姚楠，白杰，張雪梅，張寧，吳衛(wèi)東，李文蓉

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牛殺菌/通透性增加蛋白對脂多糖介導(dǎo)的炎性細胞因子表達的影響

姚楠1,2,4*，白杰1,3*，張雪梅1，張寧1，吳衛(wèi)東2，李文蓉1

1 農(nóng)業(yè)部草食家畜遺傳育種與繁殖重點實驗室新疆維吾爾自治區(qū)動物生物技術(shù)重點開放實驗室新疆維吾爾自治區(qū)畜牧科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，新疆烏魯木齊 830000 2 新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心，新疆烏魯木齊 830000 3 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，河南鄭州 450002 4 新疆維吾爾自治區(qū)克拉瑪依市人民醫(yī)院，新疆克拉瑪依 834000

姚楠, 白杰, 張雪梅, 等. 牛殺菌/通透性增加蛋白對脂多糖介導(dǎo)的炎性細胞因子表達的影響. 生物工程學(xué)報, 2015, 31(2): 195-205.Yao N, Bai J, Zhang XM, et al. Effects on the expression of lipopolysaccharide-induced inflammatory cytokines mediated by bovine bactericidal/permeability-increasing protein. Chin J Biotech, 2015, 31(2): 195-205.

殺菌/通透性增加蛋白 (Bactericidal/permeability-increasing protein, BPI) 能結(jié)合并特異地中和來自革蘭氏陰性菌外膜的脂多糖 (Lipopolysaccharide, LPS)。為了研究牛源BPI蛋白及其 N端結(jié)構(gòu)域在LPS介導(dǎo)的免疫應(yīng)答中的作用，本文將全長1 449 bp編碼區(qū)序列 () 和其N端714 bp的編碼區(qū)序列 () 分別導(dǎo)入mHEK293細胞，分析了穩(wěn)定表達的BPI或BPI714對LPS介導(dǎo)的炎性細胞因子表達的影響。首先將構(gòu)建的pLEX-BPI/pLEX-BPI714載體分別轉(zhuǎn)染mHEK293細胞，獲得穩(wěn)定表達牛源BPI或BPI714的mHEK293細胞；然后用LPS刺激上述細胞，分別收集刺激前、刺激后1 h、3 h、6 h、12 h、24 h、36 h和48 h的細胞，并同時收集未表達BPI或BPI714的 mHEK293細胞在各時間點的樣品作為對照；采用定量RT-PCR檢測上述細胞中炎性細胞因子的相對表達水平，比較LPS刺激前后表達BPI/BPI714和對照細胞中上述基因轉(zhuǎn)錄水平的變化規(guī)律。研究表明，LPS刺激后，對照細胞中表達水平在不同時間點均顯著提高 (<0.05)，并呈現(xiàn)規(guī)律性變化；而穩(wěn)定表達BPI/BPI714的細胞在同樣刺激條件下，基因的轉(zhuǎn)錄水平均未發(fā)生顯著變化 (>0.05)。根據(jù)我們的實驗結(jié)果，在mHKE293細胞模型中BPI或BPI714均能顯著降低LPS介導(dǎo)的炎性細胞因子表達，抑制LPS介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。這不僅為進一步研究BPI抑菌機制和利用其抑菌功能提供了可靠的實驗依據(jù)，也為分析抗菌蛋白的抗菌效果提供了一種可靠的實驗方法。

殺菌/通透性增加蛋白，脂多糖，免疫應(yīng)答，炎性細胞因子

在人和動物生活的環(huán)境中存在著大量的革蘭氏陰性菌，脂多糖 (Lipopolysaccharide, LPS) 是革蘭氏陰性菌菌膜的組成部分。在革蘭氏陰性菌侵入動物機體后，LPS被機體的天然免疫系統(tǒng)TLR識別，當(dāng)機體檢測到LPS的入侵信號后，在轉(zhuǎn)錄因子家族 (Nuclear factor-κ-gene binding,) 的調(diào)控下，白介素8 (Interleukin- 8,)、白介素1β (Interleukin-1β,) 和腫瘤壞死因子α (Tumor necrosis factor-α,) 等促炎癥因子的表達水平都急劇增加，產(chǎn)生清除病原菌的免疫反應(yīng)[1-2]。殺菌/通透性增加蛋白(Bactericidal/permeability-increasing protein,) 是機體在免疫反應(yīng)中釋放的免疫分子，它與LPS有很高的親和能力，可以特異地中和LPS，對革蘭氏陰性菌有強烈的細胞毒性效應(yīng)[3-4]。

基因最初是在人中性粒細胞中發(fā)現(xiàn)[5]，嗜酸性粒細胞也有低水平的表達[6]。隨著研究的深入，在人胃腸道上皮細胞[7]、皮膚成纖維細 胞[8]、淚腺管上皮細胞[9]、生殖道上皮細胞[10]中都檢測到BPI的轉(zhuǎn)錄和表達。牛源BPI蛋白研究相對較少，目前主要集中在基因多態(tài)性對基因功能的影響及BPI體外表達后抑菌功能的研究，對牛BPI抑菌機制的研究還未見報道。

本實驗將牛源的基因轉(zhuǎn)入到mHEK293 (該細胞系由白杰等[11]參考Sauter等[12]的方法，將牛源的基因轉(zhuǎn)染到HEK293細胞后，該細胞系具有了免疫應(yīng)答能力，是研究牛天然免疫反應(yīng)的細胞模型) 細胞中進行表達，期望了解LPS介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)發(fā)生時，基因穩(wěn)定表達對炎性細胞因子轉(zhuǎn)錄表達的影響。此外，研究顯示人源BPI與LPS結(jié)合的核心區(qū)域位于BPI蛋白N端。因此，本研究克隆獲得了牛源基因CDS全長及N端的編碼序列，開展了二者對LPS介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)影響的研究。本研究有助于了解牛源的抗菌機理，為進一步利用其抗菌活性，降低奶牛乳腺炎的發(fā)病率，提高牛奶食用的安全性提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 載體、菌種及細胞

DH5α感受態(tài)細胞購自北京天根公司；pMD20-T載體購自TaKaRa公司；pLEX-MCS慢病毒表達載體及其包裝質(zhì)粒pMD2G、pSPAX購自O(shè)penbiosystem公司；用于生產(chǎn)重組慢病毒的293T包裝細胞購自ATCC公司。包含牛源基因的mHEK293細胞系由新疆畜牧科學(xué)院動物生物技術(shù)中心提供。

1.1.2 酶及主要試劑

限制性內(nèi)切酶HⅠⅠ購自Fermentas公司；T4 DNA連接酶、PrimeSTAR?HS DNA Polymerase 購自寶生物工程 (大連) 有限公司；Trizol試劑和Lipofectamine? 2000試劑購自Invitrogen公司；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自GIBCO公司；HA抗體購自北京天根公司；熒光二抗購自LI-COR公司；QuantiTect SYBR GreenⅠ試劑購自QIAGEN公司。其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 牛BPI/BPI714基因表達載體的構(gòu)建

根據(jù)基因的mRNA序列 (NM_173895.2)，設(shè)計用于擴增?；騈端序列 (大小為714 bp) 的一對PCR引物，上、下游引物分別引入HⅠ和Ⅰ酶切位點，下劃線部分為HA標(biāo)簽序列。同時設(shè)計另一對引物用以擴增全長CDS序列 (大小為1 449 bp)，引物也分別引入HⅠ和Ⅰ酶切位點，下劃線部分為HA標(biāo)簽序列 (序列詳見表1)。用荷斯坦牛血樣2.5 mL提取總RNA，取1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。目的片段的PCR擴增體系為：cDNA 2 μL，10×緩沖液2 μL，25 mmol/L MgCl21.5 μL，10 mmol/L dNTPs 2 μL，前述上下游引物各 10 pmol/L，1.25 U PrimeSTAR?HS DNA聚合酶，超純水補足到20 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，65 ℃ (降低2 ℃/2循環(huán)) 退火40 s以及72 ℃延伸100 s，共16個循環(huán)；然后95 ℃變性30 s，51 ℃退火40 s以及72 ℃延伸100 s共19個循環(huán)；最后72 ℃延伸5min，瓊脂糖凝膠電泳檢測。目的片段和pLEX-MCS載體分別用HⅠ和Ⅰ雙酶切，回收酶切產(chǎn)物進行克隆，經(jīng)酶切和測序鑒定正確的重組質(zhì)粒分別命名為pLEX-BPI和pLEX-BPI714。

1.3 穩(wěn)定表達牛BPI和BPI N端的mHEK293細胞的獲得

1.3.1 BPI、BPI714重組慢病毒的制備

采用磷酸鈣方法分別將pLEX-BPI /pLEX-BPI714質(zhì)粒、包裝質(zhì)粒和包膜質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到293T細胞中，分別獲得攜帶和基因的重組病毒。步驟如下：293T細胞于10 cm培養(yǎng)皿培養(yǎng)，細胞匯合度達到70%?80%時進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染試劑包括pLEX-BPI/pLEX-BPI714質(zhì)粒20 μg，包裝質(zhì)粒pSPAX 15 μg、pMD2G 6 μg，去離子水補足500 μL，加入2 × HBS (0.273 mol/L NaCl，10 μmol/L KCl，1.4 μmol/L Na2HPO4， 42 μmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸及10 μmol/L葡萄糖，pH 7.05) 500 μL，2.5 mol/L CaCl2溶液50 μL。室溫孵育20 min后，將混合液均勻滴加至生長293T細胞培養(yǎng)基中。12?14 h后更換新鮮培養(yǎng)基，48 h后收獲含病毒顆粒的細胞培養(yǎng)液，分裝保存于?70℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2穩(wěn)定表達BPI/BPI714 mHEK293細胞的構(gòu)建及鑒定

將pLEX-BPI/pLEX-BPI714重組慢病毒感染mHEK293細胞。步驟如下，在6孔板每孔各鋪3×105個mHEK293細胞。當(dāng)細胞匯合度達到70%時，將pLEX-BPI/pLEX-BPI714重組慢病毒0.5 mL和DMEM培養(yǎng)液0.5 mL混合，同時加入聚凝胺 (Polybrene) 10 μg，16 h換液后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，在培養(yǎng)基中添加600 ng/mL的嘌呤霉素進行篩選，獲得表達牛源基因的細胞系mHEK293-BPI和mHEK293-BPI714。

BPI/BPI714基因在mHEK293中的表達鑒定。分別收集mHEK293-BPI和mHEK293-BPI714細胞，裂解后取40 μg總蛋白按文獻[13]進行Western blotting分析，其中一抗為1∶5 000小鼠抗HA抗體。

1.4 穩(wěn)定表達BPI基因?qū)PS介導(dǎo)的炎性細胞因子表達的影響

6孔板中分別培養(yǎng)3×105個/孔穩(wěn)定表達BPI/BPI714和未表達BPI/BPI714的mHEK293細胞，當(dāng)細胞匯合度達到70%時，添加LPS (終濃度100 ng/mL)，分別收集實驗組和對照組0、1、3、6、12、24、36和48 h共8個時間點的細胞。為保證實驗結(jié)果準(zhǔn)確，每個時間點均設(shè)平行樣品。通過定量RT-PCR檢測上述細胞中相關(guān)炎性細胞因子相對表達量的變化。

1.5 實時定量RT-PCR檢測細胞炎性細胞因子的轉(zhuǎn)錄水平

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

使用標(biāo)準(zhǔn)曲線相對定量法對基因mRNA水平進行定量RT-PCR分析。首先分別制備目的基因的標(biāo)準(zhǔn)品。針對人、、、、和基因，設(shè)計相應(yīng)的跨內(nèi)含子引物 (表1)。將PCR獲得的目的片段克隆至pMD-20-T載體，使用RⅠ內(nèi)切酶獲得線性化質(zhì)粒。經(jīng)DNA純化試劑盒 (QIAGEN) 純化線性化質(zhì)粒DNA，梯度稀釋至1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL、1 fg/μL共7個濃度作為標(biāo)準(zhǔn)品。使用QuantiTect SYBR Green Ⅰ試劑進行定量RT-PCR，生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 基因克隆及定量RT-PCR檢測的引物序列

The underlined sequences are the HA peptide tag sequences.

1.5.2 樣本的制備及實時定量PCR檢測

用Trizol提取實驗組和對照組的不同時間點細胞樣品總RNA，取1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，取2 μL cDNA進行定量RT-PCR，選擇作為內(nèi)參基因。反應(yīng)程序均為：95 ℃ 15 min，55個循環(huán)：95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s。溶解曲線：99 ℃ 10 s，40 ℃ 15 s，99 ℃0.1 ℃/s，降溫至40 ℃ 30 s。反應(yīng)體系：2×Master mix 10 μL；上下游引物 (10 pmol/L) 1 μL；cDNA 2 μL；無RNA酶超純水 7 μL。每個樣本重復(fù)3次。

1.5.3 統(tǒng)計分析

使用SPSS13.0軟件進行數(shù)據(jù)的方差分析。當(dāng)結(jié)果顯示表達差異顯著時 (<0.05)，在圖上用不同字母a、b、c表示；當(dāng)結(jié)果顯示表達差異不顯著時 (>0.05)，在圖上用相同字母表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 BPI/BPI714慢病毒表達載體的構(gòu)建

以荷斯坦牛血樣總RNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板進行PCR擴增，分別獲得1 449 bp和714 bp的CDS全長和N端目的片段。隨即分別將目的片段克隆到pLEX-MCS表達載體，經(jīng)雙酶切鑒定后，對重組質(zhì)粒測序。測序結(jié)果顯示，獲得的目的片段序列正確，且基因序列準(zhǔn)確插入載體的預(yù)定位置。

2.2 獲得穩(wěn)定表達BPI的mHEK293細胞系

將攜帶牛源BPI/BPI714的重組病毒感染mHEK293細胞，獲得穩(wěn)定表達BPI/BPI714的mHEK293細胞，Western blotting檢測BPI/BPI714在細胞中的表達情況。結(jié)果顯示，在55 kDa和25 kDa標(biāo)準(zhǔn)分子量附近有特異的目的蛋白，說明BPI/BPI714在mHEK293細胞中表達 (圖1)。

2.3 穩(wěn)定表達的BPI/BPI714對LPS誘導(dǎo)的炎性細胞因子表達的影響

為了研究重組BPI/BPI714蛋白對LPS介導(dǎo)的炎性細胞因子的影響，以穩(wěn)定表達BPI/BPI714 mHEK239細胞為細胞模型，用LPS分別刺激BPI/BPI714 mHEK239的實驗組細胞和不表達BPI/BPI714的mHEK239對照組細胞，分析不同細胞經(jīng)LPS誘導(dǎo)后炎癥因子表達的變化。分別收集LPS刺激前、刺激后不同時間點的實驗組和對照組細胞，制備細胞總RNA進行反轉(zhuǎn)錄，獲得相應(yīng)cDNA。通過實時定量RT-PCR檢測實驗組和對照組各個時間點細胞的炎癥因子、和以及轉(zhuǎn)錄因子和共5個基因轉(zhuǎn)錄水平的相對表達量。

2.3.1 穩(wěn)定表達的BPI/BPI714對LPS誘導(dǎo)的基因表達水平的影響

對于沒有表達BPI或BPI714mHEK293細胞，LPS刺激6 h后，基因的相對轉(zhuǎn)錄水平升高 (<0.05)，隨后下降至與對照差異不顯著，之后的時間點其表達量雖有小幅波動，但均與刺激前差異不顯著。相比，無論表達BPI或BPI714，LPS刺激1 h后表達BPI/BPI714的細胞中基因的相對轉(zhuǎn)錄水平均顯著升高 (>0.05)，隨后下降，之后各時間點基因表達量和刺激前相比，差異均不顯著 (>0.05) (圖2)。

圖1 Western blotting檢測重組蛋白BPI /BPI714的表達

圖2 LPS刺激前后穩(wěn)定表達BPI/BPI714和未表達BPI/BPI714的mHEK293細胞中IL-1β基因的相對表達水平

2.3.2 穩(wěn)定表達的BPI/BPI714對LPS誘導(dǎo)的基因表達水平的影響

LPS刺激1 h后，沒有表達BPI或BPI714的mHEK293細胞中基因的相對轉(zhuǎn)錄水平迅速升高 (<0.05)，隨后的時間點逐漸下降，并在36 h后降到與對照差異不顯著。而表達BPI和BPI714的細胞在LPS刺激后，基因的相對轉(zhuǎn)錄水平相比LPS刺激前沒有顯著變化 (>0.05) (圖3)。

圖3 LPS刺激前后穩(wěn)定表達BPI/BPI714和未表達BPI/BPI714的mHEK293細胞中TNF-α基因的相對表達水平

2.3.3 穩(wěn)定表達的BPI/BPI714對LPS誘導(dǎo)的基因表達水平的影響

LPS刺激1 h后，沒有表達BPI或BPI714的mHEK293細胞中基因的相對轉(zhuǎn)錄水平即顯著升高 (<0.05)，到3 h達到最高點，而后逐漸下降，刺激36和48 h后基因轉(zhuǎn)錄表達與刺激前相比無顯著變化 (>0.05)。與表達BPI或BPI714的細胞相比，基因的相對轉(zhuǎn)錄水平在LPS刺激前后沒有顯著變化 (>0.05) (圖4)。

2.3.4 穩(wěn)定表達的BPI/BPI714對LPS誘導(dǎo)的基因表達水平的影響

沒有表達BPI或BPI714的mHEK293細胞在LPS刺激后1 h、3 h和6 h，基因的相對轉(zhuǎn)錄水平迅速、持續(xù)升高，維持較高的轉(zhuǎn)錄表達水平，與刺激前相比，差異顯著 (<0.05)。LPS刺激12 h時，基因表達水平下降至刺激前水平 (>0.05)，刺激24 h時其表達水平再次升高，較LPS刺激前的表達水平差異顯著，隨后在36 h和48 h又恢復(fù)到刺激前的表達水平 (>0.05)。與此同時，表達BPI和BPI714的mHEK293細胞，其基因相對轉(zhuǎn)錄水平LPS刺激前和刺激后沒有顯著變化 (>0.05) (圖5)。

2.3.5 穩(wěn)定表達的BPI/BPI714對LPS誘導(dǎo)的基因表達水平的影響

在沒有表達BPI或BPI714的mHEK293細胞中，LPS刺激后基因的轉(zhuǎn)錄表達升高，在刺激后3 h的表達量與刺激前相比差異顯著，然后逐漸下降，并在刺激12 h后表達水平降低至刺激前的表達水平。在表達BPI和BPI714的細胞中，的相對轉(zhuǎn)錄水平在LPS刺激1 h時升高，與刺激前顯著差異；隨后下降，刺激3 h、6 h后基因轉(zhuǎn)錄水平降至刺激前的表達水平；之后表達量持續(xù)下降，顯著低于刺激前的表達水平 (圖6)。

圖4 LPS刺激前后穩(wěn)定表達BPI/BPI714和未表達BPI/BPI714的mHEK293細胞中IL-8基因的相對表達水平

圖5 LPS刺激前后穩(wěn)定表達BPI/BPI714和未表達BPI/BPI714的mHEK293細胞中NF-κB-2基因的相對表達水平

圖6 LP S刺激前后穩(wěn)定表達BPI/BPI714和未表達BPI/BPI714的mHEK293細胞中NF-κB-1基因的相對表達水平

3 討論

LPS是革蘭氏陰性菌菌膜的組成部分，可以導(dǎo)致急性炎癥反應(yīng)，清除LPS或?qū)PS的脫毒是機體免疫反應(yīng)的最重要目標(biāo)。激活免疫反應(yīng)首先需要把單個LPS分子轉(zhuǎn)移到宿主細胞的表面識別受體TLR4，這個過程需要LBP和革蘭氏陰性菌菌膜上的LPS結(jié)合，由LBP把內(nèi)毒素單體轉(zhuǎn)移給可溶的CD14 (或細胞膜上的CD14) 形成復(fù)合物，該復(fù)合物的結(jié)合底物是MD2或MD2-TLR4，然后由MD2將內(nèi)毒素和TLR4結(jié)合起來，通過激活NF-κB途徑，使巨噬細胞釋放促炎性細胞因子，如、和等，誘導(dǎo)巨噬細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，從而清除細菌[14]。

IL-8可由多種細胞產(chǎn)生，包括單核細胞、巨噬細胞、內(nèi)皮細胞、成纖維細胞和表皮細胞等。、和LPS是刺激分泌的主要誘導(dǎo)劑。主要生物學(xué)功能是趨化和激活中性粒細胞，使其產(chǎn)生處理細胞毒素的吞噬小泡[4]。吞噬小泡中包括大量的抗菌肽、活性氧以及骨髓分化的蛋白，能夠消滅病原菌，清除LPS或?qū)PS進行脫毒化處理，其中BPI是抗菌肽處理LPS的主要成分之一。

自1978年Weiss等提取天然BPI分子后，人們已經(jīng)對兔、鼠、豬、牛和雞等多種生物的基因進行研究，大部分研究主要集中在基因多態(tài)性對其功能的影響[15-17]，以及不同組織的BPI表達分布以及其對革蘭氏陰性菌的殺菌能力方面。徐俊杰等[18]從細菌培養(yǎng)和平板計數(shù)上，都證實BPI有極強的抑菌效果。在全血實驗中，5 nmol/L濃度的nBPl55或rBPl23就可使對血清和吞噬作用具有抵抗力的有莢膜粗糙型大腸桿菌發(fā)生損傷[1]。Eckert等[19]通過表達TLR4信號通路的HEK293細胞研究小鼠BPI的功能，發(fā)現(xiàn)鼠源BPI能特異的抑制IL-8和基因的表達。Wittmann等[20]在穩(wěn)定表達基因的RAW細胞系 () 中研究BPI對LPS誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)的影響，發(fā)現(xiàn)鼠源BPI可以抑制，IL-8和TNF基因的表達。綜上所述，LPS刺激后，炎性細胞因子、、和轉(zhuǎn)錄因子表達水平均顯著增加。因此，我們認為通過分析這些基因的表達水平變化能夠判斷BPI對LPS介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的影響作用。為此本實驗選擇了上述炎性細胞因子/轉(zhuǎn)錄因子，利用具有TLR4信號通路的mHEK293細胞系，將牛源BPI/BPI N端基因分別轉(zhuǎn)染到上述mHEK293細胞中，在相同LPS刺激條件下，通過比較穩(wěn)定表達BPI/BPI714實驗組細胞和沒有表達BPI/BPI714對照組細胞中這些因子的相對轉(zhuǎn)錄水平變化情況，評價牛源對LPS介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的影響。

不同劑量的LPS刺激不同物種的免疫細胞、炎性細胞因子的轉(zhuǎn)錄水平變化并不完全相同。Strandberg等[21]采用50 μg/mL的LPS刺激牛乳腺上皮細胞，炎性細胞因子的轉(zhuǎn)錄水平均迅速提高，其中和的轉(zhuǎn)錄水平在2 h后最高，而在刺激8 h后達到最高轉(zhuǎn)錄水平。而Hadley等[22]采用1 ng/mL的LPS刺激人的血液，發(fā)現(xiàn)在6 h后表達水平達到最高，在12 h達到最高水平，則在24 h時達到最高水平。Guillermo等[23]對人的單核細胞系THP-1用LPS (100 ng/mL) 進行刺激，發(fā)現(xiàn)表達量迅速升高，并在4 h后達到最高水平，隨后緩慢下降。Lee等[24]用大腸桿菌刺激奶牛個體，采集牛奶中的細胞，檢測炎性細胞因子轉(zhuǎn)錄水平的變化，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有顯著升高，而在16 h后轉(zhuǎn)錄水平顯著升高 (<0.05)，而后逐漸下降?？傮w上，在LPS刺激的各種實驗?zāi)Ｐ椭校M管炎性細胞因子表達在變化強度和時間上存在差異，但是炎性細胞因子表達水平都會顯著高于其刺激前的轉(zhuǎn)錄水平。本研究結(jié)果也顯示，沒有BPI/BPI714表達時，LPS刺激mHEK293細胞后，、和以及轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄水平均顯著提高，說明LPS可以誘導(dǎo)mHEK293產(chǎn)生炎性細胞因子應(yīng)答。然而，當(dāng)穩(wěn)定表達BPI/BPI714 mHEK293細胞受到相同LPS刺激細胞后，其、和的轉(zhuǎn)錄水平均接近刺激前的轉(zhuǎn)錄水平，都未發(fā)生顯著變化，說明BPI能強烈抑制以上基因的轉(zhuǎn)錄表達。這一結(jié)果與Eckert等[19]和Wittmann等[20]的研究結(jié)果相似，說明不同物種的BPI抗菌機理是相似的。然而，本實驗檢測到表達BPI/BPI714的細胞在LPS刺激后6 h，其中的表達與對照組細胞相比也顯著降低，但該基因在LPS刺激后1 h的轉(zhuǎn)錄表達水平卻比刺激前顯著升高了，提示在LPS誘導(dǎo)的炎性細胞因子應(yīng)答中基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)與和可能不完全相同。此外，不表達BPI/BPI714的細胞經(jīng)LPS刺激后基因轉(zhuǎn)錄水平并沒有顯著提高，而穩(wěn)定表達BPI/BPI714的細胞在LPS刺激后1 h，基因轉(zhuǎn)錄水平卻顯著升高，說明基因在LPS刺激的炎性反應(yīng)中不起主要作用。

本研究分別構(gòu)建了牛BPI和BPI N端編碼序列的表達載體并導(dǎo)入mHEK293細胞中使其成功表達，收集LPS刺激前后不同時間點細胞樣品，利用實時定量RT-PCR方法檢測、、、和基因的表達變化規(guī)律。結(jié)果表明，LPS刺激后，沒有表達BPI/BPI714的細胞中、、、表達水平在不同時間點均顯著提高 (<0.05)，并呈現(xiàn)規(guī)律性變化；而穩(wěn)定表達BPI/BPI714細胞在同樣刺激條件下，、、、基因在LPS刺激前后的轉(zhuǎn)錄水平均沒有顯著變化 (>0.05)。說明在mHKE293細胞模型中，穩(wěn)定表達BPI/BPI714的細胞能強烈抑制LPS介導(dǎo)的炎性細胞因子的表達。該實驗結(jié)果證明了BPI/BPI714均能抑制LPS介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，這為將來研究抗菌蛋白的抗菌效果提供了一種可靠的方法，也為進一步研究其抑菌機制、開發(fā)利用其抑菌功能提供了可靠的實驗依據(jù)。

REFERENCES

[1] Chen XD, Wang SB, Jiang Q, et al. The effect of endotoxins on the levels of cytokines, soluble adhesion molecule, and sFas/sFasL in patients with severe burn. Chin J Emerg Med, 2004, 13(7): 470–473 (in Chinese).陳曉東, 王順賓, 江瓊, 等. 內(nèi)毒素對嚴(yán)重?zé)齻蠹毎蜃印⒖扇苄哉掣椒肿蛹皊Fas/sFasL的影響. 中華急診醫(yī)學(xué)雜志, 2004, 13(7): 470–473.

[2] Lin JP, Bai J, Zhang XM, et al. Association the mutation of 2021 locus of Toll-like receptor 4 gene (TLR4) exon 11 polymorphisms with somatic cell score in Xinjiang brown cattle. J Agr Biotech, 2010, 18(6): 1115–1122 (in Chinese).林嘉鵬, 白杰, 張雪梅, 等. 新疆褐牛Toll樣受體基因(TLR4) 外顯子Ⅲ2021位點突變與奶牛體細胞評分的相關(guān)性研究. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報, 2010, 18(6): 1115–1122.

[3] Tobias PS, Soldau K, Iovine NM, et al. Lipopolysaccharide (LPS)-binding proteins BPI and LBP form different types of complexes with LPS. J Biol Chem, 1997, 272(30): 18682–18685.

[4] Chen J. Research progress of endotoxin inhibitor. World Notes on Antibiotics, 2005, 26(3): 137–141 (in Chinese).陳軍. 內(nèi)毒素抑制劑的研究進展. 國外醫(yī)藥抗生素分冊, 2005, 26(3): 137–141.

[5] Weiss J, Elsbach P, Olsson I, et al. Purification and characterization of a potent bactericidal and membrane active protein from the granules of human polymorphonuclear leukocytes. J Biol Chem, 1978, 253(8): 2664–2672.

[6] Calafat J, Janssen H, Tool A, et al.The bactericidal/permeability-increasing protein (BPI) is present in specific granules of human eosinophils. Blood, 1998, (91): 4770–4775.

[7] Canny G, Levy O, Furuta GT, et al. Lipid mediator-induced expression of bactericidal/ permeability-increasing protein (BPI) in human mucosal epithelia. Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 99(6): 3902–3907.

[8] Reichel PH, Seemann C, Csernok E, et al. Bactericidal/permeability-increasing protein is expressed by human dermal fibroblasts and upregulated by interleukin 4. Clin Diagn Lab Immunol, 2003, 10(3): 473–475.

[9] Peuravuori H, Aho VV, Aho HJ,et alBactericidal/ permeability-increasing protein in lacrimal gland and in tears of healthy subjects. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol, 2006, 244(2): 143–148.

[10] Canny GO, Trifonova RT, Kindelberger DW, et al.Expression and function of bactericidal/permeability increasing protein in human genital tract epithelial cells. J Infect Dis, 2006, 194(4): 498–502.

[11] Bai J. Study of Toll-like receptor 2 & 4 gene structure and function and its correlation with mastitis in bovine [D]. Urumqi: Xinjiang University, 2012 (in Chinese).白杰. Toll樣受體2和4基因結(jié)構(gòu)和功能及其與奶牛乳房炎的相關(guān)性研究[D]. 烏魯木齊: 新疆大學(xué), 2012.

[12] Sauter KS, Brcic M, Franchini M, et al. Stable transduction of bovine TLR4 and bovine MD-2 into LPS-nonresponsive cells and soluble CD14 promote the ability to respond to LPS. Vet Immunol Immunopathol, 2007, 118(1): 92–104.

[13] Liu CX, Wang LQ, Li W, et al. Highly efficient generation of transgenic sheep by lentivirus accompanying the alteration of methylation status. PLoS ONE, 2013, 8(1): e54614.

[14] Hendrik Schultz, Jerrold P. The bactericidal/ permeability-increasing protein (BPI) in infection and inflammatory disease. Clin Chim Acta, 2007, 384(1/2): 12–23.

[15] Yang QF, Chen BL, Zhang QS, et al. Glu216Lys polymorphism of bactericidal/permeability- increasing protein gene has noassociation with inflammatory bowel disease in Chinese Han population. Chin J Pathophysiol,,: 718723(in Chinese).楊慶帆, 陳白莉, 張青森, 等. 殺菌/通透性增加蛋白基因Glu216Lys多態(tài)性與中國漢族人群炎癥性腸病無關(guān). 中國病理生理雜志, 2013, 29(4): 718–723.

[16] Ma Y, Jin XB, Li XB, et al. Optimization of condition for expression of BPI23-haFGF fusion protein in Pichia pastoris. Biotechnology, 2013, 23 (2): 2529 (in Chinese).馬艷, 金小寶, 李小波, 等. BPI23-haFGF融合蛋白在畢赤酵母中表達條件的優(yōu)化. 生物技術(shù), 2013, 23(2): 25–29.

[17] Wu ZC, Wang J, Zhu SP, et al. The partial cSNPs detection of pig BPI gene and its influence on protein structure and function. Acta Vet Zootech Sin, 2013, 44(7): 10001007 (inChinese).,,, 等. 豬BPI基因部分cSNPs檢測及其對蛋白結(jié)構(gòu)功能的影響. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報, 2013, 44(7): 1000–1007.

[18] Xu JJ, Xu J, Wang HT. Gene cloning and expression of human bactericidal/permeability- increasing protein. Acta Microbiol Sin, 2001, 41(6): 669–672 (in Chinese).徐俊杰, 徐靜, 王海濤. 殺菌/通透性增加蛋白基因的克隆及在CHO細胞中的表達. 微生物學(xué)報, 2001, 41(6): 669–672.

[19] Eckert M, Wittmann I, R?llinghoff M, et al. Endotoxin-induced expression of murine bactericidal permeability/increasing protein is mediated exclusively by Toll/IL-1 receptor domain-containing adaptor inducing IFN-β- dependent pathways. J Immunol, 2006, 176(1): 522528.

[20] Wittmann I, Sch?nefeld M, Aichele D, et al. Murine bactericidal/permeability-increasing protein inhibits the endotoxic activity of lipopolysaccharide and gram-negative bacteria. J Immunol, 2008, 180(11): 75467552.

[21] Strandberg Y, Gray C, Vuocolo T, et al. Lipopolysaccharide and lipoteichoic acid induce different innate immune responses in bovine mammary epithelial cells. Cytokine, 2005, 31(1): 72–86.

[22] Hadley JS, Wang JE, Foster SJ, et al. Peptidoglycan ofupregulates monocyte expression of CD14, Toll-like receptor 2 (TLR2), and TLR4 in human blood: possible implications for priming of lipopolysaccharide signaling. Infect Immun, 2005, 73(11): 7613–7619.

[23] Giambartolomei GH, Zwerdling A, Cassataro J, et al. Lipoproteins, not lipopolysaccharide, are the key mediators of the proinflammatory response elicited by heat-killed Brucellaabortus. J Immunol, 2004, 173(7): 46354642.

[24] Lee JW, Bannerman DD, Paape MJ, et al. Characterization of cytokine expression in milk somatic cells during intramammary infections with Escherichia coli or Staphylococcus aureus by real-time PCR. Vet Res, 2006, 37(2): 219–229.

(本文責(zé)編 陳宏宇)

Effects on the expression of lipopolysaccharide-induced inflammatory cytokines mediated by bovine bactericidal/ permeability-increasing protein

Nan Yao1,2,4*, Jie Bai1,3*, Xuemei Zhang1, Ning Zhang1, Weidong Wu2, and Wenrong Li1

1 Key Laboratory of Genetics, Breeding and Reproduction of Grass Feeding Livestock, Ministry of Agriculture, the Key Laboratory of Animal Biotechnological of Xinjiang, Biotechnological Center, Xinjiang Academy of Animal Science, Urumqi 830000, Xinjiang, China 2 Clinical Research Center, Xinjiang People’s Hospital, Urumqi 830000, Xinjiang, China 3 Institurte of Amimal Science of Henan Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou 450002, Henan, China 4 Karamay City People's Hospital, Karamay 834000, Xinjiang, China

Bactericidal/permeability-increasing protein () can bind to and specifically neutralize lipopolysaccharide (LPS) from the outer membrane of Gram-negative bacteria. In order to evaluate potent LPS-neutralizing activity of bovine BPI, the full-length coding sequence (1 449bp) or 714 bp N-terminal coding sequence () of bovine BPI was transfected into mHEK293 cells and the expression of LPS-induced inflammatory cytokines was studied. First, we constructed the lentiviral expression vectors and generated mHEK293 cells stably expressing recombinant bovine BPI or BPI714. Then, we detected the expression of,,,andgenes by real-time PCR at 0, 1, 3, 6, 12, 24, 36 and 48 h post of LPS induction in cells with or without recombinant bovine BPI or BPI714 ectopic expression, respectively. In response to LPS, the robust abundance of inflammatory cytokines including,,andwas observed in wild type mHEK293 cells at eachtime point. On the contrary, mRNA abundance of,and

bactericidal/permeability-increasing protein, lipopolysaccharide, immune respond, inflammatory cytokines

April 4, 2014; Accepted: October 20, 2014

Wenrong Li. Tel: +86-991-4832343; Fax: +86-991-4833671; E-mail: xjlwr@126.com

Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 30860183).

國家自然科學(xué)基金(No. 30860183) 資助。

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2014-11-18

http://www.cnki.net/kcms/doi/10.13345/j.cjb.140207.html

*These authors contributed equally to this study.