李國輝，李芒芒，周倩，胡朝陽，唐琦，姚勤

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利用優(yōu)化改造的家蠶桿狀病毒表達系統(tǒng)提高NS1表達產(chǎn)量

李國輝，李芒芒，周倩，胡朝陽，唐琦，姚勤

江蘇大學生命科學研究院，江蘇鎮(zhèn)江 212013

李國輝, 李芒芒, 周倩, 等. 利用優(yōu)化改造的家蠶桿狀病毒表達系統(tǒng)提高NS1表達產(chǎn)量. 生物工程學報, 2015, 31(4): 591–602.Li GH, Li MM, Zhou Q, et al. Modified baculovirus system for high expression of Bombyx mori bidensovirus NS1 in silkworm. Chin J Biotech, 2015, 31(4): 591–602.

為優(yōu)化家蠶桿狀病毒表達系統(tǒng)，提高外源基因的表達產(chǎn)量。文中通過同源重組技術，用串聯(lián)的氯霉素基因(Cm) 表達盒和綠色熒光蛋白基因() 表達盒將其替換，從而獲得和兩個基因缺失的家蠶桿狀病毒載體。通過轉(zhuǎn)座，將多角體啟動子控制的家蠶二分濃核病毒(BDV)基因表達盒，定點插入到改造后的該分子載體中。將重組載體轉(zhuǎn)染BmN細胞，獲得能表達家蠶二分濃核病毒 (BDV) NS1的缺失型重組病毒；另外，將多角體啟動子控制的基因轉(zhuǎn)座到野生型Bm-bacmid中，獲得能表達BDV NS1的野生型重組病毒。將這兩種病毒分別皮下注射家蠶，對感染后的家蠶血液中NS1表達水平進行比較，發(fā)現(xiàn)缺失和重組病毒感染的家蠶血液中，NS1的表達量是對照組的3倍，從而建立了一種高效表達可溶性NS1蛋白的方法，為靶蛋白的結構與功能研究奠定基礎。

家蠶桿狀病毒載體，家蠶二分濃核病毒，NS1

桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統(tǒng)(BEVS) 是通過制備攜帶有外源基因的重組桿狀病毒，感染昆蟲或昆蟲細胞進行外源蛋白的表達，表達產(chǎn)物具有正確的空間折疊和糖基化等修飾，其生物活性接近其對應的天然產(chǎn)物。在BEVS中，常用苜蓿丫紋夜蛾核多角體病毒(NPV) 或者家蠶核型多角體病毒(NPV) 用作重組病毒構建的載體，而在表達外源蛋白時，我們傾向選擇家蠶桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統(tǒng)，這與我國的家蠶資源豐富及大規(guī)模養(yǎng)殖密切相關[1]，容易獲得大量的靶蛋白。家蠶桿狀病毒具有容納外源大片段DNA或同時表達多個外源基因的能力；另外，家蠶桿狀病毒不感染人、畜等脊椎動物，表達外源蛋白所需時間周期也遠短于動物或植物系統(tǒng)，可通過昆蟲或細胞培養(yǎng)對外源蛋白進行大規(guī)模生產(chǎn)，這些特性使BEVS成為目前最有效、應用最廣泛的一種真核表達 系統(tǒng)[2]。

盡管BEVS系統(tǒng)有諸多優(yōu)勢以及技術上的不斷改進，但在實踐中還是面臨著一些挑戰(zhàn)，比如在培養(yǎng)的昆蟲細胞中表達外源蛋白，其生產(chǎn)成本較為昂貴[3]；BEVS系統(tǒng)中缺乏有效的熒光信號，難以對轉(zhuǎn)染的細胞中是否產(chǎn)生感染性的重組病毒粒子進行快速判定，影響外源蛋白表達的進程；另外，與原核表達系統(tǒng)相比，利用BEVS系統(tǒng)表達的外源蛋白，其產(chǎn)量相對較低，尤其是感染后的細胞最終會裂解，致使靶蛋白的表達水平及其修飾還未達到最佳狀態(tài)[4]，而外源蛋白的表達量和翻譯后修飾水平較低，會在很大程度上限制BEVS的應用。研究表明：通過增強啟動子的活性、胞內(nèi)共表達分子伴侶Hsp70等其他蛋白、抑制胞內(nèi)一些蛋白酶的活性以及延遲細胞裂解等策略，都可提高BEVS中外源基因的表達產(chǎn)量[5-7]。

家蠶桿狀病毒基因組大小為128 kb，理論預計有143個開放閱讀框[8]，其中幾丁質(zhì)酶和半胱氨酸蛋白酶基因緊挨排列在一起，其間隔序列有48 bp。序列分析表明：幾丁質(zhì)酶基因全長1 659 bp，編碼一個由552個氨基酸組成的蛋白質(zhì)；半胱氨酸蛋白酶基因全長972 bp，編碼一個由323個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，研究表明幾丁質(zhì)酶能水解家蠶內(nèi)外表皮、中腸及圍食膜組織中的幾丁質(zhì)，促進蟲體液化，而半胱氨酸蛋白酶與細胞裂解直接相關，能降解宿主體內(nèi)蛋白[9-11]。因此，本文通過同源重組技術，對家蠶桿狀病毒穿梭載體中和基因進行缺失，以缺失后的Bm-bacmid為分子載體，構建能表達家蠶二分濃核病毒NS1蛋白的重組病毒，從而延遲細胞裂解及蟲體液化的時間，以期提高家蠶血液中NS1蛋白的表達產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株、病毒和試劑

家蠶桿狀病毒穿梭載體Bm-bacmid、pUC119、pFastHTB-和pFastHTB質(zhì)粒保存于本實驗室。pKOV-Cm質(zhì)粒由中山大學生科院楊凱教授惠贈。大腸埃希菌DH5?和DH10B宿主菌在LB培養(yǎng)基中增殖培養(yǎng)。vBm-bacmid-病毒、vBm-bacmid病毒和家蠶二分濃核病毒保存于本實驗室。氨卞青霉素(Amp)、卡那霉素(Kana)、四環(huán)素(Tet)、IPTG、L-(+) 阿拉伯糖、X-gal和OPD均購自上海朝瑞生物公司。NS1單克隆抗體由由上海Abmart公司定制。羊抗小鼠IgG-HRP和胎牛血清白蛋白(BSA) 購自武漢博士德生物公司。d Ⅲ、Ⅰ、ⅠⅠⅠ、T4 DNA連接酶、酶和pMD18-T載體購自寶生物工程 (大連) 有限公司。引物 (表1)合成和序列測定由上海捷瑞生物公司完成。

通過軟件Primer Premier 5.0設計4對特異性引物，首先通過US-F和US-R從Bm-bacmid中擴增長度為551 bp的US片段，對US片段與pUC119質(zhì)粒分別進行d Ⅲ和Ⅰ雙酶切，將酶切后的產(chǎn)物進行連接，獲得pUC119-US重組質(zhì)粒；其次通過Cm-F和Cm-R，從pKOV-Cm質(zhì)粒中擴增長度為1 039 bp的Cm表達盒，對其進行Ⅰ和Ⅰ雙酶切，將酶切后的Cm表達盒與pUC119-US進行連接，獲得pUC119-US-；通過Pie1--SV40-F和Pie1--SV40-R從pFastHTB-質(zhì)粒中擴增長度為1 544 bp的表達盒，對其進行Ⅰ和Ⅰ雙酶切，將酶切的表達盒與經(jīng)過同樣雙酶切的pUC119-US-進行連接，獲得重組質(zhì)粒pUC119-US--；最后通過DS-F和DS-R引物對，從Bm-bacmid中擴增長度為519 bp的DS片段，對其進行Ⅰ酶切，將其與Ⅰ單酶切的pUC119-US--載體進行連接，由于DS片段兩端都為Ⅰ酶切位點，不能與載體進行定向連接，因此，需要對平板上的克隆進行反復鑒定，將序列測定正確的重組質(zhì)粒命名為pUC119-US---DS。

表1 本研究所需引物列表

Underlined letters indicate restriction enzyme digestion sites.

1.3 構建和缺失型重組Bm-bacmid

1.4 表達家蠶二分濃核病毒NS1蛋白的重組Bm-bacmid的構建

通過轉(zhuǎn)座，將多角體啟動子控制的表達盒定點插入到改造后的Bm-bacmid (ChiA–/CP–)中，具體實施流程如下：通過-F和-R從家蠶二分濃核病毒基因組中擴增基因，對擴增片段進行Ⅰ和Ⅰ雙酶切，將酶切后的純化片段與經(jīng)同樣雙酶切的pFastHTB質(zhì)粒進行連接，產(chǎn)生重組質(zhì)粒pFastHTB-。

采用氯化鈣方法[12]，制備含有Bm-bacmid及輔助質(zhì)粒的大腸埃希菌DH10B感受態(tài)細胞，將5 ng的重組質(zhì)粒pFastHTB-添加到DH10B感受態(tài)細胞中，42 ℃熱激45 s后，將800 μL SOC培養(yǎng)基加入到轉(zhuǎn)化后的溶液中，在37 ℃、225 r/ min振蕩培養(yǎng)2 h，取100 μL培養(yǎng)液與40 μg/mL IPTG和20 mg/mL X-gal混合，分別涂布于含三抗K+T+G+(50 μg/mL卡那霉素，5 μg/mL四環(huán)素，7 μg/mL慶大霉素) LB平板上，37 ℃培養(yǎng)36–48 h，對平板上較大的白色單菌落進行PCR鑒定。理論上，在轉(zhuǎn)座酶的作用下，重組質(zhì)粒pFastHTB-中Tn7L-Tn7R之間的序列，可定點插入到Bm-bacmid (ChiA–/CP–) 中，從而獲得可表達BDV NS1蛋白的重組Bm-bacmid-(ChiA–/CP–)。

1.5 制備重組病毒上清

從DH10B大腸桿菌細胞中抽提重組Bm-bacmid-(ChiA–/CP–)，在Cellfectin?(Invitrogen) 的介導下，將這重組桿狀病毒載體轉(zhuǎn)染BmN細胞，對轉(zhuǎn)染后的細胞進行熒光顯微觀察，轉(zhuǎn)染96 h后，對能觀察到熒光的轉(zhuǎn)染孔中，收集其孔中的細胞轉(zhuǎn)染上清，將收集的轉(zhuǎn)染上清感染BmN細胞，對感染后的BmN細胞進行熒光顯微觀察，收集感染96 h后的病毒上清，從而獲得表達BDV NS1的病毒vBm- bacmid-(ChiA–/CP–)；另外，將本實驗室保存的vBm-bacmid-(不缺失和基因) 病毒感染BmN細胞，收集感染96 h后的vBm-bacmid-上清溶液。

1.6 Western blotting分析和ELISA測定

從皮下注射5 μL vBm-bacmid-(ChiA–/CP–) 病毒液到4齡家蠶(306品系，易感品種) 體內(nèi)，共注射30頭易感品系家蠶；另外，從皮下分別注射5 μL vBm-bacmid-病毒液到30頭4齡同品系的家蠶中，每天給它們添飼新鮮的桑葉，于27 ℃的室溫條件下自然生長，通過體式熒光顯微鏡對感染病毒的家蠶進行熒光觀察，可對病毒在家蠶體內(nèi)的增殖動態(tài)過程進行實時了解，收集兩種病毒感染后的家蠶血液，并對家蠶血液中表達的NS1蛋白進行Western blotting檢測。通過ELISA實驗對兩種家蠶血液中的NS1蛋白濃度進行測定，將待檢測的抗原固定于酶標孔中，每孔100 μL于4 ℃孵育12 h，加入5%脫脂奶粉于37 ℃封閉2 h，傾去孔中的溶液并用PBS-T洗滌3次，每次3 min，加入NS1單克隆抗體于37 ℃孵育1 h，接著加入羊抗小鼠IgG-HRP于37 ℃孵育0.5 h，傾去孔中溶液并洗滌3次，加入OPD底物顯色，37 ℃濕盒溫育30 min，通過2 mol/L H2SO4終止顯色反應，利用酶標儀測定其在492 nm波段處的吸光值，以系列濃度的BSA與其對應的值做標準曲線用作參考。

2 結果

鑒于該重組質(zhì)粒中酶切位點的復雜性，通過多輪PCR對該質(zhì)粒進行反復鑒定，通過US-F/US-R引物對擴增長度為551 bp的US片段(圖2，泳道1)；通過Cm-F/Cm-R引物對擴增長度為1 079 bp的 Cm表達盒(圖2，泳道2)；通過Pie1--SV40-F/Pie1--SV40-R引物對擴增長度為1 544 bp的表達盒(圖2，泳道3)；通過DS-F/DS-R引物對擴增長度為514 bp的DS片段(圖2，泳道4)；通過US-F/Cm-R引物對擴增長度為1 630 bp的US+Cm表達盒(圖2，泳道5)；通過US-F/Pie1--SV40-R引物對擴增長度為3 174 bp的US+Cm表達盒+表達盒(圖2，泳道6)；通過US-F/DS-R引物對擴增長度為3 688 bp的US+Cm表達盒+表達盒+DS片段(圖2，泳道7)；通過Cm-F/Pie1--SV40-R引物對擴增長度為 2 623 bp的Cm表達盒+表達盒 (圖2，泳道8)；通過Cm-F/DS-R引物對擴增長度為3 137 bp的Cm表達盒+表達盒+DS片段(圖2，泳道9)；通過Pie1-egfp-SV40-F/DS-R引物對擴增長度為2 058 bp的表達盒+DS片段(圖2，泳道10)，對擴增產(chǎn)物進行DNA凝膠電泳，結果與理論預計一致，將PCR鑒定的重組質(zhì)粒進行序列測定，結果表明測定序列與理論序列完全一致。

圖1 重組質(zhì)粒pUC119-US---DS的構建流程示意圖

圖2 重組質(zhì)粒pUC119-US---DS的鑒定

2.2 重組Bm-bacmid (ChiA–/CP–) 的鑒定

重組Bm-bacmid (ChiA–/CP–) 和野生型Bm-bacmid如圖3 A所示，通過同源重組，使串聯(lián)的和表達盒替換串聯(lián)的和基因中的部分DNA片段。利用不同的引物對在重組Bm-bacmid (ChiA–/CP–) 和野生型Bm-bacmid上所處的位置(圖3B) 不同，分別從野生型和缺失型Bm-bacmid中進行PCR擴增，對擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析(圖3C)。泳道1、3、5、7、9：以缺失型Bm-bacmid (ChiA–/CP–) 為模板，分別通過Cm-F/Cm-R擴增Cm基因表達盒、Pie1--SV40-F/Pie1--SV40-R擴增基因表達盒、Cm-F/Pie1--SV40-R擴增Cm與基因表達盒、US-F/Cm-R擴增US與Cm表達盒，以及US-F/DS-R擴增包括US、Cm表達盒、基因表達盒與DS 4個DNA片段；泳道2、4、6、8、10：以野生型Bm-bacmid為模板，以Cm-F/Cm-R、Pie1--SV40-F/Pie1--SV40-R、Cm-F/Pie1-egfp-SV40-R、US-F/Cm-R及US-F/DS-R為引物對進行擴增，擴增產(chǎn)物用作陰性對照，電泳結果與理論預計相一致，表明已成功獲得重組Bm-bacmid (ChiA–/CP–)，可用作表達外源基因的分子載體。

2.3 熒光顯微觀察

為鑒定缺失的Bm-bacmid (ChiA–/CP–) 能否產(chǎn)生具有感染性的病毒粒子，對重組Bm-bacmid (ChiA–/CP–) 轉(zhuǎn)染的細胞進行熒光顯微觀察，結果如圖4 A所示：轉(zhuǎn)染24 h后，在細胞之中能觀察到一些零星的綠色熒光，轉(zhuǎn)染48 h后，發(fā)現(xiàn)在視野中能觀察到的綠色熒光信號越來越多，到轉(zhuǎn)染96 h后，80%的視野中都布滿了綠色熒光。為鑒定轉(zhuǎn)染上清中是否產(chǎn)生了感染性的病毒粒子，將轉(zhuǎn)染96 h后的細胞上清與培養(yǎng)的BmN細胞孵育1 h，棄上清并添加含10%胎牛血清的細胞培養(yǎng)基，對感染后的BmN細胞進行熒光顯微觀察，結果如圖4 B所示：在感染24–96 h時間段，發(fā)現(xiàn)細胞中能觀察到的綠色熒光越來越多，說明轉(zhuǎn)染后的上清中能產(chǎn)生具有感染性的病毒粒子，具有啟動下一輪感染的能力。該結果表明：缺失和的重組Bm-bacmid (ChiA–/CP–)，不會影響感染性病毒粒子的產(chǎn)生，以該缺失型桿粒作分子載體，可用作高效表達外源基因的重組病毒載體。

2.4 重組病毒vBm-Bacmid(ChiA–/CP–)的制備

利用鑒定的Bm-bacmid (ChiA–/CP–) 為分子載體，通過轉(zhuǎn)座，將多角體啟動子控制的基因表達盒定點插入到該載體的轉(zhuǎn)座位點，利用M13-F/M13-R引物對，對發(fā)生轉(zhuǎn)座后的白色克隆進行PCR鑒定，未發(fā)生轉(zhuǎn)座的Bm-bacmid中擴增產(chǎn)物為280 bp左右，而發(fā)生轉(zhuǎn)座的Bm-bacmid中擴增產(chǎn)物為3 200 bp左右，電泳結果如圖5所示，其結果與理論預計相一致，表明基因表達盒已成功地插入到Bm-bacmid (ChiA–/CP–) 轉(zhuǎn)座位點。

圖3 缺失型重組Bm-bacmid (ChiA–/CP–) 的構建流程示意圖和PCR鑒定

圖4 轉(zhuǎn)染或感染的BmN細胞中不同時間點的熒光顯微觀察

圖5 重組Bm-bacmid -ns1 (ChiA–/CP–) 的PCR鑒定

抽提重組Bm-bacmid(ChiA–/CP–)，通過脂質(zhì)體的介導，將其轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的BmN細胞，對轉(zhuǎn)染后的細胞進行綠色熒光顯微觀察，收集有熒光的孔中上清溶液，將其再次感染培養(yǎng)的BmN細胞，收集感染96 h后的細胞上清，從而獲得重組病毒vBm-bacmid(ChiA–/CP–) 溶液，可用于下一步的家蠶感染實驗中。

2.5 兩種重組病毒感染的家蠶血液中NS1蛋白的鑒定

分別收集vBm-bacmid(ChiA–/CP–) 和vBm-Bacmid病毒感染的家蠶血液，以vBm-Bacmid病毒感染的家蠶血液為空白對照(圖6泳道1)，對收集的家蠶血液蛋白濃度進行測定，對等量的家蠶血液蛋白進行Western blotting分析，以NS1單克隆抗體為一抗進行孵育，偶聯(lián)有堿性磷酸酶的馬抗小鼠IgG為二抗，通過BCIP/NBT堿性磷酸酯酶試劑盒對其進行顯色，結果表明：重組病毒vBm-bacmid(ChiA–/CP–) 和vBm-bacmid病毒感染的家蠶血液中，都能夠鑒定到NS1的表達，但它們的表達量有明顯的差異，在vBm-bacmid(ChiA–/CP–) 病毒感染的家蠶血液中，其靶蛋白NS1 (圖6泳道3)的表達量明顯多于對照組(圖6泳道2)。利用ELISA方法對家蠶血液中NS1蛋白濃度進行測定，結果發(fā)現(xiàn)vBm-bacmid(ChiA–/CP–) 病毒感染的家蠶血液中，NS1蛋白濃度大約是對照組的3倍，該結果表明：以缺失幾丁質(zhì)酶和半胱氨酸蛋白酶基因的病毒為載體，能有效地提高BDV NS1的表達。

圖6 病毒感染的家蠶血液中NS1蛋白鑒定

3 討論

家蠶是我國一種具有重要經(jīng)濟價值的昆蟲，主要以桑葉為食，只需要一些簡單的設備就可對家蠶進行大規(guī)模飼養(yǎng)，其生產(chǎn)的蠶絲是我國農(nóng)業(yè)經(jīng)濟的重要組成部分，在改善民生和可持續(xù)發(fā)展中起著重要的作用。2009年已完成家蠶全基因組序列的測定和分析[13]，其遺傳背景清楚，飼養(yǎng)成本低廉，在家蠶體內(nèi)表達外源蛋白所需時間較短，容易對靶蛋白進行大規(guī)模生產(chǎn)，是一種非常優(yōu)良的生物反應器，也是實現(xiàn)基因工程產(chǎn)業(yè)化的理想載體。另外，Luckow 等和Possee等[14-15]建立了一種高效、快速的用來構建重組病毒的篩選體系，剔除了多輪空斑篩選的繁瑣程序，提高重組病毒的陽性得率，由此，極大地簡化了家蠶重組桿狀病毒的構建、分離、鑒定以及定量，由此使家蠶桿狀病毒表達系統(tǒng)的應用得到了推廣。自1985年利用該系統(tǒng)首次成功表達人干擾素-α以來[1]，截止到目前為止，已通過BEVS在家蠶體內(nèi)成功地表達了乙型肝炎表面抗原、人酸性/堿性成細胞生長因子、熒光素酶以及纖維素酶等上千種具有重要功能的重組蛋白[16-20]。

盡管BEVS系統(tǒng)有諸多優(yōu)勢以及技術上的不斷改進，但在實踐中還是面臨著一些挑戰(zhàn)，比如在培養(yǎng)的昆蟲細胞中表達外源蛋白，其生產(chǎn)成本較為昂貴[21]；其次，BEVS系統(tǒng)中缺乏有效的熒光信號，難以對轉(zhuǎn)染的細胞中是否產(chǎn)生感染性的重組病毒粒子作出快速判定，影響外源蛋白表達的進程；最關鍵的是，與原核表達系統(tǒng)相比，在BEVS中所表達的外源蛋白，其產(chǎn)量相對較低，尤其是感染后的細胞最終會裂解，致使靶蛋白的表達水平及其修飾還未達到最佳狀態(tài)[22]，這些不足之處在一定程度上都限制了BEVS系統(tǒng)的使用。

為優(yōu)化家蠶桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統(tǒng)，本文對家蠶桿狀病毒穿梭載體上的一些序列進行改造，通過同源重組技術，使串聯(lián)的Cm基因表達盒和表達盒成功地替換家蠶桿狀病毒載體中的和，通過熒光顯微觀察，證實這兩個基因的缺失并不影響家蠶桿狀病毒的增殖，可用作表達外源基因的分子載體；同時，在家蠶桿狀病毒載體中引入綠色熒光信號，也極大地簡化了轉(zhuǎn)染或感染細胞中重組病毒粒子的鑒定，縮短了外源蛋白表達所需的時間。Lee等也曾構建基因缺失的病毒，利用該缺失載體來構建可表達纖維素酶的重組病毒，結果發(fā)現(xiàn)在感染的家蠶幼蟲中，纖維素酶的表達量提高了17%[23]；另外，通過抑制組織蛋白酶的表達，可提高綠色熒光蛋白3倍的表達量[24]。在本研究中，利用和基因同時缺失的Bm-bacmid為分子載體，缺失有效地提高了BDV NS1的表達產(chǎn)量。由此可知，通過缺失和基因，延長病毒感染的昆蟲細胞存活時間，抑制靶蛋白的降解，確實顯著地提高了的表達量，為NS1蛋白的功能與結構研究奠定基礎，同時也為大規(guī)模表達其他功能蛋白提供參考。

REFERENCES

[1] Maeda S, Kawai T, Obinata M, et al. Production of human alpha-interferon in silkworm using a baculovirus vector. Nature, 1985, 315(6020): 592–594.

[2] Kato T, Kajikawa M, Maenaka K, et al. Silkworm expression system as a platform technology in life science. Appl Microbiol Biotechnol, 2010, 85(3): 459–470.

[3] Tiwari P, Saini S, Upmanyu S, et al. Enhanced expression of recombinant proteins utilizing a modified baculovirus expression vector. Mol Biotechnol, 2010, 46(1): 80–89.

[4] Ikonomou L, Schneider YJ, Agathos SN. Insect cell culture for industrial production of recombinant proteins. Appl Microbiol Biotechnol, 2003, 62(1): 1–20.

[5] Pijlman GP, de Vrij J, van den End FJ, et al. Evaluation of baculovirus expression vectors with enhanced stability in continuous cascaded insect-cell bioreactors. Biotechnol Bioeng, 2004, 87(6): 743–753.

[6] Kost TA, Condreay JP, Jarvis DL. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat Biotechnol, 2005, 23(5): 567–575.

[7] Fath-Goodin A, Kroemer J, Martin S, et al. Polydnavirus genes that enhance the baculovirus expression vector system. Adv Virus Res, 2006, 68: 75–90.

[8] Gomi S, Majima K, Maeda S. Sequence analysis of the genome ofnucleopolyhedrovirus. J Gen Virol, 1999, 80 (Pt 5): 1323–1337.

[9] Hawtin RE, Zarkowska T, Arnold K, et al. Liquefaction of autographa californica nucleopolyhedrovirus-infected insects is dependent on the integrity of virus-encoded chitinase and cathepsin genes. Virology, 1997, 238(2): 243–253.

[10] Hodgson JJ, Arif BM, Krell PJ. Interaction of Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus cathepsin protease progenitor (proV-CATH) with insect baculovirus chitinase as a mechanism for proV-CATH cellular retention. J Virol, 2011, 85(8): 3918–3929.

[11] Kadono-Okuda K, Yamamoto M, Higashino Y, et al. Baculovirus-mediated production of the human growth hormone in larvae of the silkworm,. Biochem Biophys Res Commun, 1995, 213(2): 389–396.

[12] Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989: 20–25.

[13] Xia Q, Guo Y, Zhang Z, et al. Complete resequencing of 40 genomes reveals domestication events and genes in silkworm (). Science, 2009, 326(5951): 433–436.

[14] Luckow VA, Lee SC, Barry GF, et al. Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in. J Virol, 1993, 67(8): 4566–4579.

[15] Possee RD, Hitchman RB, Richards KS, et al. Generation of baculovirus vectors for the high-throughput production of proteins in insect cells. Biotechnol Bioeng, 2008, 101(6): 1115–1122.

[16] Likhoradova OA, Bachurina EIu, Azimova ShS. Biosynthesis of recombinant human hepatitis B M-HBsAg in silkworm larvae. Mol Biol (Mosk), 2004, 38(4): 717–722.

[17] Wu X, Kamei K, Sato H, et al. High-level expression of human acidic fibroblast growth factor and basic fibroblast growth factor in silkworm (L.) using recombinant baculovirus. Protein Expr Purif, 2001, 21(1): 192–200.

[18] Palhan VB, Sumathy S, Gopinathan KP. Baculovirus mediated high-level expression of luciferase in silkworm cells and larvae. Biotechniques, 1995, 19(1): 97–98.

[19] Lee KS, Je YH, Woo SD, et al. Production of a cellulase in silkworm larvae using a recombinantnucleopolyhedrovirus lacking the virus-encoded chitinase and cathepsin genes. Biotechnol Lett, 2006, 28(9): 645–650.

[20] Jarvis DL, Fleming JA, Kovacs GR, et al. Use of early baculovirus promoters for continuous expression and efficient processing of foreign gene products in stably transformed lepidopteran cells. Biotechnology, 1990, 8(10): 950–955.

[21] Tiwari P, Saini S, Upmanyu S, et al. Enhanced expression of recombinant proteins utilizing a modified baculovirus expression vector. Mol Biotechnol, 2010, 46(1): 80–89.

[22] Ikonomou L, Schneider YJ, Agathos SN. Insect cell culture for industrial production of recombinant proteins. Appl Microbiol Biotechnol, 2003, 62(1): 1–20.

[23] Lee KS, Je YH, Woo SD, et al. Production of a cellulase in silkworm larvae using a recombinantnucleopolyhedrovirus lacking the virus-encoded chitinase and cathepsin genes. Biotechnol Lett, 2006, 28(9): 645–650.

[24] Kim EJ, Kramer SF, Hebert CG, et al. Metabolic engineering of the baculovirus-expression system via inverse "shotgun" genomic analysis and RNA interference (dsRNA) increases product yield and cell longevity. Biotechnol Bioeng, 2007, 98(3): 645–654.

(本文責編陳宏宇)

Modified baculovirus system for high expression ofbidensovirus NS1 in silkworm

Guohui Li, Mangmang Li, Qian Zhou, Zhaoyang Hu, Qi Tang, and Qin Yao

Institute of Life Science, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, Jiangsu, China

To improve the expression of heterologous genes using baculovirus expression system, we constructed a novel shuttle vector based on the Bm-Bacmid. In the Bm-Bacmid, partial sequences ofandwere replaced with a tandem cassette of Cm andthrough homologous recombination.bidensovirus (BDV)under the control of polyhedrin promoter was inserted into the modified Bm-bacmid by transposition. For comparison,BDVunder the control of polyhedrin promoter was also cloned in the wild type Bm-bacmid. The resulting Bm-bacmids were transfected into the cultured BmN cells to prepare recombinant virus to infect silkworms for expression ofBDV. Total proteins of hemocyte from infected silkworms were subjected to Western blotting and ELISA analysis. The yield ofBDV NS1 with the modified vector was three times as much as that with the unmodified vector. The method to improve the yield ofBDV NS1 in silkworms will facilitate the function and three-dimensional structure study ofBDV NS1.

Bm-bacmid,bidensovirus, NS1

August 4, 2014; Accepted:September 29, 2014

Guohui Li. Tel: +86-511-88791702; E-mail: ghli@ujs.edu.cn

Supported by:National Natural Science Foundation of China (Nos. 31270192, 31272507, 31402016), Startup Scientific Research Fund from Jiangsu University (No. 09JDG057).

國家自然科學基金 (Nos. 31270192, 31272507, 31402016)，江蘇大學高級人才基金 (No. 09JDG057) 資助。