎng)基上培養(yǎng)時僅有少數(shù)綠點 (圖2I和2J)。這表明，基因是愈傷形成和不定芽再生過程的一個負(fù)調(diào)控因子。

表5 不定芽再生早期be1-3中差異表達(dá)的TF編碼基因

2.5 過量表達(dá)基因抑制了幼苗的生長發(fā)育

上述結(jié)果是在離體條件下獲得的，為解析基因在幼苗生長和發(fā)育中作用，將播種在不同濃度的17 β-雌二醇培養(yǎng)基上。結(jié)果表明，在無誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)基上，幼苗生長發(fā)育完全正常 (圖3A)，然而在雌激素培養(yǎng)基上，幼苗生長發(fā)育緩慢，根系變短 (圖3B–3F)。而且誘導(dǎo)劑的濃度越高，這種表型也越嚴(yán)重 (圖3B–3F)。在10 μmol/L 17 β-雌二醇培養(yǎng)基上，的主根不能伸長，而且長出大量毛狀根系 (圖3E和3F)。這表明，基因在植物生長發(fā)育和離體器官再生過程都起著重要的作用。

圖2 過量表達(dá)ART1基因抑制了不定芽再生

3 討論

本研究利用RNA-Seq高通量測序技術(shù)檢測了脫分化和再分化過程以及從脫分化向再分化轉(zhuǎn)變過程差異表達(dá)的TF編碼基因，獲得了不定芽再生過程轉(zhuǎn)錄調(diào)控的重要信息。擬南芥基因組中共有1 716個TF編碼基因，分屬于58個轉(zhuǎn)錄因子家族[23]。在擬南芥不定芽再生過程，共檢測到341個差異表達(dá)的TF編碼基因 (表3?5)，占擬南芥總TF編碼基因的19.87%。這341個轉(zhuǎn)錄因子分屬于29個家族，其中ERF家族是差異表達(dá)的TF編碼基因最多的家族，其次是MYB家族和NAC家族，這3個家族差異表達(dá)的基因數(shù)分別為50、40和38個，分別占差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子的14.67%、11.73%和11.14% (表3?5)。ERF家族是擬南芥中的一個轉(zhuǎn)錄因子大家族，有123個成員，占擬南芥轉(zhuǎn)錄因子總數(shù)的7.17%；而在本研究中差異表達(dá)的占總差異表達(dá)TF編碼基因的14.67%，富集了2.05倍。的富集可能與該家族廣泛參與了激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、脅迫響應(yīng)和生長發(fā)育調(diào)控等有關(guān)[27]。這暗示了與其他家族的轉(zhuǎn)錄因子相比，ERF家族的轉(zhuǎn)錄因子在不定芽再生過程可能起著更為重要的作用。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，外植體在愈傷形成和不定芽再生兩個階段表達(dá)模式一致 (均上調(diào)或下調(diào)) 的TF編碼基因有26個，表達(dá)模式不一致的TF編碼基因有5個 (表3和表5)。這26個表達(dá)模式一致的基因可能在這兩個過程都起作用，是不定芽再生轉(zhuǎn)錄調(diào)控的關(guān)鍵TF編碼基因。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)了一些已知的與不定芽再生有關(guān)的TF編碼基因，這些基因包括、和等[9,11-12]。其中，在野生型擬南芥外植體從脫分化向再分化轉(zhuǎn)變時基因的表達(dá)量上調(diào)了7.59倍；而在外植體脫分化階段基因的表達(dá)量下調(diào)了5.05倍，這與其功能是相適應(yīng)的。這表明本實驗反映了擬南芥不定芽再生過程基因差異表達(dá)的真實情況，結(jié)果是可信的。在脫分化過程，與野生型相比突變體中一系列與根系發(fā)育相關(guān)的基因差異表達(dá) (表3)，而根系尤其是側(cè)根的發(fā)育與愈傷的形成有著密切的關(guān)系[4]，深入研究這些基因的功能有望全面揭示愈傷形成和根系發(fā)育的關(guān)系。Fan等[6]的研究表明，、和等4個基因在愈傷形成過程起著重要的調(diào)控作用，但在本實驗中未檢測到這4個基因的差異表達(dá)。這可能是因為基因是一個碳水化合物代謝相關(guān)的基因，位于愈傷形成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的下游，因此其突變不會影響到上游基因的表達(dá)。不過，相對于已有的數(shù)據(jù)，本研究挖掘了更為豐富的擬南芥不定芽再生相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子信息，為今后深入研究不定芽再生轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制提供了重要的參考。

擬南芥基因通過碳水化合物代謝調(diào)控了植物生長發(fā)育和離體器官再生[18-19]，但在愈傷形成和不定芽再生兩個階段均未發(fā)現(xiàn)直接參與碳水化合物代謝的轉(zhuǎn)錄因子。其原因可能有3個：1)基因編碼一個糖苷水解酶，位于碳水化合物代謝的下游，其變化對這兩個過程中其他碳水化合物代謝影響很??；2) CIM和SIM培養(yǎng)基均添加了大量外源碳水化合物，這也可能在一定程度上影響了由于缺失導(dǎo)致的相關(guān)基因表達(dá)的程度；3) 已發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄因子中，大部分功能未知。在愈傷形成過程，外植體中表達(dá)量上調(diào)的TF編碼基因有97個，下調(diào)的TF編碼基因有58個 (表3)。外植體愈傷形成缺陷的表型可能就是由于這些基因表達(dá)變化導(dǎo)致的。進(jìn)一步實驗表明，表達(dá)量上調(diào)倍數(shù)最大的基因是愈傷形成的一個負(fù)調(diào)控因子，其過量表達(dá)導(dǎo)致愈傷形成和不定芽再生嚴(yán)重受阻。但這并不意味著基因過量表達(dá)是導(dǎo)致突變體愈傷形成缺陷的唯一原因。要證明這一推測，可以構(gòu)建的雙突變體，進(jìn)一步分析愈傷形成情況。若雙突變體再生能力與野生型相同，則表明基因過量表達(dá)是導(dǎo)致突變體愈傷形成缺陷的主要原因，否則表明不定芽再生缺陷是多種原因造成的。此外，基因突變導(dǎo)致基因表達(dá)量大幅上調(diào)，表明基因負(fù)調(diào)控基因的表達(dá)。但這種調(diào)控不是直接的，可能是由于基因的代謝產(chǎn)物 (例如碳水化合物) 抑制了基因的表達(dá)。

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(本文責(zé)編陳宏宇)

Identifying transcription factors involved inadventious shoot regeneration by RNA-Seq technology

Xingchun Wang1,2, Zhao Chen3, Juan Fan1, Miaomiao He1, Yuanhuai Han2,4, and Zhirong Yang3

1,,030801,,2,,030801,,3,,030801,,4,,030031,,

Transcriptional regulation is one of the major regulations in plant adventious shoot regeneration, but the exact mechanism remains unclear. In our study, the RNA-seq technology based on the Illumina HiSeq? 2000 sequencing platform was used to identify differentially expressed transcription factor (TF) encoding genes during callus formation stage and adventious shoot regeneration stage between wild type and adventiousshoot formationdefective mutantand during the transition from dedifferentiation to redifferentiation stage in wildtype WS. Results show that 155 TFs were differentially expressed betweenmutant and wild type during callus formation, of which 97 genes were up-regulated, and 58 genes were down-regulated; and that 68 genes were differentially expressed during redifferentiation stage, with 40 genes up-regulated and 28 genes down-regulated; whereas at the transition stage from dedifferentiation to redifferention in WS wild type explants, a total of 231 differentially expressed TF genes were identified, including 160 up-regualted genes and 71 down-regulated genes. Among these TF genes, the adventious shoot related transcription factor 1 () gene encoding a MYB-related (v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog) TF, was up-regulated 3 217 folds, and was the highest up-regulated gene duringcallus formation. Over expression of thegene caused defects in callus formation and shoot regeneration and inhibited seedling growth, indicating that thegene is a negative regulator of callus formation and shoot regeneration. This work not only enriches our knowledge about the transcriptional regulation mechanism of adventious shoot regeneration, but also provides valuable information on candidate TF genes associated with adventious shoot regeneration for future research.

adventious shoot regeneration, callus formation, RNA-Seq, transcription factor, transcriptional regulation,

November 4, 2014; Accepted: December 11, 2014

Xingchun Wang. Tel: +86-354-6287191-307; E-mail: wxingchun@163.com Zhirong Yang. Tel: +86-354-6288341; E-mail: zryangsx@163.com

Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 31100235), Natural Science Foundation of Shanxi (No. 2013011028-1), Shanxi Scholarship Council of China (No. 2010050).

國家自然科學(xué)基金(No. 31100235)，山西省自然科學(xué)基金 (No. 2013011028-1)，山西省回國留學(xué)人員科研資助項目(No. 2010050) 資助。

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2015-02-03

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.q.20150203.1622.003.html